Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Gastrointestinal sistem, radyoterapötik kanser tedavileri üzerine yaralanmaya karşı en hassas organlardan biridir. Aynı zamanda, bu tür hakaretleri takiben en yüksek rejeneratif kapasitelerden birine sahip bir organ sistemidir. Sunulan protokol, bağırsak epitelinin rejeneratif kapasitesini incelemek için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.

Özet

Bağırsak epiteli, tek bir hücre katmanından oluşur, ancak bağırsak kriptlerinin dibinde bulunan bağırsak kök hücrelerinin aktif çoğalmasıyla üretilen çok sayıda terminal farklılaşmış hücre türü içerir. Bununla birlikte, akut bağırsak hasarı olayları sırasında, bu aktif bağırsak kök hücreleri hücre ölümüne uğrar. Gama ışınlaması, terapötik olarak etkili olsa da, aktif kök hücre havuzunu tüketmenin yan etkisine sahip olan, yaygın olarak kullanılan bir kolorektal kanser tedavisidir. Gerçekten de, hastalar kısmen aktif kök hücre tükenmesi nedeniyle radyoterapi görürken sıklıkla gastrointestinal radyasyon sendromu yaşarlar. Bağırsak kriptlerindeki aktif bağırsak kök hücrelerinin kaybı, tipik olarak sessiz rezervli bağırsak kök hücrelerinden oluşan bir havuzu aktive eder ve sekretuar ve enterosit öncü hücrelerinin farklılaşmasını indükler. Bu hücreler için olmasaydı, bağırsak epiteli radyoterapi ve diğer büyük doku hakaretlerinden kurtulma yeteneğinden yoksun olurdu. Soy izleme teknolojilerindeki yeni gelişmeler, rejenerasyon sırasında hücrelerin aktivasyonunun, farklılaşmasının ve göçünün izlenmesine izin verir ve bunu bağırsakta incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu çalışma, radyasyon hasarını takiben fare bağırsak epiteli içindeki hücrelerin analizi için bir yöntem göstermeyi amaçlamaktadır.

Giriş

İnsan bağırsak epiteli, tamamen düz1 yerleştirilirse yaklaşık yarım badminton kortunun yüzeyini kaplar. Bunun yerine, insanları bağırsaklarının içeriğinden ayıran bu tek hücre tabakası, bağırsakların yüzey alanını en üst düzeye çıkaran bir dizi parmak benzeri çıkıntı, villus ve girinti, kriptlere sıkıştırılır. Epitelin hücreleri bir kript-villus ekseni boyunca farklılaşır. Villus öncelikle besin emici enterositlerden, mukus salgılayan kadeh hücrelerinden ve hormon üreten enteroendokrin hücrelerden oluşurken, kriptler öncelikle savunma üreten Paneth hücreleri, aktif ve rezerv kök hücreler ve progenitör hücrelerdenoluşur 2,3,4,5. Ayrıca, bu hücrelerin altta yatan mezenkimal kompartmanın stromal ve immün hücreleri ve lümenin mikrobiyotası ile sahip olduğu çift yönlü iletişim, bağırsak homeostazını koruyan ve yaralanma sonrası iyileşme için kritik olan karmaşık bir etkileşim ağı oluşturur 6,7,8.

Bağırsak epiteli, insan vücudunda en hızlı kendini yenileyen dokudur ve 2-6 günlük bir devir hızı 9,10,11'dir. Homeostaz sırasında, lösin bakımından zengin tekrar içeren G-protein eşleşmiş reseptör 5'in (LGR5) ekspresyonu ile işaretlenmiş bağırsak kriptlerinin tabanındaki aktif kök hücreler (kript baz sütunlu hücreler), hızla bölünür ve diğer tüm bağırsak epitel soylarına farklılaşan progenitör hücreler sağlar. Bununla birlikte, yüksek mitotik oranları nedeniyle, aktif kök hücreler ve acil progenitörleri gama radyasyonu hasarına karşı özellikle hassastır ve ışınlama sonrası apoptozauğrarlar 5,12,13,14. Kayıpları üzerine, bağırsak kriptleri içindeki kök hücreleri ve kök olmayan hücreleri (progenitörlerin alt popülasyonu ve bazı terminal olarak farklılaşmış hücreler) aktivasyona uğrar ve bazal kript bölmesini yeniler, bu da daha sonra villusun hücre popülasyonlarını yeniden oluşturabilir ve böylece bağırsak epiteli15'i yenileyebilir. Soy izleme tekniklerini kullanan çok sayıda araştırma grubu, rezerv (sessiz) kök hücrelerin aktif kök hücrelerin kaybı üzerine rejenerasyonu destekleyebildiğini göstermiştir 13,16,17,18,19,20,21,22. Bu hücreler, polycomb kompleks protein 1 onkogen (Bmi1), fare telomeraz ters transkriptaz geni (mTert), Hop homeobox (Hopx) ve lösin bakımından zengin tekrar protein 1 geninin (Lrig1) varlığı ile karakterize edilir. Ek olarak, kök olmayan hücrelerin yaralanma üzerine bağırsak kriptlerini yenileyebildiği gösterilmiştir 23,24,25,26,27,28,29,30,31. Özellikle, salgı hücrelerinin ve enterositlerin progenitörlerinin yaralanma üzerine dediferansiyasyona uğradığı, kök benzeri hücrelere geri döndüğü ve bağırsak epitelinin yenilenmesini desteklediği gösterilmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, yaralanma üzerine kök benzeri özellikler kazanma kapasitesine sahip çoklu belirteçleri eksprese eden hücreleri tanımlamıştır (DLL +, ATOH1 +, PROX1 +, MIST1 +, DCLK1 + gibi)32,33,34,35,36. Şaşırtıcı bir şekilde, Yu ve ark. olgun Paneth hücrelerinin (LYZ +) bile bağırsak yenilenmesine katkıda bulunabileceğini göstermiştir37. Ayrıca, intestinal epitel hücrelerinin apoptozuna neden olmanın ve epitel bariyer fonksiyonunu bozmanın yanı sıra, ışınlama bağırsak florasının disbiyozu, immün hücre aktivasyonu ve pro-inflamatuar yanıtın başlatılması ve mezenkimal ve stromal hücrelerin aktivasyonu ile sonuçlanır38,39.

Gama radyasyonu, kanser tedavisinde, özellikle kolorektal tümörler için değerli bir terapötik araçtır40. Bununla birlikte, ışınlama, hücrelere zarar vererek bağırsak homeostazını önemli ölçüde etkiler ve bu da apoptoza yol açar. Radyasyona maruz kalma, hastanın iyileşmesini yavaşlatan çoklu pertürbasyonlara neden olur ve akut fazda mukozal yaralanma ve iltihaplanma ve ishal, idrar kaçırma, kanama ve uzun vadede karın ağrısı ile işaretlenir. Bu tezahür panoply, gastrointestinal radyasyon toksisitesi olarak adlandırılır. Ek olarak, transmural fibroz ve / veya vasküler sklerozun radyasyona bağlı ilerlemesi ancak tedaviden yıllar sonra ortaya çıkabilir38,41. Yaralanmanın kendisiyle eşzamanlı olarak, radyasyon bağırsak hücrelerinde rejenerasyonu başlatmaktan ve düzenlemekten sorumlu sinyal yollarını aktive eden bir onarım tepkisi indükler42. Radyasyona bağlı ince bağırsak hastalığı, diğer organlara (serviks, prostat, pankreas, rektum gibi) verilen pelvik veya abdominal radyoterapiden kaynaklanabilir41,43,44,45,46. Bu nedenle intestinal ışınlama hasarı önemli bir klinik konudur ve ortaya çıkan patofizyolojinin daha iyi anlaşılması, radyoterapi ile ilişkili gastrointestinal komplikasyonları hafifletmek için müdahalelerin geliştirilmesini ilerletebilir. Bağırsak epitelinin rejeneratif amacını radyasyondan ayrı olarak araştırmaya izin veren başka teknikler de vardır. Enflamasyonu ve daha sonra rejenerasyonu incelemek için transgenik ve kimyasal murin modelleri geliştirilmiştir47. Dekstran sodyum sülfat (DSS) bağırsakta iltihaplanmaya neden olur ve enflamatuar bağırsak hastalığınınkine benzer özelliklerin gelişmesine yol açar48. DSS tedavisinin pro-kanserojen bileşik azoksimetan (AOM) ile kombinasyonu, kolit ile ilişkili kanserin gelişmesine neden olabilir48,49. İskemi reperfüzyonuna bağlı yaralanma, bağırsak epitelinin rejeneratif potansiyelini incelemek için kullanılan başka bir yöntemdir. Bu teknik tecrübe ve cerrahi bilgi gerektirir50. Ayrıca, yukarıda belirtilen teknikler radyasyondan farklı yaralanma türlerine neden olur ve farklı rejenerasyon mekanizmalarının dahil olmasına neden olabilir. Ek olarak, bu modeller zaman alıcıdır, radyasyon tekniği ise oldukça kısadır. Son zamanlarda, bağırsak ve kolondan üretilen enteroidleri ve kolonoidleri kullanan in vitro yöntemler, bağırsak rejenerasyon mekanizmalarını incelemek için radyasyon hasarı ile birlikte kullanılmıştır51,52. Bununla birlikte, bu teknikler modelledikleri organı tam olarak özetlemez53,54.

Sunulan protokol, tamoksifen tedavisini takiben, rezerv kök hücre popülasyonundan (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Bu model, rezerv kök hücreleri aktive etmek için yeterince önemli bağırsak hasarına neden olan 12 Gy toplam vücut ışınlamasını kullanırken, yaralanmadan sonraki 7 gün içinde bağırsak rejeneratif kapasitesinin daha sonra araştırılmasına izin verir55.

Protokol

Tüm fareler, Stony Brook Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Bölümü'nde (DLAR) barındırıldı. Stony Brook Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC), hayvan denekleri içeren tüm çalışmaları ve prosedürleri onayladı. Hayvan denekleri içeren deneyler kesinlikle onaylanmış hayvan işleme protokolüne (IACUC #245094) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

NOT: Fare suşları B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-CreER) ve B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) ticari olarak elde edilmiştir (bkz. Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) fareleri, daha önce açıklandığı gibi56,57,58.

1. Bmi1-Cre ER'nin Konutu; Rosa26 eYFP fareleri

  1. Fareleri bir hayvan tesisinde 68-72 ° F arasında değişen bir sıcaklıkta ve% 30-70 arasında değişen nemde, 12 saat / 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde, su ve normal chow ad libitum ile tutun.
  2. Deneylerden önce, standart bir PCR genotipleme tekniği57,58 kullanarak farelerin genotiplerini doğrulayın.

2. Hayvanların ve malzemelerin hazırlanması

  1. Farelerin iklimlendirilmesine izin vermek için herhangi bir deneyden en az 7 gün önce fareleri deney barınağı odasına aktarın.
  2. Deney hayvanlarını cinsiyete ve yaşa göre eşleştirin ve kontrol edin.
  3. Kontrol hayvanlarını tamoksifen kaynaklı Cre aracılı rekombinasyona tabi tutun, ancak ışınlamaya (sahte tedavi, 0 Gy) maruz bırakmazken, deney hayvanlarının tamoksifen enjeksiyonunu almasını ve gama ışınlamasına maruz kalmasını sağlayın.
  4. Tamoksifen çözeltisini hazırlayın. Tamoksifen tozunu steril mısır yağında 30 mg / mL'lik bir konsantrasyonda tekrar askıya alın. % 30 genlik ile 30 s AÇIK ve 30 s KAPALI döngülerinde 60 dakika boyunca sonikasyon yapın ve daha sonra oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca karanlıkta döndürün. Tamoksifen çözeltisi -20 ° C'de dondurulabilir, ancak bir kereden fazla dondurmayın / çözmeyin. Tercihen, her seferinde taze bir çözelti hazırlayın ve saklamayın.
    NOT: Tamoksifen ışığa duyarlıdır. Oda sıcaklığı dönüşü sırasında teneke folyo ile sarın.
    DİKKAT: Tamoksifen potansiyel olarak tehlikeli bir maddedir: Sağlık Tehlikesi (GHS08) ve Çevre Tehlikesi (GHS09).
  5. 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) stok çözeltisi hazırlayın. EdU tozunu toplam steril dimetil sülfoksit (DMSO) hacminin 1 / 5'inde tekrar askıya alın ve toplam steril ultra saf su hacminin kalan 4 / 5'ini yavaşça ekleyin. Tamamen çözündüğünde, aliquot ve -20 ° C'de saklayın.
    DİKKAT: 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) ve dimetil sülfoksit (DMSO) potansiyel olarak tehlikeli maddelerdir: Sağlık Tehlikesi (sırasıyla H340 ve H631 ve H227, H315 ve H319). EdU genetik kusurlara neden olabilir ve doğurganlığa veya doğmamış çocuklara zarar verdiğinden şüphelenilir ve DMSO cilt ve göz tahrişine neden olabilir.
  6. Doku toplama ve fiksasyon için reaktifler hazırlayın:% 70'lik bir su çözeltisi hazırlamak için etanol seyreltin, DPBS'yi 4 ° C'ye soğutun ve modifiye Bouin'in fiksatif tamponunu (damıtılmışH2O'da% 50 etanol ve% 5 asetik asit) ve% 10 tamponlanmış formalin hazırlayın.
    DİKKAT: Etil alkol potansiyel olarak tehlikeli bir maddedir: Sağlık Tehlikesi (H225-H319), yanıcı (GHS02) ve akut toksisiteye (GHS07) neden olur. Asetik asit potansiyel olarak tehlikeli bir maddedir: Sağlık Tehlikesi (H226-H314), yanıcı (GHS02) ve aşındırıcı (GHS05). Formalin potansiyel olarak tehlikeli bir maddedir: Sağlık Tehlikesi (H350, H315, H317, H318, H370) ve aşındırıcı. Formalin kansere, cilt ve göz tahrişine, organlara zarar verebilir ve alerjik cilt reaksiyonlarına neden olabilir.
  7. Ötanazi için gerekli ekipmanı onaylanmış bir yönteme (örneğin CO2 odası), bir fare diseksiyon kitine (makas, forseps), Petri kaplarına, bağırsakları yıkamak için 10 mL'lik bir şırıngaya tutturulmuş 16 G gavage iğnesine ve histolojik kasetlere göre hazırlayın.

3. Toplam vücut gama ışınlaması (TBI) ve doku toplama

  1. Gama ışınlamasına maruz kalmadan iki gün önce, Cre aracılı rekombinasyon ve BMI1 / EYFP + hücre linaj izlemesini indüklemek için deney hayvanlarına tek doz tamoksifen enjekte edin. Her hayvanı tartın ve mısır yağında yeniden askıya alınmış 40 mg / kg vücut ağırlığı dozunu hesaplayın. Karın bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin ve 1 mL'lik bir şırıngaya bağlı 27G iğne kullanarak tamoksifeni intraperitoneal olarak uygulayın.
  2. Potansiyel tamoksifen toksisitesini dışlamak için hayvanları aşağıdaki 48 saat boyunca gözlemleyin.
  3. Fareleri yerel kurum tarafından belirtilen ışınlama odasına aktarın.
  4. Mevcut eksaktör doz oranına göre 137Cs kaynağı tarafından salınan ışınlamaya maruz kalma süresini hesaplayın. Örneğin, mevcut doz hızı 75.9 rad / dak'ya eşitse (0.759 Gy min-1 = 75.9 cGy m-1), dakika cinsinden maruz kalma süresi istenen doz / 0.759 olarak hesaplanır. Hayvanları 12 Gy TBI dozuna ışınlamak için, maruz kalma süresi ~ 15.81 dakikadır (15 dakika ve 48 sn).
  5. Gama ışınlayıcısındaki numune odasını% 70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin; Emici paspası ve hayvanları numune odasının içine yerleştirin.
    NOT: Sahte muamele görmüş hayvanlar ışınlama odasına yerleştirilmeli, ancak gama ışınlamasına maruz bırakılmamalıdır.
  6. Kapağı yerleştirin ve odayı kapatın.
  7. Gama ışınlayıcısını hayvanları 12 Gy TBI'ye maruz bırakacak şekilde programlayın.
    1. Anahtarı BAŞLANGIÇ konumuna getirerek makineyi açın.
    2. Sayısal klavye kullanarak operatör numarasını girin ve ENTER tuşuna basarak onaylayın.
    3. Sayısal klavye kullanarak PIN numarasını girin ve ENTER tuşuna basarak onaylayın.
    4. Seçenekler için 1'e basın.
    5. Zamanlayıcı ayarları için 1'e basın.
    6. Işınlama süresi için 1'e basın.
    7. Sayısal klavye (ss:dd:ss biçimi) kullanarak bir sonraki döngü için zamanlayıcı ayarını girin ve ENTER tuşuna basarak onaylayın.
    8. ENTER tuşuna basarak ayarları bir kez daha onaylayın.
    9. CLEAR 2x tuşuna basarak ana menüye geri dönün.
    10. Pozlamayı başlatmak için BAŞLAT'a basın.
  8. Odayı aktif maruz kalma süresi için bırakın. Önceden ayarlanmış süre geçtikten sonra makine otomatik olarak durur ve bip sesi çıkarmaya başlar.
    DİKKAT: Sezyum-137 (137Cs) ölümcül tehlikeli bir maddedir (Sağlık Tehlikesi: H314). Büyük miktarlarda 137C'ye harici maruz kalma yanıklara, akut radyasyon hastalığına ve hatta ölüme neden olabilir.
  9. Anahtarı STOP konumuna getirerek makineyi kapatın.
  10. Numune haznesini açın, kapağı çıkarın, hayvanları tekrar kafese aktarın ve numune odasını% 70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin.
  11. Hayvanları geleneksel barınma odasına geri aktarın ve tedavi sonrası durumlarını gözlemleyin.
  12. Hayvanların ağırlığını her gün izleyin ve başlangıç vücut ağırlığının% 15'ini aşan herhangi bir değişmiş refah, sıkıntı veya kilo kaybı belirtisi gözlenirse derhal ötenazi yapın (planlanan zaman noktasına rağmen).
  13. Planlanan ötenaziden üç saat önce karın bölgesini dezenfekte edin ve 28G insülin şırıngası kullanarak, farelere 100 μL EdU stok çözeltisi (intraperitoneal olarak uygulanır) enjekte edin.
  14. Proksimal bağırsakları ışınlama sonrası 0 saat, 3 saat, 6 saat, 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat ve 168 saatte toplayın.
    1. CO2 ötenazisini ev kurumunun standartlarına göre gerçekleştirin.
      DİKKAT: Karbondioksit tehlikeli bir maddedir (H280). Basınç altında gaz içerir; ısıtılırsa patlayabilir. Oksijenin yerini alabilir ve hızlı boğulmaya neden olabilir.
    2. Daha sonra, ince bağırsağın proksimal kısmını diseke edin, bağlı dokuları çıkarın, 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı 16 G düz besleme iğnesi kullanarak soğuk DPBS ile yıkayın, 10 mL'lik bir şırıngaya bağlı 16 G düz besleme iğnesi kullanarak modifiye Bouin'in fiksatif tamponu ile sabitleyin, uzunlamasına kesin ve proksimal bağırsakları daha önce tarif edildiği gibi swiss-roll tekniğini kullanarak yuvarlayın59.
  15. Dokuları histolojik bir kasete yerleştirin ve% 10 tamponlu formalin içeren bir kapta oda sıcaklığında 24-48 saat bekletin. Formalinin hacmi, histolojik kasetleri tamamen örtmek için yeterli olmalıdır. Kuluçka süresi geçtiğinde, forseps kullanarak, histolojik kasetleri% 70 etanol ile doldurulmuş kaba aktarın. Ardından, doku parafin gömme işlemine devam edin.
    NOT: Doku parafin gömme işlemi Stony Brook Üniversitesi Araştırma Histolojisi Çekirdek Laboratuvarı tarafından gerçekleştirilmiştir. Prosedür burada durdurulabilir ve parafin blokları oda sıcaklığında saklanabilir.
    DİKKAT: Formalin potansiyel olarak tehlikeli bir maddedir: Sağlık Tehlikesi (H350, H315, H317, H318, H370) ve aşındırıcı. Formalin kansere, cilt ve göz tahrişine, organlara zarar verebilir ve alerjik cilt reaksiyonlarına neden olabilir.

4. Histolojik analiz

  1. Parafin gömülü doku örneklerini içeren histolojik kasetleri en az 1 saat boyunca buz üzerine yerleştirerek soğutun. Bir mikrotom kullanarak, boyama için 5 μm kalınlığında bölümler hazırlayın. Her doku, haddelenmiş numunenin tamamını kapsayacak şekilde yatay olarak dilimlenmelidir.
    1. Parafin bloğunu kestikten sonra, doku bölümlerini 45 ° C'ye kadar ısıtılmış bir su banyosuna aktarın ve bölümleri yüklü slaytlara yerleştirin. Slaytları kuruması için gece boyunca oda sıcaklığında bir rafta bırakın.
      NOT: Prosedür burada durdurulabilir ve slaytlar oda sıcaklığında saklanabilir.
  2. Slaytları bir slayt tutucuya yerleştirin ve gece boyunca 65 ° C'lik bir fırında pişirin. Slaytlar daha kısa bir süre, 1-2 saat pişirilebilir. Bununla birlikte, taze (1 aydan daha az) kesilmiş slaytlar durumunda bu tavsiye edilmez.
    NOT: Manuel slayt boyama setini kimyasal başlığın altına yerleştirin ve inkübasyonları kimyasal başlığın altında ksilen, etanol ve hematoksilin ile gerçekleştirin.
  3. Ertesi gün, slaytları kimyasal başlığın altındaki bir slayt tutucusuna 10 dakika boyunca yerleştirerek soğutun.
  4. Sürgü tutucuyu 3 dakika boyunca% 100 ksilen ile doldurulmuş bir kaba yerleştirerek dokuları deparaffine edin. Taze% 100 ksilen kullanarak inkübasyonu tekrarlayın.
    NOT: O andan itibaren, numunelerin her zaman ıslak tutulduğundan emin olun.
    DİKKAT: Ksilen potansiyel olarak tehlikeli bir maddedir: yanıcı (GHS02), akut toksisiteye (GHS07) ve Sağlık tehlikesine neden olur (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). Potansiyel tehlikeli etkiler, yutulması veya hava yollarına girmesi durumunda ölümcül olması ve cilt, göz ve solunum tahrişine neden olabilmesidir. Ek olarak, uyuşukluğa veya baş dönmesine neden olarak motor fonksiyonları etkileyebilir ve uzun süreli veya tekrarlanan maruz kalma durumunda organ hasarına neden olabilir.
  5. Sürgülü tutucuyu aşağıdaki çözeltilerle doldurulmuş kaplara sırayla yerleştirerek bir etanol gradyanındaki bölümleri rehidrate edin:% 100 etanol, 2 dakika; % 95 etanol, 2 dakika; %70 etanol, 2 dk.
  6. Sürgü tutucuyu damıtılmış suyla doldurulmuş kaba aktarın ve akan damıtılmış suda 2 dakika durulayın.
  7. Sürgü tutucuyu hematoksilin çözeltisi ile doldurulmuş bir kaba yerleştirin ve 5 dakika boyunca lekeleyin (kimyasal kaputun altında).
  8. Sürgü tutucuyu musluk suyuyla doldurulmuş kaba aktarın ve hematoksilin lekelenmesi mavimsi hale gelene kadar, tipik olarak 2 dakika sonra akan musluk suyunda durulayın.
  9. Sürgü tutucuyu %5 (w/v) lityum karbonat çözeltisi ile doldurulmuş kaba aktarın. 10x daldırın.
    DİKKAT: Lityum karbonat potansiyel olarak tehlikeli bir maddedir: akut toksisiteye (GHS07) ve Sağlık Tehlikesine (H302 - H319) neden olur. Yutulması halinde zararlıdır, ciltle temasında zararlıdır ve ciddi göz tahrişine neden olur.
  10. Sürgü tutucuyu damıtılmış suyla doldurulmuş kaba aktarın ve akan damıtılmış suda 2 dakika durulayın.
  11. Sürgü tutucuyu eozin ve leke ile dolu bir kaba yerleştirin ve 5 dakika boyunca lekeleyin.
  12. Sürgü tutucuyu %70 etanol ile doldurulmuş kaba aktarın ve kısa bir süre (10 sn) durulayın.
  13. Sürgü tutucuyu etanol gradyan çözeltileri ile doldurulmuş kaplara sırayla yerleştirerek bölümleri kurutun:% 95 etanol, 5 daldırma; % 100 etanol, 5 daldırma.
  14. Slayt tutucuyu 3 dakika boyunca% 100 ksilen ile doldurulmuş kaba yerleştirerek slaytları temizleyin. Taze% 100 ksilen kullanarak inkübasyonu tekrarlayın.
  15. Slaytı raftan çıkarın, bir kağıt havlu kullanarak dokuların etrafındaki alanı kurutun ve numunenin boyutuna bağlı olarak, numunenin yüzeyine bir damla veya iki damla ksilen bazlı montaj ortamı ekleyin. Cam sürgüsünün üzerine yavaşça bir kapak kayması yerleştirerek monte edin (hava kabarcığı bırakmamaya dikkat edin). Gerekirse hafifçe bastırın. Camın tüm yüzeyi örtülmeli ve kapatılmalıdır.
  16. Slaytları gece boyunca kimyasal başlığın altında bırakarak kurutun. Tipik olarak, montaj ortamı 24 saatten daha kısa sürede katılaşır. Slaytların kuru olduğundan emin olmak için örnek bir slayt yapılabilir. Boş bir slayt kullanarak, montaj ortamının bir damlasını yerleştirin ve gece boyunca kimyasal kaputun altında bırakın. Ertesi gün, damlaya dokunun ve katılaşıp katılaşmadığını kontrol edin.
  17. Slaytlar kuruduğunda, dokuların histolojisini bir ışık mikroskobu veya parlak alan kanalına sahip daha gelişmiş bir mikroskop kullanarak analiz edin.
    1. Sahneye bir mikroskop slaytı yerleştirin, örnek görüş alanının merkezine gelene kadar hareket ettirin, odak düğmesini kullanarak odağı ayarlayın ve histolojiyi kontrol dokularına kıyasla analiz etmek için 10x ve / veya 20x büyütme objektif lensi kullanın (sahte ışınlanmış).
    2. Mikroskop bir kamera ile donatılmışsa, görüntüleri de çekin.
      NOT: Prosedür burada durdurulabilir; Slaytlar oda sıcaklığında saklanabilir ve daha sonra analiz edilebilir. Lekelenme yavaşça kaybolduğu için slaytları 30 günden daha uzun süre tutmayın.

5. İmmünofloresan boyama

  1. Parafin gömülü doku örnekleri içeren histolojik kasetleri en az 1 saat boyunca buz üzerine koyarak soğutun. Bir mikrotom kullanarak, boyama için 5 μm kalınlığında bölümler hazırlayın. Her doku, haddelenmiş numunenin tamamını kapsayacak şekilde yatay olarak dilimlenmelidir.
    1. Parafin bloğunu kestikten sonra, doku bölümlerini 45 ° C'ye ısıtılmış bir su banyosuna aktarın ve bölümleri yüklü slaytlara yerleştirin. Slaytları kuruması için gece boyunca oda sıcaklığında bir rafta bırakın.
      NOT: Prosedür burada durdurulabilir ve slaytlar oda sıcaklığında saklanabilir.
  2. Slaytları bir slayt tutucuya yerleştirin ve gece boyunca 65 ° C'lik bir fırında pişirin. Slaytlar daha kısa bir süre, 1-2 saat pişirilebilir. Bununla birlikte, taze (1 aydan daha kısa bir süre önce) kesilmiş slaytlar durumunda bu tavsiye edilmez.
    NOT: Manuel slayt boyama setini kimyasal başlığın altına yerleştirin ve inkübasyonları kimyasal başlığın altında ksilen, etanol ve H2O2/ metanol ile gerçekleştirin.
  3. Ertesi gün, slaytları kimyasal başlığın altındaki bir slayt tutucusuna 10 dakika boyunca yerleştirerek soğutun.
  4. Sürgü tutucuyu 3 dakika boyunca% 100 ksilen ile doldurulmuş bir kaba yerleştirerek dokuları deparaffine edin. Taze% 100 ksilen kullanarak inkübasyonu tekrarlayın.
    NOT: O andan itibaren, numunelerin her zaman ıslak tutulduğundan emin olun.
  5. Slaytları kimyasal başlık altında% 2 hidrojen peroksit çözeltisi içinde% 2 hidrojen peroksit çözeltisi ile doldurulmuş bir kapta 30 dakika boyunca inkübe ederek endojen peroksidazı söndürün.
    DİKKAT: Metil alkol potansiyel olarak tehlikeli bir maddedir: Sağlık Tehlikesi (H225-H301, H311, H331-H370), yanıcı (GHS02) ve akut toksisiteye (oral, dermal, soluma) neden olur (GHS08). Hidrojen peroksit potansiyel olarak tehlikeli bir maddedir: aşındırıcı (GHS05) ve akut toksisiteye (GHS07) neden olur.
  6. Sürgülü tutucuyu aşağıdaki çözeltilerle doldurulmuş kaplara sırayla yerleştirerek bölümleri bir etanol gradyanındaki rehidrate edin:% 100 etanol, 3 dakika; % 95 etanol, 3 dakika; %70 etanol, 3 dk.
  7. Sürgü tutucuyu damıtılmış suyla dolu bir kaba aktarın ve 2 dakika boyunca damıtılmış suda durulayın.
  8. Antijenleri almak için, sürgü tutucuyu 250 mL sitrat tampon çözeltisi (10 mM sodyum sitrat,% 0.05 Ara-20, pH 6.0) içeren bir kaba aktarın ve bir açma odası kullanarak 10 dakika boyunca 110 ° C'de pişirin.
  9. Tüm kabı soğuk odaya aktarın ve 30 dakika boyunca kademeli olarak soğumaya bırakın.
  10. 30 dakika sonra, sitrat tampon çözeltisini damıtılmış suyla değiştirin ve tüm yüzen parafin parçaları çıkarılana kadar akan damıtılmış suda durulayın.
  11. Slaytları tutucudan çıkarın (birer birer birer tane), bir kağıt havluya dokunun ve numunenin etrafındaki alanı bir kağıt havluyla dikkatlice kurulayın. Hidrofobik bariyer (PAP kalemi) sağlayan bir kalem kullanarak numunenin etrafına kapalı bir şekil çizin. Nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin.
  12. Bir numunenin yüzeyine 200 μL çözelti ekleyerek TBS-Ara'da% 5 sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin. Sızıntı olmadığından emin olun. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir odada 30 dakika boyunca inkübe edin.
  13. Bir kağıt havlu üzerindeki cam sürgüye dokunarak blokaj solüsyonunu çıkarın. Nemlendirilmiş bir odaya geri yerleştirin. Bir bloke edici tamponda yeniden askıya alınan birincil antikorların uygun konsantrasyonundan 100 μL ekleyin ve gece boyunca hafifçe sallanarak 4 ° C'de inkübe edin. BMI1 / EYFP için, tavuk anti-GFP (seyreltme 1:500) kullanın; Ki-67 için, tavşan anti-Ki-67 kullanın (seyreltme 1:200).
  14. Bir kağıt havlu üzerindeki cam slayta dokunarak antikor çözeltisini çıkarın; Slaytları bir slayt tutucusuna yerleştirin ve TBS-Ara ile doldurulmuş kaba aktarın. Slaytları 5 dakika boyunca sallayarak yıkayın. Her seferinde, TBS-Tween arabelleğinin yeni bir bölümünü kullanın.
  15. Slaytları tutucudan çıkarın (birer birer tane), cam slaytı bir kağıt havluya dokundurarak fazla yıkama solüsyonunu çıkarın ve nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. Bir bloke edici tamponda yeniden askıya alınan uygun sekonder antikor konsantrasyonundan 100 μL ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. İkincil antikorlar bir florofor ile konjuge edilmelidir. BMI1 / EYFP için, eşek tavuk karşıtı Alexa Fluor 647 (seyreltme 1:500) kullanın; Ki-67 için, keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488 (seyreltme 1:500) kullanın.
  16. Bir kağıt havlu üzerindeki cam slayta dokunarak antikor çözeltisini çıkarın; Slaytları bir slayt tutucusuna yerleştirin ve TBS-Ara ile doldurulmuş kaba aktarın. Slaytları 5 dakika boyunca sallayarak yıkayın. Her seferinde, TBS-Tween arabelleğinin yeni bir bölümünü kullanın.
  17. Slaytları tutucudan çıkarın (birer birer tane), cam slaytı bir kağıt havluya dokundurarak fazla yıkama solüsyonunu çıkarın ve nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. Üreticinin talimatlarına göre hazırlanan ve Alexa Fluor 555 florofor kullanılarak hazırlanan 100 μL EdU boyama çözeltisini ekleyin.
  18. Bir kağıt havlu üzerindeki cam slayta dokunarak EdU çözeltisini çıkarın; Slaytları bir slayt tutucusuna yerleştirin ve TBS-Ara ile doldurulmuş kaba aktarın. Slaytları 5 dakika boyunca sallayarak yıkayın. 2x tekrarlayın. Her seferinde, TBS-Tween arabelleğinin yeni bir bölümünü kullanın.
  19. Slaytları tutucudan çıkarın (birer birer birer tane); Bir kağıt havlu üzerindeki cam sürgüye dokunarak fazla yıkama solüsyonunu çıkarın ve nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. Numunenin yüzeyine Hoechst 33258 çözeltisinden 100 μL (TBS-Ara'da seyreltme 1:1000) ekleyerek Hoechst 33258 karşı boyama işlemini gerçekleştirin. Karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  20. Hoechst 33258 çözeltisini, bir kağıt havlu üzerindeki cam slayta dokunarak çıkarın; Slaytları bir slayt tutucuya yerleştirin ve TBS-Arayla dolu bir kaba aktarın. Slaytları 5 dakika çalkalayarak yıkayın.
  21. Slaytı slayt tutucusundan çıkarın, dokuların etrafındaki alanı bir kağıt havlu kullanarak kurutun ve numunenin boyutuna bağlı olarak, numunenin yüzeyine bir damla veya iki su bazlı montaj ortamı ekleyin. Cam sürgüsünün üzerine yavaşça bir kapak kayması yerleştirerek monte edin (hava kabarcığı bırakmamaya dikkat edin). Gerekirse hafifçe bastırın. Camın tüm yüzeyi örtülmeli ve kapatılmalıdır.
  22. Slaytları gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bırakarak kurutun. Tipik olarak, montaj ortamı 24 saatten daha kısa sürede katılaşır. Slaytların kuru olduğundan emin olmak için örnek bir slayt yapılabilir. Boş bir slayt kullanın; Montaj ortamından bir damla yerleştirin ve gece boyunca kimyasal kaputun altında bırakın. Ertesi gün, damlaya dokunun ve katılaşıp katılaşmadığını kontrol edin.
  23. Slaytlar kuruduğunda, lekeli dokular, Ki-67, EdU ve BMI1 / EYFP boyamasının (sırasıyla 535 nm, 646 nm ve 700 nm) görselleştirilmesine izin veren emisyon dalga boyu filtreleriyle donatılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak analiz edilebilir.
  24. Sahneye bir mikroskop slaytı yerleştirin, örnek görüş alanının ortasına gelene kadar hareket ettirin, odak düğmesini kullanarak odağı ayarlayın ve boyamayı kontrol dokularına kıyasla analiz etmek için 10x ve / veya 20x büyütme objektif lensini kullanın (sahte ışınlanmış). Mikroskop bir kamera ile donatılmışsa, görüntüler de alınabilir. Her kanal için ayrı ayrı görüntü alın ve daha sonra birleştirin.
    NOT: Prosedür burada durdurulabilir; slaytlar 4 °C'de saklanabilir ve daha sonra analiz edilebilir. Lekelenme yavaşça kaybolduğu için slaytları 14 günden uzun süre tutmayın.

6. TÜNEL boyama

  1. Parafin gömülü doku örnekleri içeren histolojik kasetleri en az 1 saat boyunca buz üzerine koyarak soğutun. Bir mikrotom kullanarak, boyama için 5 μm kalınlığında bölümler hazırlayın. Her doku, haddelenmiş numunenin tamamını kapsayacak şekilde yatay olarak dilimlenmelidir.
    1. Parafin bloğunu kestikten sonra, doku bölümlerini 45 ° C'ye kadar ısıtılmış bir su banyosuna aktarın ve bölümleri yüklü slaytlara yerleştirin. Slaytları kuruması için gece boyunca oda sıcaklığında bir rafta bırakın.
      NOT: Prosedür burada durdurulabilir ve slaytlar oda sıcaklığında saklanabilir.
  2. Slaytları bir slayt tutucuya yerleştirin ve gece boyunca 65 ° C'lik bir fırında pişirin.
    NOT: Slaytlar 1-2 saat daha kısa sürede pişirilebilir. Bununla birlikte, taze (1 aydan daha kısa bir süre önce) kesilmiş slaytlar durumunda tavsiye edilmez. Manuel slayt boyama setini kimyasal başlığın altına yerleştirin ve inkübasyonları kimyasal başlığın altında ksilen ve etanol ile gerçekleştirin.
  3. Ertesi gün, slaytları kimyasal başlığın altındaki bir slayt tutucusuna 10 dakika boyunca yerleştirerek soğutun.
  4. Slayt tutucuyu 3 dakika boyunca% 100 ksilen ile doldurulmuş bir kaba yerleştirerek dokuları deparaffine edin. Taze% 100 ksilen kullanarak inkübasyonu tekrarlayın.
    NOT: Bu noktadan itibaren, numunelerin her zaman ıslak tutulduğundan emin olun.
  5. Slayt tutucuyu aşağıdaki çözeltilerle doldurulmuş kaplara sırayla yerleştirerek bölümleri bir etanol gradyanı içinde yeniden sulandırın:% 100 etanol, 3 dakika; % 95 etanol, 3 dakika; % 90 etanol, 3 dakika; %80 etanol, 3 dk; %70 etanol, 3 dk.
  6. Sürgü tutucuyu damıtılmış suyla dolu bir kaba aktarın ve akan damıtılmış suda 1 dakika durulayın.
  7. Slaytları tutucudan çıkarın (birer birer birer tane), bir kağıt havluya dokunun ve numunenin etrafındaki alanı bir kağıt havluyla dikkatlice kurulayın. Hidrofobik bariyer (PAP kalemi) sağlayan bir kalem kullanarak numunenin etrafına kapalı bir şekil çizin. Nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin.
  8. DNaz içermeyen proteinaz K ile inkübe edin. hidrofobik bariyer içindeki numunenin yüzeyine DNaz içermeyen proteinaz K çözeltisinden 100 μL (DPBS'de seyreltme 1:25) ekleyin. Oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 15 dakika boyunca inkübe edin.
    DİKKAT: Proteinaz K potansiyel olarak tehlikeli bir maddedir: Sağlık Tehlikesi (H315 - H319 - H334).
  9. Bir kağıt havlu üzerindeki cam slayta dokunarak proteinaz K çözeltisini çıkarın; slaytları bir slayt tutucuya yerleştirin ve DPBS ile doldurulmuş kaba aktarın. Slaytları 5 dakika boyunca sallayarak yıkayın. 2x tekrarlayın. Her seferinde DPBS'nin yeni bir bölümünü kullanın.
  10. TUNEL reaksiyon karışımını hazırlayın: Etiket çözeltisini (1x) enzim çözeltisi (10x) ile karıştırın. İyi pipetleyin.
  11. Slaytları tutucudan çıkarın (birer birer birer tane); Bir kağıt havlu üzerindeki cam sürgüye dokunarak fazla yıkama solüsyonunu çıkarın ve nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. Numunenin yüzeyine 50 μL TUNEL reaksiyon karışımı ekleyin ve karanlıkta 37 ° C'de nemlendirilmiş bir odada 60 dakika boyunca inkübe edin. Negatif bir kontrol için, yalnızca etiket solüsyonunu kullanın (TdT olmadan).
  12. Bir kağıt havlu üzerindeki cam slayta dokunarak TUNEL çözeltisini çıkarın; slaytları bir slayt tutucusuna yerleştirin ve DPBS ile dolu bir kaba aktarın. Slaytları 5 dakika boyunca sallayarak yıkayın. 2x tekrarlayın. Her seferinde DPBS'nin yeni bir bölümünü kullanın.
  13. Slaytları tutucudan çıkarın (birer birer birer tane); Bir kağıt havlu üzerindeki cam sürgüye dokunarak fazla yıkama solüsyonunu çıkarın ve nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. Numunenin yüzeyine Hoechst 33258 çözeltisinden 100 μL (TBS-Ara'da seyreltme 1:1000) ekleyerek Hoechst 33258 karşı boyama işlemini gerçekleştirin. Karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  14. Bir kağıt havlu üzerindeki cam slayta dokunarak Hoechst 33258 çözeltisini çıkarın; slaytları bir slayt tutucuya yerleştirin ve DPBS ile doldurulmuş kaba aktarın. Slaytları 5 dakika çalkalayarak yıkayın.
  15. Slaytı slayt tutucusundan çıkarın; Dokuların etrafındaki alanı bir kağıt havlu kullanarak kurutun ve numunenin boyutuna bağlı olarak, numunenin yüzeyine bir damla veya iki su bazlı montaj ortamı ekleyin. Cam sürgüsünün üzerine yavaşça bir kapak kayması yerleştirerek monte edin (hava kabarcığı bırakmamaya dikkat edin). Gerekirse hafifçe bastırın. Camın tüm yüzeyi örtülmeli ve kapatılmalıdır.
  16. Slaytları gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bırakarak kurutun. Tipik olarak, montaj ortamı 24 saatten daha kısa sürede katılaşır. Slaytların kuru olduğundan emin olmak için örnek bir slayt yapılabilir. Montaj ortamından bir damla yerleştirin ve gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bırakın. Ertesi gün, damlaya dokunun ve katılaşıp katılaşmadığını kontrol edin.
  17. Slaytlar kuruduğunda, lekeli dokular, TÜNEL boyamasının (535 nm) görselleştirilmesini sağlayan emisyon dalga boyu filtreleri ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak analiz edilebilir.
  18. Sahneye bir mikroskop slaytı yerleştirin, örnek görüş alanının ortasına gelene kadar hareket ettirin, odak düğmesini kullanarak odağı ayarlayın ve boyamayı kontrol dokularına kıyasla analiz etmek için 10x ve / veya 20x büyütme objektif lensi kullanın (sahte ışınlanmış). Mikroskop bir kamera ile donatılmışsa, görüntüler de alınabilir. Her kanal için ayrı ayrı görüntü alın ve daha sonra birleştirin.
    NOT: Prosedür burada durdurulabilir; slaytlar 4 °C'de saklanabilir ve daha sonra analiz edilebilir. Lekelenme yavaşça kaybolduğu için slaytları 14 günden uzun süre tutmayın.

Sonuçlar

Murin genetik soy takibi ile kombinasyon halinde 12 Gy toplam vücut ışınlamasının (TBI) kullanılması, bağırsaktaki radyasyon hasarının sonuçlarının kapsamlı bir analizine izin verir. Başlamak için, Bmi1-CreER; Rosa26eYFP fareleri, bir Bmi1 + rezerv kök hücre popülasyonunda gelişmiş sarı floresan protein (EYFP) ekspresyonunu indükleyen tek bir tamoksifen enjeksiyonu aldı. Tamoksifen enjeksiyonundan iki gün sonra, farelere ışınlama veya sahte ışınla...

Tartışmalar

Bu protokol, sağlam ve tekrarlanabilir bir radyasyon hasarı modelini tanımlar. Yaralanma sonrası 7 gün boyunca bağırsak epitelindeki değişikliklerin hassas analizine izin verir. Önemli olarak, seçilen zaman noktaları yaralanmanın önemli aşamalarını yansıtır ve bağırsakta belirgin değişiklikler (yaralanma, apoptoz, rejenerasyon ve normalleşme aşamaları) ile karakterize edilir60. Bu ışınlama modeli, radyoterapi gören hastaların yaşadığı taklit yaralanmasının uygu...

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, doku örneği hazırlama konusunda uzman yardımı için Stony Brook Kanser Merkezi Histoloji Araştırma Çekirdeği'ne ve hayvan bakımı ve kullanımı konusunda yardım için Stony Brook Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Bölümü'ne teşekkür etmek istemektedir. Bu çalışma, Agnieszka B. Bialkowska'ya verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri DK124342 ve Dr. Vincent W. Yang'a verilen DK052230 hibeleriyle desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeBD309659-
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: StraightVWR20068-630-
27G x 1/2" needleBD305109-
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringeCovidien1188128012-
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)Santa Cruz Biotechnologysc284628A10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered FormalinFisher Scientific22-026-213-
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JThe Jackson LaboratoryStrain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/JThe Jackson LaboratoryStrain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shockMillipore-Sigma3116956001
Chicken anti-GFPAvesGFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, InvitrogenThermo Fisher ScientificC10638-
Corn oilMillipore-SigmaC8267-
Decloaking ChamberBiocare MedicalDC2012-
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher BioReagentsBP231-100light sensitive
DNase-free proteinase KInvitrogenC10618Hdiluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647Jackson ImmunoResearch703-605-155
DPBSFisher Scientific21-031-CV-
EosinFisher ScientificS176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20XNikon
Fluoromount Aqueous Mounting MediumMillipore-SigmaF4680-25ML
Gamma Cell 40 ExactorBest Theratronics Ltd.-0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488Jackson ImmunoResearch111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3Millipore-SigmaGHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo ScientificFisher Scientific23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)Thermo Fisher ScientificH3569dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-603-252-
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)Millipore-Sigma11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificL119-5000.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mLVWR89215-218-
MethanolVWRBDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOFFisher ScientificNC1675398-
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS GradeCapitol ScientificAAP-281000ACSCSLT-
Rabbit anti-Ki67BioCare MedicalCRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting MediumFisher Scientific22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degreeFisher Scientific50-728-103
Sodium Citrate DihydrateFisher ScientificS279-500
Stainless Steel Dissecting KitVWR25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]VWR 48311-703
TamoxifenMillipore-SigmaT564830 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable HandleSakura4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile BladesSakura4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining SetSakura4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with LidSakura4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with LidSakura4457
Tween 20Millipore-SigmaP7949
Unisette Processing CassettesVWR87002-292-
VWR Micro Cover GlassesVWR48393-081
XyleneFisher ScientificX5P-1GAL

Referanslar

  1. Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
  2. vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
  3. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 466-471 (2012).
  6. Liao, Z., Hu, C., Gao, Y. Mechanisms modulating the activities of intestinal stem cells upon radiation or chemical agent exposure. Journal of Radiation Research. 63 (2), 149-157 (2022).
  7. Meyer, A. R., Brown, M. E., McGrath, P. S., Dempsey, P. J. Injury-Induced Cellular Plasticity Drives Intestinal Regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (3), 843-856 (2022).
  8. Owens, B. M., Simmons, A. Intestinal stromal cells in mucosal immunity and homeostasis. Mucosal Immunology. 6 (2), 224-234 (2013).
  9. Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
  10. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. The American Journal of Anatomy. 141 (4), 537-561 (1974).
  11. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nature Medicine. 27 (1), 45-48 (2021).
  12. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  13. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  14. Tirado, F. R., et al. Radiation-induced toxicity in rectal epithelial stem cell contributes to acute radiation injury in rectum. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 63 (2021).
  15. Tetteh, P. W., Farin, H. F., Clevers, H. Plasticity within stem cell hierarchies in mammalian epithelia. Trends in Cell Biology. 25 (2), 100-108 (2015).
  16. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  17. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 179-184 (2011).
  18. Orzechowska, E. J., Katano, T., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Interplay among p21(Waf1/Cip1), MUSASHI-1 and Kruppel-like factor 4 in activation of Bmi1-Cre(ER) reserve intestinal stem cells after gamma radiation-induced injury. Scientific Reports. 10 (1), 18300 (2020).
  19. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  20. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nature Cell Biology. 14 (4), 401-408 (2012).
  21. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  22. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  23. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  24. Castillo-Azofeifa, D., et al. Atoh1(+) secretory progenitors possess renewal capacity independent of Lgr5(+) cells during colonic regeneration. The EMBO Journal. 38 (4), 99984 (2019).
  25. Van Landeghem, L., et al. Activation of two distinct Sox9-EGFP-expressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (10), 1111-1132 (2012).
  26. Roche, K. C., et al. SOX9 maintains reserve stem cells and preserves radioresistance in mouse small intestine. Gastroenterology. 149 (6), 1553-1563 (2015).
  27. Barriga, F. M., et al. Mex3a marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  28. May, R., et al. Brief report: Dclk1 deletion in tuft cells results in impaired epithelial repair after radiation injury. Stem Cells. 32 (3), 822-827 (2014).
  29. Tetteh, P. W., et al. Replacement of lost Lgr5-positive stem cells through plasticity of their enterocyte-lineage daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  30. Bohin, N., et al. Rapid crypt cell remodeling regenerates the intestinal stem cell niche after Notch inhibition. Stem Cell Reports. 15 (1), 156-170 (2020).
  31. Li, N., et al. Single-cell analysis of proxy reporter allele-marked epithelial cells establishes intestinal stem cell hierarchy. Stem Cell Reports. 3 (5), 876-891 (2014).
  32. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  33. Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (23), 8965-8970 (2012).
  34. Hayakawa, Y., et al. BHLHA15-positive secretory precursor cells can give rise to tumors in intestine and colon in mice. Gastroenterology. 156 (4), 1066-1081 (2019).
  35. Yan, K. S., et al. Intestinal enteroendocrine lineage cells possess homeostatic and injury-inducible stem cell activity. Cell Stem Cell. 21 (1), 78-90 (2017).
  36. Chandrakesan, P., et al. Intestinal tuft cells regulate the ATM mediated DNA damage response via Dclk1 dependent mechanism for crypt restitution following radiation injury. Scientific Reports. 6, 37667 (2016).
  37. Yu, S., et al. Paneth cell multipotency induced by Notch activation following Injury. Cell Stem Cell. 23 (1), 46-59 (2018).
  38. Moussa, L., et al. Bowel radiation injury: Complexity of the pathophysiology and promises of cell and tissue engineering. Cell Transplantation. 25 (10), 1723-1746 (2016).
  39. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
  40. Tam, S. Y., Wu, V. W. C. A review on the special radiotherapy techniques of colorectal cancer. Frontiers in Oncology. 9, 208 (2019).
  41. Shadad, A. K., Sullivan, F. J., Martin, J. D., Egan, L. J. Gastrointestinal radiation injury: Symptoms, risk factors and mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 19 (2), 185-198 (2013).
  42. Serrano Martinez, P., Giuranno, L., Vooijs, M., Coppes, R. P. The radiation-induced regenerative response of adult tissue-specific stem cells: Models and signaling pathways. Cancers. 13 (4), 855 (2021).
  43. Stacey, R., Green, J. T. Radiation-induced small bowel disease: Latest developments and clinical guidance. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 5 (1), 15-29 (2014).
  44. Pan, Y. B., Maeda, Y., Wilson, A., Glynne-Jones, R., Vaizey, C. J. Late gastrointestinal toxicity after radiotherapy for anal cancer: A systematic literature review. Acta Oncologica. 57 (11), 1427-1437 (2018).
  45. Elhammali, A., et al. Late gastrointestinal tissue effects after hypofractionated radiation therapy of the pancreas. Radiation Oncology. 10, 186 (2015).
  46. You, S. H., Cho, M. Y., Sohn, J. H., Lee, C. G. Pancreatic radiation effect in apoptosis-related rectal radiation toxicity. Journal of Radiation Research. 59 (5), 529-540 (2018).
  47. Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29 (2015).
  48. Snider, A. J., et al. Murine model for colitis-associated cancer of the colon. Methods in Molecular Biology. 1438, 245-254 (2016).
  49. Clapper, M. L., Cooper, H. S., Chang, W. C. Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia: A promising model for the development of chemopreventive interventions. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (9), 1450-1459 (2007).
  50. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  51. Fujimichi, Y., Otsuka, K., Tomita, M., Iwasaki, T. Ionizing radiation alters organoid forming potential and replenishment rate in a dose/dose-rate dependent manner. Journal of Radiation Research. 63 (2), 166-173 (2022).
  52. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4alpha as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  53. Nagle, P. W., Coppes, R. P. Current and future perspectives of the use of organoids in radiobiology. Cells. 9 (12), 2649 (2020).
  54. Taelman, J., Diaz, M., Guiu, J. Human Intestinal Organoids: Promise and Challenge. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854740 (2022).
  55. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
  56. Kuruvilla, J. G., et al. Kruppel-like factor 4 modulates development of BMI1(+) intestinal stem cell-derived lineage following gamma-radiation-induced gut injury in mice. Stem Cell Reports. 6 (6), 815-824 (2016).
  57. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nature Genetics. 40 (7), 915-920 (2008).
  58. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
  59. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  60. Booth, C., Tudor, G., Tudor, J., Katz, B. P., MacVittie, T. J. Acute gastrointestinal syndrome in high-dose irradiated mice. Health Physics. 103 (4), 383-399 (2012).
  61. Lu, L., Jiang, M., Zhu, C., He, J., Fan, S. Amelioration of whole abdominal irradiation-induced intestinal injury in mice with 3,3'-Diindolylmethane (DIM). Free Radical Biology & Medicine. 130, 244-255 (2019).
  62. Karlsson, J. A., Andersen, B. L. Radiation therapy and psychological distress in gynecologic oncology patients: Outcomes and recommendations for enhancing adjustment. Journal of Psychosomatic Obstetrics & Gynecology. 5 (4), 283-294 (1986).
  63. Yang, J., Cai, H., Xiao, Z. X., Wang, H., Yang, P. Effect of radiotherapy on the survival of cervical cancer patients: An analysis based on SEER database. Medicine. 98 (30), 16421 (2019).
  64. Giroux, V., et al. Mouse intestinal Krt15+ crypt cells are radio-resistant and tumor initiating. Stem Cell Reports. 10 (6), 1947-1958 (2018).
  65. Kim, C. K., et al. Kruppel-like factor 5 regulates stemness, lineage specification, and regeneration of intestinal epithelial stem cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 587-609 (2020).
  66. Sheng, X., et al. Cycling stem cells are radioresistant and regenerate the intestine. Cell Reports. 32 (4), 107952 (2020).
  67. Gross, S., et al. Nkx2.2 is expressed in a subset of enteroendocrine cells with expanded lineage potential. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (12), 975-987 (2015).
  68. Sato, T., et al. Characterization of radioresistant epithelial stem cell heterogeneity in the damaged mouse intestine. Scientific Reports. 10 (1), 8308 (2020).
  69. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7 (6), 38965 (2012).
  70. Bohin, N., et al. Insulin-like growth factor-1 and mTORC1 signaling promote the intestinal regenerative response after irradiation injury. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 797-810 (2020).
  71. Romesser, P. B., et al. Preclinical murine platform to evaluate therapeutic countermeasures against radiation-induced gastrointestinal syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (41), 20672-20678 (2019).
  72. Gu, J., et al. At what dose can total body and whole abdominal irradiation cause lethal intestinal injury among C57BL/6J mice. Dose Response. 18 (3), 1559325820956783 (2020).
  73. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  74. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 365-367 (2019).
  75. Bohin, N., Carlson, E. A., Samuelson, L. C. Genome toxicity and impaired stem cell function after conditional activation of CreER(T2) in the intestine. Stem Cell Reports. 11 (6), 1337-1346 (2018).
  76. Boynton, F. D. D., Ericsson, A. C., Uchihashi, M., Dunbar, M. L., Wilkinson, J. E. Doxycycline induces dysbiosis in female C57BL/6NCrl mice. BMC Research Notes. 10 (1), 644 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır