İyonlaştırıcı Işınlamaya Yanıt Olarak Bağırsak Epitelyal Rejenerasyonu

Özet

Gastrointestinal sistem, radyoterapötik kanser tedavileri üzerine yaralanmaya karşı en hassas organlardan biridir. Aynı zamanda, bu tür hakaretleri takiben en yüksek rejeneratif kapasitelerden birine sahip bir organ sistemidir. Sunulan protokol, bağırsak epitelinin rejeneratif kapasitesini incelemek için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.

Özet

Bağırsak epiteli, tek bir hücre katmanından oluşur, ancak bağırsak kriptlerinin dibinde bulunan bağırsak kök hücrelerinin aktif çoğalmasıyla üretilen çok sayıda terminal farklılaşmış hücre türü içerir. Bununla birlikte, akut bağırsak hasarı olayları sırasında, bu aktif bağırsak kök hücreleri hücre ölümüne uğrar. Gama ışınlaması, terapötik olarak etkili olsa da, aktif kök hücre havuzunu tüketmenin yan etkisine sahip olan, yaygın olarak kullanılan bir kolorektal kanser tedavisidir. Gerçekten de, hastalar kısmen aktif kök hücre tükenmesi nedeniyle radyoterapi görürken sıklıkla gastrointestinal radyasyon sendromu yaşarlar. Bağırsak kriptlerindeki aktif bağırsak kök hücrelerinin kaybı, tipik olarak sessiz rezervli bağırsak kök hücrelerinden oluşan bir havuzu aktive eder ve sekretuar ve enterosit öncü hücrelerinin farklılaşmasını indükler. Bu hücreler için olmasaydı, bağırsak epiteli radyoterapi ve diğer büyük doku hakaretlerinden kurtulma yeteneğinden yoksun olurdu. Soy izleme teknolojilerindeki yeni gelişmeler, rejenerasyon sırasında hücrelerin aktivasyonunun, farklılaşmasının ve göçünün izlenmesine izin verir ve bunu bağırsakta incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Bu çalışma, radyasyon hasarını takiben fare bağırsak epiteli içindeki hücrelerin analizi için bir yöntem göstermeyi amaçlamaktadır.

Giriş

İnsan bağırsak epiteli, tamamen düz¹ yerleştirilirse yaklaşık yarım badminton kortunun yüzeyini kaplar. Bunun yerine, insanları bağırsaklarının içeriğinden ayıran bu tek hücre tabakası, bağırsakların yüzey alanını en üst düzeye çıkaran bir dizi parmak benzeri çıkıntı, villus ve girinti, kriptlere sıkıştırılır. Epitelin hücreleri bir kript-villus ekseni boyunca farklılaşır. Villus öncelikle besin emici enterositlerden, mukus salgılayan kadeh hücrelerinden ve hormon üreten enteroendokrin hücrelerden oluşurken, kriptler öncelikle savunma üreten Paneth hücreleri, aktif ve rezerv kök hücreler ve progenitör hücrelerden^oluşur

Protokol

Tüm fareler, Stony Brook Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanları Kaynakları Bölümü'nde (DLAR) barındırıldı. Stony Brook Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC), hayvan denekleri içeren tüm çalışmaları ve prosedürleri onayladı. Hayvan denekleri içeren deneyler kesinlikle onaylanmış hayvan işleme protokolüne (IACUC #245094) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

NOT: Fare suşları B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre^ER) ve B6.129X1-Gt(ROSA)26Sor^tm1(EYFP)Cos/J (Rosa26^eYFP) ticari olarak elde edilmiştir (bkz.....

Sonuçlar

Murin genetik soy takibi ile kombinasyon halinde 12 Gy toplam vücut ışınlamasının (TBI) kullanılması, bağırsaktaki radyasyon hasarının sonuçlarının kapsamlı bir analizine izin verir. Başlamak için, Bmi1-Cre^ER; Rosa26^eYFP fareleri, bir Bmi1 ⁺ rezerv kök hücre popülasyonunda gelişmiş sarı floresan protein (EYFP) ekspresyonunu indükleyen tek bir tamoksifen enjeksiyonu aldı. Tamoksifen enjeksiyonundan iki gün sonra, farelere ışınlama veya sahte ışınla.......

Tartışmalar

Bu protokol, sağlam ve tekrarlanabilir bir radyasyon hasarı modelini tanımlar. Yaralanma sonrası 7 gün boyunca bağırsak epitelindeki değişikliklerin hassas analizine izin verir. Önemli olarak, seçilen zaman noktaları yaralanmanın önemli aşamalarını yansıtır ve bağırsakta belirgin değişiklikler (yaralanma, apoptoz, rejenerasyon ve normalleşme aşamaları) ile karakterize ^edilir60. Bu ışınlama modeli, radyoterapi gören hastaların yaşadığı taklit yaralanmasının uygu.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309659	-
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: Straight	VWR	20068-630	-
27G x 1/2" needle	BD	305109	-
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringe	Covidien	1188128012	-
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)	Santa Cruz Biotechnology	sc284628A	10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered Formalin	Fisher Scientific	22-026-213	-
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J	The Jackson Laboratory	Strain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J	The Jackson Laboratory	Strain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shock	Millipore-Sigma	3116956001
Chicken anti-GFP	Aves	GFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, Invitrogen	Thermo Fisher Scientific	C10638	-
Corn oil	Millipore-Sigma	C8267	-
Decloaking Chamber	Biocare Medical	DC2012	-
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher BioReagents	BP231-100	light sensitive
DNase-free proteinase K	Invitrogen	C10618H	diluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647	Jackson ImmunoResearch	703-605-155
DPBS	Fisher Scientific	21-031-CV	-
Eosin	Fisher Scientific	S176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20X	Nikon
Fluoromount Aqueous Mounting Medium	Millipore-Sigma	F4680-25ML
Gamma Cell 40 Exactor	Best Theratronics Ltd.	-	0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488	Jackson ImmunoResearch	111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3	Millipore-Sigma	GHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo Scientific	Fisher Scientific	23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)	Thermo Fisher Scientific	H3569	dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical	Fisher Scientific	18-603-252	-
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)	Millipore-Sigma	11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, Mini	Fisher Scientific	DAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	L119-500	0.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mL	VWR	89215-218	-
Methanol	VWR	BDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOF	Fisher Scientific	NC1675398	-
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS Grade	Capitol Scientific	AAP-281000ACSCSLT	-
Rabbit anti-Ki67	BioCare Medical	CRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting Medium	Fisher Scientific	22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degree	Fisher Scientific	50-728-103
Sodium Citrate Dihydrate	Fisher Scientific	S279-500
Stainless Steel Dissecting Kit	VWR	25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]	VWR	48311-703
Tamoxifen	Millipore-Sigma	T5648	30 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable Handle	Sakura	4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Blades	Sakura	4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set	Sakura	4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with Lid	Sakura	4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with Lid	Sakura	4457
Tween 20	Millipore-Sigma	P7949
Unisette Processing Cassettes	VWR	87002-292	-
VWR Micro Cover Glasses	VWR	48393-081
Xylene	Fisher Scientific	X5P-1GAL