Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מערכת העיכול היא אחד האיברים הרגישים ביותר לפגיעה בטיפולי סרטן רדיותרפיים. זוהי בו זמנית מערכת איברים עם אחת מיכולות ההתחדשות הגבוהות ביותר בעקבות עלבונות כאלה. הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה יעילה לחקר יכולת ההתחדשות של אפיתל המעי.

Abstract

אפיתל המעי מורכב משכבה אחת של תאים אך מכיל סוגים רבים של תאים ממוינים סופניים, אשר נוצרים על ידי התפשטות פעילה של תאי גזע מעיים הממוקמים בתחתית crypts המעי. עם זאת, במהלך אירועים של פגיעה חריפה במעי, תאי גזע פעילים אלה עוברים מוות תאי. הקרנת גמא היא טיפול נפוץ בסרטן המעי הגס, אשר, בעוד יעיל מבחינה טיפולית, יש את תופעת הלוואי של דלדול מאגר תאי הגזע הפעיל. ואכן, חולים חווים לעתים קרובות תסמונת קרינה במערכת העיכול בזמן שהם עוברים הקרנות, בין היתר בשל דלדול תאי גזע פעילים. אובדן תאי גזע פעילים במעיים מפעיל מאגר של תאי גזע במעי שבדרך כלל נמצאים ברזרבה שקטה וגורם להתמיינות של תאים מבשרי הפרשה ואנטרוציט. אלמלא תאים אלה, אפיתל המעי היה חסר את היכולת להתאושש מהקרנות ופגיעות רקמה גדולות אחרות. פיתוחים חדשים בטכנולוגיות למעקב אחר שושלות מאפשרים מעקב אחר ההפעלה, ההתמיינות והנדידה של תאים במהלך רגנרציה, ושימשו בהצלחה לחקר זה במעיים. מחקר זה נועד לתאר שיטה לניתוח תאים בתוך אפיתל המעי של העכבר לאחר פגיעה בקרינה.

Introduction

אפיתל המעי האנושי יכסה בערך את פני השטח של חצי מגרש בדמינטון אם ימוקם שטוח לחלוטין1. במקום זאת, שכבת התא הבודדת הזו המפרידה בין בני אדם לתכולת המעיים שלהם נדחסת לסדרה של הקרנות דמויות אצבע, וילי ושקעים, קריפטות שממקסמות את שטח הפנים של המעיים. תאי האפיתל מתמיינים לאורך ציר קריפט-וילוס. הווילוס מורכב בעיקר מאנטרוציטים סופגי חומרים מזינים, תאי גביע מפרישי ריר ותאים אנטרואנדוקריניים מייצרי הורמונים, בעוד שהקריפטים מורכבים בעיקר מתאי פאנת מייצרי דפנסין, תאי גזע פעילים ומילואים, ותאי אב 2,3,4,5. יתר על כן, התקשורת הדו-כיוונית שיש לתאים אלה עם תאי הסטרומה ומערכת החיסון של התא המזנכימלי הבסיסי והמיקרוביוטה של הלומן יוצרת רשת מורכבת של אינטראקציות השומרת על הומאוסטזיס המעי והיא קריטית להחלמה לאחר פציעה 6,7,8.

אפיתל המעי הוא הרקמה המתחדשת העצמית המהירה ביותר בגוף האדם, עם קצב תחלופה של 2-6 ימים 9,10,11. במהלך ההומאוסטזיס, תאי גזע פעילים בבסיס קריפטים של המעי (crypt base columnar cells), המסומנים על ידי ביטוי של קולטן מצומד G-protein 5 (LGR5) עשיר בלאוצין, מתחלקים במהירות ומספקים תאי אב המתמיינים לכל שושלות אפיתל המעי האחרות. עם זאת, בשל הקצב המיטוטי הגבוה שלהם, תאי גזע פעילים ואבותיהם המיידיים רגישים במיוחד לפגיעה בקרינת גמא ועוברים אפופטוזיס לאחר הקרנה 5,12,13,14. עם אובדנם, תאי גזע רזרבה ותאים שאינם גזע (תת-אוכלוסייה של אבות וכמה תאים ממוינים סופניים) בתוך קריפטות מעיים עוברים הפעלה ומחדשים את תא הקריפטה הבסיסי, אשר לאחר מכן יכול לשחזר אוכלוסיות תאים של הווילי, ובכך לחדש את אפיתל המעי15. באמצעות טכניקות מעקב אחר שושלת, קבוצות מחקר רבות הוכיחו כי תאי גזע רזרבה (שקטים) מסוגלים לתמוך בהתחדשות עם אובדן תאי גזע פעילים 13,16,17,18,19,20,21,22. תאים אלה מאופיינים בנוכחות של אונקוגן קומפלקס פוליקומב חלבון 1 (Bmi1), גן שעתוק הפוך של עכבר טלומראז (mTert), הופ הומיאובוקס (Hopx), וגן חלבון חוזר עשיר בלאוצין 1 (Lrig1). בנוסף, הוכח כי תאים שאינם גזע מסוגלים לחדש את crypts המעי עם פציעה 23,24,25,26,27,28,29,30,31. בפרט, הוכח כי אבות של תאים מפרישים ו enterocytes לעבור dedifferentiation עם פציעה, לחזור תאים דמויי גזע, ולתמוך התחדשות של אפיתל המעי. מחקרים אחרונים זיהו תאים המבטאים סמנים מרובים בעלי יכולת לרכוש מאפיינים דמויי גזע בעת פציעה (כגון DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. באופן מפתיע, Yu et al. הראו כי אפילו תאי Paneth בוגרים (LYZ+) יכולים לתרום להתחדשות המעי37. יתר על כן, בנוסף לגרימת אפופטוזיס של תאי אפיתל במעי ושיבוש תפקוד מחסום האפיתל, הקרנה גורמת לדיסביוזה של פלורת המעי, הפעלת תאי מערכת החיסון והתחלת תגובה פרו-דלקתית, והפעלת תאים מזנכימליים וסטרומליים38,39.

קרינת גמא היא כלי טיפולי רב ערך בטיפול בסרטן, במיוחד כשמדובר בגידולים במעי הגס40. עם זאת, הקרנה משפיעה באופן משמעותי על הומאוסטזיס המעי על ידי גרימת נזק לתאים, מה שמוביל אפופטוזיס. חשיפה לקרינה גורמת להפרעות מרובות המאטות את החלמתו של המטופל ומאופיינת בפגיעה ברירית ודלקת בשלב החריף ובשלשולים, בריחת שתן, דימום וכאבי בטן לטווח ארוך. מכלול זה של ביטויים מכונה רעילות קרינה במערכת העיכול. בנוסף, התקדמות הנגרמת על ידי קרינה של פיברוזיס טרנסמורלי ו / או טרשת וסקולרית עשויה להתבטא רק שנים לאחר הטיפול38,41. במקביל לפציעה עצמה, הקרינה גורמת לתגובת תיקון בתאי המעי המפעילה מסלולי איתות האחראים על ייזום ותזמור התחדשות42. מחלת מעי דק הנגרמת על ידי קרינה יכולה לנבוע מהקרנות אגן או בטן הניתנות לאיברים אחרים (כגון צוואר הרחם, הערמונית, הלבלב, פי הטבעת)41,43,44,45,46. פגיעה בהקרנת מעיים היא, אם כן, בעיה קלינית משמעותית, והבנה טובה יותר של הפתופיזיולוגיה הנובעת מכך עשויה לקדם את הפיתוח של התערבויות להקלת הסיבוכים במערכת העיכול הקשורים להקרנות. ישנן טכניקות אחרות המאפשרות לחקור את המטרה הרגנרטיבית של אפיתל המעי מלבד קרינה. מודלים של מורין מהונדס וכימי לחקר דלקת וההתחדשות לאחר מכן פותחו47. דקסטרן נתרן גופרתי (DSS) גורם לדלקת במעי ומוביל להתפתחות מאפיינים דומים לאלה של מחלות מעי דלקתיות48. שילוב של טיפול DSS עם התרכובת המסרטנת azoxymethane (AOM) יכול לגרום להתפתחות סרטן הקשור קוליטיס48,49. פגיעה הנגרמת על ידי איסכמיה היא שיטה נוספת המשמשת לחקר הפוטנציאל ההתחדשות של אפיתל המעי. טכניקה זו דורשת ניסיון וידע כירורגי50. יתר על כן, הטכניקות הנ"ל גורמות לסוגים שונים של פגיעה מאשר קרינה ועלולות להוביל למעורבות של מנגנוני התחדשות שונים. בנוסף, מודלים אלה גוזלים זמן, בעוד טכניקת הקרינה קצרה למדי. לאחרונה, שיטות במבחנה המשתמשות באנטרואידים וקולונואידים המופקים מהמעי ומהמעי הגס שימשו בשילוב עם פגיעה בקרינה כדי לחקור את מנגנוני התחדשות המעי51,52. עם זאת, טכניקות אלה אינן משחזרות באופן מלא את האיבר שהן מדגימות53,54.

הפרוטוקול המוצג כולל תיאור של מודל מורין של פגיעה בקרינת גמא בשילוב עם מודל גנטי המאפשר לאחר טיפול בטמוקסיפן התחקות אחר שושלות שמקורן באוכלוסיית תאי הגזע השמורות (Bmi1-CreER; רוזה26eYFP). מודל זה משתמש בהקרנה של 12 Gy לכל הגוף, אשר גורמת לפגיעה משמעותית מספיק במעיים כדי להפעיל תאי גזע רזרבה ועדיין מאפשרת חקירה עוקבת של יכולת התחדשות המעי תוך 7 ימים מהפציעה55.

Protocol

כל העכברים שוכנו במחלקה למשאבי חיות מעבדה (DLAR) באוניברסיטת סטוני ברוק. הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סטוני ברוק (IACUC) אישרה את כל המחקרים והנהלים המערבים נבדקים בבעלי חיים. ניסויים בבעלי חיים נערכו אך ורק בהתאם לפרוטוקול הטיפול בבעלי חיים המאושר (IACUC #245094).

הערה: זני עכברים B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J (Bmi1-Cre ER) ו-B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J (Rosa26eYFP) הושגו באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים) וחצו כדי להשיג Bmi1-Cre ER; Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) עכברים, כפי שתואר קודם 56,57,58.

1. דיור של Bmi1-Cre ER; עכברי Rosa26 eYFP

  1. החזיקו את העכברים במתקן לבעלי חיים בטמפרטורה הנעה בין 20-20 מעלות צלזיוס ולחות הנעה בין 30-70%, במחזור אור/חושך של 12 שעות/12 שעות, עם מים וצ'או אד ליביטום.
  2. לפני הניסויים, לאשר גנוטיפים עכברים באמצעות טכניקת גנוטיפ PCR סטנדרטית57,58.

2. הכנת בעלי חיים וחומרים

  1. העבירו עכברים לחדר הניסויים לפחות 7 ימים לפני כל ניסוי כדי לאפשר לעכברים להתאקלם.
  2. התאמת חיות ניסוי ובקרה לפי מין וגיל.
  3. יש להכפיף את חיות הביקורת לרקומבינציה בתיווך Cre הנגרמת על ידי טמוקסיפן אך לא להקרנה (טיפול דמה, 0 Gy) תוך הקפדה על כך שחיות הניסוי יקבלו את זריקת הטמוקסיפן וייחשפו לקרינת גמא.
  4. הכינו את תמיסת הטמוקסיפן. מרחפים אבקת טמוקסיפן בשמן תירס סטרילי בריכוז של 30 מ"ג/מ"ל. סוניק במשך 3 דקות במחזורים של 30 שניות הפעלה ו-30 שניות כיבוי עם משרעת של 60% ולאחר מכן סובב בחושך במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT). ניתן להקפיא תמיסת טמוקסיפן בטמפרטורה של 20°C- אך אין להקפיא/להפשיר אותה יותר מפעם אחת. רצוי, להכין פתרון טרי בכל פעם ולא לאחסן אותו.
    הערה: טמוקסיפן רגיש לאור. עוטפים אותו בנייר כסף במהלך סיבוב טמפרטורת החדר.
    זהירות: טמוקסיפן הוא חומר שעלול להיות מסוכן: סכנה בריאותית (GHS08) ומפגע סביבתי (GHS09).
  5. הכינו תמיסת מלאי 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU). יש להשהות מחדש את אבקת EdU ב-1/5 מהנפח הכולל של דימתיל סולפוקסיד סטרילי (DMSO) ולהוסיף באיטיות את 4/5 הנותרים מהנפח הכולל של מים סטריליים אולטרה-טהורים. כאשר מומס לחלוטין, aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
    זהירות: 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) ודימתיל סולפוקסיד (DMSO) הם חומרים מסוכנים פוטנציאליים: סכנה בריאותית (H340 ו-H631, ו-H227, H315 ו-H319, בהתאמה). EdU עלול לגרום לפגמים גנטיים וחשוד בפגיעה בפוריות או בילדים שטרם נולדו, ו- DMSO עלול לגרום לגירוי בעור ובעיניים.
  6. הכינו ריאגנטים לאיסוף וקיבוע רקמות: דללו אתנול להכנת תמיסת מים 70%, קררו DPBS ל-4°C, והכינו חיץ קיבוע שונה של Bouin (50% אתנול ו-5% חומצה אצטית ב-H2O מזוקק) ו-10% פורמלין חוצץ.
    זהירות: אתיל אלכוהול הוא חומר שעלול להיות מסוכן: סכנה בריאותית (H225-H319), דליק (GHS02) וגורם לרעילות חריפה (GHS07). חומצה אצטית היא חומר שעלול להיות מסוכן: סכנה בריאותית (H226-H314), דליק (GHS02) וקורוזיבי (GHS05). פורמלין הוא חומר מסוכן: מסוכן בריאותית (H350, H315, H317, H318, H370), וקורוזיבי. פורמלין עלול לגרום לסרטן, גירוי בעור ובעיניים, נזק לאיברים ותגובות עור אלרגיות.
  7. הכינו את הציוד הדרוש להמתת חסד בשיטה מאושרת (תא CO2 , למשל), ערכת דיסקציה של עכברים (מספריים, מלקחיים), צלחות פטרי, מחט 16 גרם המחוברת למזרק 10 מ"ל לשטיפת המעיים, וקלטות היסטולוגיות.

3. הקרנת גמא כוללת בגוף (TBI) ואיסוף רקמות

  1. יומיים לפני החשיפה לקרינת גמא, הזריקו לחיות הניסוי מנה אחת של טמוקסיפן כדי לגרום לרקומבינציה בתיווך Cre ולמעקב אחר שושלת התאים BMI1/EYFP+ . לשקול כל חיה ולחשב מינון של 40 מ"ג / ק"ג של משקל הגוף של טמוקסיפן resuspended בשמן תירס. לחטא את אזור הבטן עם אתנול 70% ולנהל טמוקסיפן intraperitoneally באמצעות מחט 27G מחובר מזרק 1 מ"ל.
  2. התבונן בבעלי חיים במשך 48 השעות הבאות כדי למנוע רעילות טמוקסיפן פוטנציאלית.
  3. העבר את העכברים לחדר ההקרנה כפי שצוין על ידי המוסד המקומי.
  4. חשב את זמן החשיפה לקרינה המשתחרר על ידי מקור 137Cs בהתאם לקצב מינון ה- exactor הנוכחי. לדוגמה, אם קצב המינון הנוכחי שווה ל- 75.9 rad/min (0.759 Gy min−1 = 75.9 cGy m−1), זמן החשיפה בדקות מחושב כמינון הרצוי/0.759. כדי להקרין את החיות למינון של 12 Gy TBI, זמן החשיפה הוא ~15.81 דקות (15 דקות ו-48 שניות).
  5. לחטא את תא הדגימה במקרין גמא עם תמיסת אתנול 70%; הניחו את משטח הספיגה ובעלי החיים בתוך תא הדגימה.
    הערה: בעלי חיים שטופלו בדמה צריכים להיות ממוקמים בחדר ההקרנה אך לא חשופים לקרינת גמא.
  6. מניחים את המכסה וסוגרים את החדר.
  7. תכנת את מקרין הגמא לחשוף בעלי חיים ל-12 Gy TBI.
    1. הפעל את המכשיר על-ידי הפיכת המפתח למצב START.
    2. הזן את מספר האופרטור באמצעות מקלדת מספרית ואשר על-ידי הקשה על ENTER.
    3. הזן את מספר ה- PIN באמצעות מקלדת מספרית ואשר על-ידי הקשה על ENTER.
    4. הקש 1 לקבלת אפשרויות.
    5. הקש 1 לקבלת הגדרות שעון עצר.
    6. הקש 1 לקבלת זמן הקרנה.
    7. הזן את הגדרת הטיימר עבור המחזור הבא באמצעות מקלדת נומרית (תבנית hh:mm:ss) ואשר על-ידי הקשה על ENTER.
    8. אשר את ההגדרות פעם נוספת על-ידי הקשה על ENTER.
    9. חזור לתפריט הבית על-ידי לחיצה על CLEAR 2x.
    10. לחץ על START כדי להתחיל את החשיפה.
  8. יש לצאת מהחדר לזמן החשיפה הפעילה. המכשיר יעצור אוטומטית לאחר חלוף הזמן שנקבע מראש ויתחיל לצפצף.
    זהירות: צזיום-137 (137צלזיוס) הוא חומר מסוכן קטלני (סכנה בריאותית: H314). חשיפה חיצונית לכמויות גדולות של 137מעלות צלזיוס עלולה לגרום לכוויות, למחלת קרינה חריפה ואף למוות.
  9. כבה את ההתקן על-ידי הפיכת המפתח למצב STOP.
  10. פתחו את תא הדגימה, הסירו את המכסה, העבירו את בעלי החיים חזרה לכלוב וחיטאו את תא הדגימה בתמיסת אתנול 70%.
  11. העבירו את בעלי החיים חזרה לחדר הדיור הקונבנציונלי והתבוננו במצבם לאחר הטיפול.
  12. עקוב אחר משקל בעלי החיים מדי יום והרדים אותם מיד (למרות נקודת הזמן המתוכננת) אם נצפים תסמינים כלשהם של רווחה נפשית משתנה, מצוקה או ירידה במשקל העולה על 15% ממשקל הגוף ההתחלתי.
  13. שלוש שעות לפני המתת החסד המתוכננת לחטא את אזור הבטן, ובאמצעות מזרק אינסולין 28G, להזריק לעכברים 100 μL של תמיסת מלאי EdU (ניתנת תוך צפקית).
  14. לאסוף מעיים פרוקסימליים ב 0 שעות, 3 שעות, 6 שעות, 24 שעות, 48 שעות, 72 שעות, 96 שעות, ו 168 שעות לאחר הקרנה.
    1. לבצע המתת חסד CO2 על פי הסטנדרטים של מוסד הבית.
      זהירות: פחמן דו-חמצני הוא חומר מסוכן (H280). מכיל גז בלחץ; עלול להתפוצץ אם מחומם. עלול לעקור חמצן ולגרום לחנק מהיר.
    2. לאחר מכן, לנתח את החלק הפרוקסימלי של המעי הדק, להסיר רקמות מחוברות, סומק עם DPBS קר באמצעות מחט הזנה ישרה 16 G מחובר מזרק 10 מ"ל, לתקן עם חיץ קיבוע שונה של Bouin באמצעות מחט הזנה ישרה 16 G מחובר מזרק 10 מ"ל, לחתוך פתוח לאורך, ולגלגל את המעי הפרוקסימלי באמצעות טכניקת סוויס-רול כפי שתואר קודם59.
  15. מניחים את הרקמות בקלטת היסטולוגית ומשאירים למשך 24-48 שעות בטמפרטורת החדר במיכל עם 10% פורמלין חוצץ. נפח הפורמלין צריך להספיק כדי לכסות באופן מלא את הקלטות ההיסטולוגיות. כאשר זמן הדגירה חולף, באמצעות מלקחיים, להעביר את קלטות היסטולוגיות למיכל מלא 70% אתנול. לאחר מכן, המשך עם הטבעת פרפין רקמות.
    הערה: שיבוץ פרפין רקמות בוצע על ידי מעבדת הליבה להיסטולוגיה מחקרית באוניברסיטת סטוני ברוק. ההליך ניתן לעצור כאן, בלוקים פרפין ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר.
    אזהרה: פורמלין הוא חומר שעלול להיות מסוכן: מסוכן בריאותית (H350, H315, H317, H318, H370) וקורוזיבי. פורמלין עלול לגרום לסרטן, גירוי בעור ובעיניים, נזק לאיברים ותגובות עור אלרגיות.

4. ניתוח היסטולוגי

  1. קררו את הקלטות ההיסטולוגיות המכילות את דגימות הרקמה המשובצות בפרפין על ידי הנחתן על קרח למשך שעה אחת לפחות. בעזרת מיקרוטום מכינים מקטעים בעובי 5 מיקרומטר לצביעה. כל רקמה צריכה להיות פרוסה אופקית כדי לכסות את כל הדגימה המגולגלת.
    1. לאחר חיתוך בלוק הפרפין, מעבירים את חלקי הרקמה לאמבט מים המחומם עד 45 מעלות צלזיוס ומניחים את החלקים על שקופיות טעונות. השאירו את המגלשות על מדף למשך הלילה בטמפרטורת החדר לייבוש.
      הערה: ניתן לעצור את ההליך כאן, וניתן לאחסן את המגלשות בטמפרטורת החדר.
  2. מניחים את המגלשות במחזיק שקופיות ואופים בתנור של 18 מעלות למשך הלילה. את המגלשות ניתן לאפות לזמן קצר יותר, 1-2 שעות. עם זאת, זה לא מומלץ במקרה של טרי (פחות מ 1 חודש) לחתוך שקופיות.
    הערה: הניחו את ערכת צביעת השקופיות הידנית מתחת למכסה המנוע הכימי ובצעו את הדגירות עם קסילן, אתנול והמטוקסילין מתחת למכסה המנוע הכימי.
  3. למחרת, קררו את המגלשות על ידי הכנסתן למחזיק שקופיות מתחת למכסה המנוע הכימי למשך 10 דקות.
  4. deparaffinize את הרקמות על ידי הנחת מחזיק שקופיות במיכל מלא 100% xylene במשך 3 דקות. יש לחזור על הדגירה באמצעות 100% קסילן טרי.
    הערה: מאותו רגע, ודא שהדגימות נשמרות רטובות בכל עת.
    זהירות: קסילן הוא חומר שעלול להיות מסוכן: דליק (GHS02), הגורם לרעילות חריפה (GHS07) ולסכנה בריאותית (H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412). ההשפעות המסוכנות האפשריות הן שהוא קטלני אם נבלע או נכנס לדרכי הנשימה ועלול לגרום לגירוי בעור, בעיניים ובדרכי הנשימה. בנוסף, זה עלול להשפיע על תפקודים מוטוריים על ידי גרימת נמנום או סחרחורת ולגרום נזק איברים במקרה של חשיפה ממושכת או חוזרת.
  5. יש לייבש חלקים בשיפוע אתנול על ידי הנחת מחזיק השקופיות ברצף במיכלים מלאים בתמיסות הבאות: 100% אתנול, 2 דקות; 95% אתנול, 2 דקות; 70% אתנול, 2 דקות
  6. מעבירים את מחזיק המגלשה למיכל המלא במים מזוקקים ושוטפים במים מזוקקים זורמים למשך 2 דקות.
  7. מניחים את מחזיק המגלשה במיכל מלא בתמיסת המטוקסילין, ומכתימים למשך 5 דקות (מתחת למכסה המנוע הכימי).
  8. העבירו את מחזיק המגלשה למיכל המלא במי ברז ושטפו במי ברז זורמים עד שהכתמת המטוקסילין הופכת כחלחלה, בדרך כלל לאחר 2 דקות.
  9. העבר את מחזיק השקופיות למכל המלא בתמיסת ליתיום פחמתי 5% (w/v). לטבול פי 10.
    זהירות: ליתיום פחמתי הוא חומר שעלול להיות מסוכן: גורם לרעילות חריפה (GHS07), ולסכנה בריאותית (H302 - H319). זה מזיק אם נבלע, מזיק במגע עם העור, וגורם לגירוי חמור בעין.
  10. מעבירים את מחזיק המגלשה למיכל המלא במים מזוקקים ושוטפים במים מזוקקים זורמים למשך 2 דקות.
  11. הניחו את מחזיק המגלשה במיכל מלא באאוזין וכתם למשך 5 דקות.
  12. מעבירים את מחזיק המגלשה למיכל המלא באתנול 70% ושוטפים לזמן קצר (10 שניות).
  13. יש לייבש את המקטעים על ידי הנחת מחזיק השקופיות ברצף במיכלים המלאים בתמיסות הדרגתיות אתנול: 95% אתנול, 5 מטבלים; 100% אתנול, 5 מטבלים.
  14. נקה את השקופיות על-ידי הנחת מחזיק השקופיות במיכל מלא ב-100% קסילן למשך 3 דקות. יש לחזור על הדגירה באמצעות 100% קסילן טרי.
  15. הוציאו את המגלשה מהמדף, יבשו את האזור סביב הרקמות באמצעות מגבת נייר, ובהתאם לגודל הדגימה, הוסיפו טיפה אחת או שתיים של אמצעי הרכבה על בסיס קסילן על פני הדגימה. הרכבה על ידי הנחת כיסוי בעדינות על גבי מגלשת הזכוכית (היזהרו לא להשאיר בועות אוויר). לחץ בעדינות במידת הצורך. כל פני השטח של הזכוכית צריכים להיות מכוסים ואטומים.
  16. יבשו את המגלשות על ידי השארתן מתחת למכסה המנוע הכימי למשך הלילה. בדרך כלל, אמצעי ההרכבה מתמצק תוך פחות מ- 24 שעות. כדי להבטיח שהשקופיות יבשות, ניתן ליצור שקופית לדוגמה. בעזרת מגלשה ריקה, הניחו טיפה ממדיום ההרכבה והשאירו מתחת למכסה המנוע למשך הלילה. למחרת, געו בטיפה ובדקו אם היא מוצקה.
  17. כאשר המגלשות מתייבשות, לנתח את ההיסטולוגיה של הרקמות באמצעות מיקרוסקופ אור או מיקרוסקופ מתקדם יותר עם ערוץ שדה בהיר.
    1. הניחו שקופית מיקרוסקופ על הבמה, הזיזו עד שהדגימה נמצאת במרכז שדה הראייה, התאימו את הפוקוס באמצעות ידית הפוקוס, והשתמשו בעדשה אובייקטיבית בהגדלה של 10x ו/או 20x כדי לנתח את ההיסטולוגיה בהשוואה לרקמות בקרה (דמה מוקרן).
    2. אם המיקרוסקופ מצויד במצלמה, צלמו גם תמונות.
      הערה: ניתן לעצור את ההליך כאן; ניתן לאחסן את המגלשות בטמפרטורת החדר ולנתח אותן מאוחר יותר. אל תשאירו את המגלשות יותר מ-30 יום מכיוון שהכתמים דוהים לאיטם.

5. צביעה immunofluorescence

  1. קררו את הקלטות ההיסטולוגיות המכילות דגימות רקמה משובצות פרפין על ידי הנחתן על קרח למשך שעה אחת לפחות. בעזרת מיקרוטום מכינים מקטעים בעובי 5 מיקרומטר לצביעה. כל רקמה צריכה להיות פרוסה אופקית כדי לכסות את כל הדגימה המגולגלת.
    1. לאחר חיתוך בלוק הפרפין, מעבירים את חלקי הרקמה לאמבט מים המחומם ל -45 מעלות צלזיוס ומניחים את החלקים על שקופיות טעונות. השאירו את המגלשות על מדף למשך הלילה בטמפרטורת החדר לייבוש.
      הערה: ניתן לעצור את ההליך כאן, וניתן לאחסן את המגלשות בטמפרטורת החדר.
  2. מניחים את המגלשות במחזיק שקופיות ואופים בתנור של 18 מעלות למשך הלילה. את המגלשות ניתן לאפות לזמן קצר יותר, 1-2 שעות. עם זאת, זה לא מומלץ במקרה של טרי (פחות מ 1 חודש לפני) לחתוך שקופיות.
    הערה: הניחו את ערכת צביעת השקופיות הידנית מתחת למכסה המנוע הכימי ובצעו את הדגירות עם קסילן, אתנול ו-H 2 O2/מתנול מתחת למכסה המנוע הכימי.
  3. למחרת, קררו את המגלשות על ידי הכנסתן למחזיק שקופיות מתחת למכסה המנוע הכימי למשך 10 דקות.
  4. deparaffinize את הרקמות על ידי הנחת מחזיק שקופיות במיכל מלא 100% xylene במשך 3 דקות. יש לחזור על הדגירה באמצעות 100% קסילן טרי.
    הערה: מאותו רגע, ודא שהדגימות נשמרות רטובות בכל עת.
  5. להרוות peroxidase אנדוגני על ידי דגירה שקופיות במשך 30 דקות במיכל מלא 2% מי חמצן פתרון מתנול מתחת מכסה המנוע הכימי.
    אזהרה: מתיל אלכוהול הוא חומר שעלול להיות מסוכן: מסוכן בריאותית (H225-H301, H311, H331-H370), דליק (GHS02), וגורם לרעילות חריפה (דרך הפה, העור, שאיפה) (GHS08). מי חמצן הוא חומר מסוכן: קורוזיבי (GHS05) וגורם לרעילות חריפה (GHS07).
  6. יש לייבש מחדש את המקטעים בשיפוע אתנול על ידי הנחת מחזיק השקופיות ברצף במיכלים מלאים בתמיסות הבאות: 100% אתנול, 3 דקות; 95% אתנול, 3 דקות; 70% אתנול, 3 דקות
  7. מעבירים את מחזיק המגלשה למיכל מלא במים מזוקקים ושוטפים במים מזוקקים זורמים במשך 2 דקות.
  8. כדי לאחזר את האנטיגנים, העבר את מחזיק המגלשה למיכל עם 250 מ"ל של תמיסת חיץ ציטראט (10 mM נתרן ציטראט, 0.05% Tween-20, pH 6.0) ובשלו ב 110 ° C במשך 10 דקות באמצעות תא הסוואה.
  9. מעבירים את כל המיכל לחדר הקירור ומאפשרים קירור הדרגתי במשך 30 דקות.
  10. לאחר 30 דקות, החליפו את תמיסת חיץ הציטראט במים מזוקקים ושטפו במים מזוקקים זורמים עד להסרת כל חתיכות הפרפין הצפות.
  11. הוציאו את המגלשות מהמחזיק (אחת בכל פעם), הקישו על מגבת נייר וייבשו בזהירות את האזור סביב הדגימה במגבת נייר. צייר צורה סגורה סביב הדגימה באמצעות עט המספק מחסום הידרופובי (עט PAP). מניחים בחדר לח.
  12. יש לחסום עם אלבומין בסרום בקר 5% (BSA) ב-TBS-Tween על ידי הוספת 200 μL של התמיסה על פני השטח של הדגימה. ודא שאין דליפה. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C בתא לח למשך 30 דקות.
  13. הסר את פתרון החסימה על-ידי הקשה על שקופית הזכוכית על מגבת נייר. הניחו בחזרה בתא לח. יש להוסיף 100 μL מהריכוז המתאים של הנוגדנים הראשוניים המרחפים מחדש בחיץ חוסם ולדגור ב-4°C עם נדנוד עדין למשך הלילה. עבור BMI1/EYFP, השתמש בעוף נגד GFP (דילול 1:500); עבור Ki-67, השתמש ארנב anti-Ki-67 (דילול 1:200).
  14. הסר את תמיסת הנוגדנים על ידי הקשה על שקופית הזכוכית על מגבת נייר; מקם את השקופיות במחזיק שקופיות והעבר למכל המלא TBS-Tween. שטפו את המגלשות ברעד במשך 5 דקות. חזרו על הפעולה 3 פעמים. בכל פעם, השתמש בחלק טרי של מאגר TBS-Tween.
  15. הוציאו את המגלשות מהמחזיק (אחת בכל פעם), הסירו את עודפי תמיסת הכביסה על ידי הקשה על מגבת הזכוכית על מגבת נייר, והניחו בתא לח. הוסף 100 μL של הריכוז המתאים של נוגדנים משניים מרחפים מחדש בחיץ חוסם, ודגור ב 37 ° C במשך 30 דקות. נוגדנים משניים צריכים להיות מצומדים עם פלואורופור. עבור BMI1/EYFP, השתמש חמור נגד עוף Alexa Fluor 647 (דילול 1:500); עבור Ki-67, השתמש עז נגד ארנב Alexa Fluor 488 (דילול 1:500).
  16. הסר את תמיסת הנוגדנים על ידי הקשה על שקופית הזכוכית על מגבת נייר; מקם את השקופיות במחזיק שקופיות והעבר למכל המלא TBS-Tween. שטפו את המגלשות ברעד במשך 5 דקות. חזרו על הפעולה 3 פעמים. בכל פעם, השתמש בחלק טרי של מאגר TBS-Tween.
  17. הוציאו את המגלשות מהמחזיק (אחת בכל פעם), הסירו את עודפי תמיסת הכביסה על ידי הקשה על מגבת הזכוכית על מגבת נייר, והניחו בתא לח. הוסף 100 μL של תמיסת צביעת EdU שהוכנה על פי הוראות היצרן באמצעות Alexa Fluor 555 fluorophore.
  18. הסר את פתרון EdU על ידי הקשה על שקופית הזכוכית על מגבת נייר; מקם את השקופיות במחזיק שקופיות והעבר למכל המלא TBS-Tween. שטפו את המגלשות ברעד במשך 5 דקות. חזרו על הפעולה פעמיים. בכל פעם, השתמש בחלק טרי של מאגר TBS-Tween.
  19. הוציאו את השקופיות מהמחזיק (אחת בכל פעם); הסירו את עודפי תמיסת הכביסה על ידי הקשה על מגבת הזכוכית על מגבת נייר והניחו בתא לחות. בצע צביעה נגדית של Hoechst 33258 על ידי הוספת 100 μL של תמיסת Hoechst 33258 (דילול 1:1000 ב-TBS-Tween) על פני השטח של הדגימה. דוגרים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  20. הסר את הפתרון Hoechst 33258 על ידי הקשה על שקופית הזכוכית על מגבת נייר; מקם את השקופיות במחזיק שקופיות והעבר לגורם מכיל מלא TBS-Tween. שטפו את המגלשות ברעד במשך 5 דקות.
  21. הוציאו את המגלשה ממחזיק המגלשה, יבשו את האזור סביב הרקמות באמצעות מגבת נייר, ובהתאם לגודל הדגימה, הוסיפו טיפה אחת או שתיים של אמצעי הרכבה על בסיס מים על פני השטח של הדגימה. הרכבה על ידי הנחת כיסוי בעדינות על גבי מגלשת הזכוכית (היזהרו לא להשאיר בועות אוויר). לחץ בעדינות במידת הצורך. כל פני השטח של הזכוכית צריכים להיות מכוסים ואטומים.
  22. יבשו את המגלשות על ידי השארתן בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה. בדרך כלל, אמצעי ההרכבה מתמצקים תוך פחות מ- 24 שעות. כדי להבטיח שהשקופיות יבשות, ניתן ליצור שקופית לדוגמה. השתמש בשקופית ריקה; מניחים טיפה ממדיום ההרכבה ומשאירים מתחת למכסה המנוע למשך הלילה. למחרת, געו בטיפה ובדקו אם היא מוצקה.
  23. כאשר המגלשות מתייבשות, ניתן לנתח רקמות מוכתמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסנני אורך גל פליטה המאפשרים הדמיה של צביעת Ki-67, EdU ו- BMI1/EYFP (535 ננומטר, 646 ננומטר ו- 700 ננומטר, בהתאמה).
  24. הניחו שקופית מיקרוסקופ על הבמה, הזיזו עד שהדגימה נמצאת במרכז שדה הראייה, התאימו את המיקוד באמצעות ידית הפוקוס, והשתמשו בעדשת המטרה להגדלה של 10x ו/או 20x כדי לנתח את הצביעה בהשוואה לרקמות בקרה (הקרנת דמה). אם המיקרוסקופ מצויד במצלמה, ניתן לצלם גם תמונות. צלם תמונות עבור כל ערוץ בנפרד והתמזג מאוחר יותר.
    הערה: ניתן לעצור את ההליך כאן; ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4°C ולנתח אותן מאוחר יותר. אין לשמור את המגלשות יותר מ-14 יום מכיוון שהכתמים דוהים לאיטם.

6. צביעת טונל

  1. קררו את הקלטות ההיסטולוגיות המכילות דגימות רקמה משובצות פרפין על ידי הנחתן על קרח למשך שעה אחת לפחות. בעזרת מיקרוטום מכינים מקטעים בעובי 5 מיקרומטר לצביעה. כל רקמה צריכה להיות פרוסה אופקית כדי לכסות את כל הדגימה המגולגלת.
    1. לאחר חיתוך בלוק הפרפין, מעבירים את חלקי הרקמה לאמבט מים המחומם עד 45 מעלות צלזיוס ומניחים את החלקים על שקופיות טעונות. השאירו את המגלשות על מדף למשך הלילה בטמפרטורת החדר לייבוש.
      הערה: ניתן לעצור את ההליך כאן, וניתן לאחסן את המגלשות בטמפרטורת החדר.
  2. מניחים את המגלשות במחזיק שקופיות ואופים בתנור של 18 מעלות למשך הלילה.
    הערה: ניתן לאפות את המגלשות לזמן קצר יותר, 1-2 שעות. עם זאת, זה לא מומלץ במקרה של טרי (פחות מ 1 חודש לפני) לחתוך שקופיות. הניחו את ערכת צביעת השקופיות הידנית מתחת למכסה המנוע הכימי ובצעו את הדגירות עם קסילן ואתנול מתחת למכסה המנוע הכימי.
  3. למחרת, קררו את המגלשות על ידי הכנסתן למחזיק שקופיות מתחת למכסה המנוע הכימי למשך 10 דקות.
  4. deparaffinize את הרקמות על ידי הנחת מחזיק שקופיות במיכל מלא 100% xylene במשך 3 דקות. יש לחזור על הדגירה באמצעות 100% קסילן טרי.
    הערה: מנקודה זו, ודא שהדגימות נשמרות רטובות בכל עת.
  5. יש לייבש מחדש את המקטעים בשיפוע אתנול על ידי הנחת מחזיק המגלשות ברצף במיכלים מלאים בתמיסות הבאות: 100% אתנול, 3 דקות; 95% אתנול, 3 דקות; 90% אתנול, 3 דקות; 80% אתנול, 3 דקות; 70% אתנול, 3 דקות
  6. מעבירים את מחזיק המגלשה למיכל מלא במים מזוקקים ושוטפים במים מזוקקים זורמים למשך דקה.
  7. הוציאו את המגלשות מהמחזיק (אחת בכל פעם), הקישו על מגבת נייר וייבשו בזהירות את האזור סביב הדגימה במגבת נייר. צייר צורה סגורה סביב הדגימה באמצעות עט המספק מחסום הידרופובי (עט PAP). מניחים בחדר לח.
  8. יש לדגור עם פרוטאינאז K. להוסיף 100 μL של תמיסת פרוטאינאז K נטולת DNase (דילול 1:25 ב-DPBS) על פני השטח של הדגימה בתוך המחסום ההידרופובי. יש לדגור בטמפרטורת החדר בתא לח למשך 15 דקות.
    זהירות: פרוטאינאז K הוא חומר שעלול להיות מסוכן: סכנה בריאותית (H315 - H319 - H334).
  9. הסר את תמיסת פרוטאינאז K על ידי הקשה על שקופית הזכוכית על מגבת נייר; מקם את השקופיות במחזיק שקופיות והעבר לגורם מכיל מלא DPBS. שטפו את המגלשות ברעד במשך 5 דקות. חזרו על הפעולה פעמיים. בכל פעם, השתמש בחלק טרי של DPBS.
  10. הכינו את תערובת התגובה של TUNEL: ערבבו את תמיסת התווית (1x) עם תמיסת אנזימים (10x). פיפטה היטב.
  11. הוציאו את השקופיות מהמחזיק (אחת בכל פעם); הסירו את עודפי תמיסת הכביסה על ידי הקשה על מגבת הזכוכית על מגבת נייר והניחו בתא לחות. הוסף 50 μL של תערובת תגובת TUNEL על פני השטח של הדגימה ודגור בחושך ב 37 ° C בתא לח במשך 60 דקות. עבור בקרה שלילית, השתמש בפתרון תוויות בלבד (ללא TdT).
  12. הסר את תמיסת TUNEL על-ידי הקשה על שקופית הזכוכית על מגבת נייר; מקם את השקופיות במחזיק שקופיות והעבר לגורם מכיל מלא ב- DPBS. שטפו את המגלשות ברעד במשך 5 דקות. חזרו על הפעולה פעמיים. בכל פעם, השתמש בחלק טרי של DPBS.
  13. הוציאו את השקופיות מהמחזיק (אחת בכל פעם); הסירו את עודפי תמיסת הכביסה על ידי הקשה על מגבת הזכוכית על מגבת נייר והניחו בתא לחות. בצע צביעה נגדית של Hoechst 33258 על ידי הוספת 100 μL של תמיסת Hoechst 33258 (דילול 1:1000 ב-TBS-Tween) על פני השטח של הדגימה. דוגרים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  14. הסר פתרון Hoechst 33258 על ידי הקשה על שקופית הזכוכית על מגבת נייר; מקם את השקופיות במחזיק שקופיות והעבר לגורם מכיל מלא DPBS. שטפו את המגלשות ברעד במשך 5 דקות.
  15. הוצא את השקופית ממחזיק השקופיות; יבשו את האזור סביב הרקמות באמצעות מגבת נייר, ובהתאם לגודל הדגימה, הוסיפו טיפה אחת או שתיים של אמצעי הרכבה על בסיס מים על פני השטח של הדגימה. הרכבה על ידי הנחת כיסוי בעדינות על גבי מגלשת הזכוכית (היזהרו לא להשאיר בועות אוויר). לחץ בעדינות במידת הצורך. כל פני השטח של הזכוכית צריכים להיות מכוסים ואטומים.
  16. יבשו את המגלשות על ידי השארתן בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה. בדרך כלל, אמצעי ההרכבה מתמצק תוך פחות מ- 24 שעות. כדי להבטיח שהשקופיות יבשות, ניתן ליצור שקופית לדוגמה. מניחים טיפה ממדיום ההרכבה ומשאירים בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה. למחרת, געו בטיפה ובדקו אם היא מוצקה.
  17. כאשר המגלשות מתייבשות, ניתן לנתח רקמות מוכתמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסנני אורך גל פליטה המאפשרים הדמיה של צביעת טונל (535 ננומטר).
  18. הניחו שקופית מיקרוסקופ על הבמה, הזיזו עד שהדגימה נמצאת במרכז שדה הראייה, התאימו את הפוקוס באמצעות ידית הפוקוס, והשתמשו בעדשה אובייקטיבית בהגדלה של פי 10 ו/או 20x כדי לנתח את הצביעה בהשוואה לרקמות ביקורת (הקרנת דמה). אם המיקרוסקופ מצויד במצלמה, ניתן לצלם גם תמונות. צלם תמונות עבור כל ערוץ בנפרד והתמזג מאוחר יותר.
    הערה: ניתן לעצור את ההליך כאן; ניתן לאחסן שקופיות בטמפרטורה של 4°C ולנתח אותן מאוחר יותר. אין לשמור את המגלשות יותר מ-14 יום מכיוון שהכתמים דוהים לאיטם.

תוצאות

השימוש בקרינה הכוללת של 12 Gy (TBI) בשילוב עם מעקב אחר שושלת גנטית של מורין מאפשר ניתוח מעמיק של ההשלכות של פגיעה בקרינה במעיים. כדי להתחיל, Bmi1-CreER; עכברי Rosa26eYFP קיבלו זריקת טמוקסיפן יחידה, הגורמת לביטוי משופר של חלבון פלואורסצנטי צהוב (EYFP) באוכלוסיית תאי גזע מסוג Bmi1+ . יומיי...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר מודל חזק וניתן לשחזור של פגיעות קרינה. זה מאפשר ניתוח מדויק של השינויים אפיתל המעי במהלך 7 ימים לאחר הפציעה. חשוב לציין כי נקודות הזמן שנבחרו משקפות שלבים מכריעים של פציעה ומאופיינות בשינויים מובהקים במעי (שלבי פציעה, אפופטוזיס, התחדשות ונורמליזציה)60. מודל זה ?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לליבת המחקר ההיסטולוגיה של מרכז סטוני ברוק לסרטן על סיוע מומחה בהכנת דגימות רקמה ולמחלקה למשאבי חיות מעבדה באוניברסיטת סטוני ברוק על סיוע בטיפול וטיפול בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות DK124342 שהוענקו לאגניישקה ב. ביאלקובסקה ו- DK052230 לד"ר וינסנט ו. יאנג.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeBD309659-
16G Reusable Small Animal Feeding Needles: StraightVWR20068-630-
27G x 1/2" needleBD305109-
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringeCovidien1188128012-
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)Santa Cruz Biotechnologysc284628A10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered FormalinFisher Scientific22-026-213-
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JThe Jackson LaboratoryStrain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/JThe Jackson LaboratoryStrain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shockMillipore-Sigma3116956001
Chicken anti-GFPAvesGFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, InvitrogenThermo Fisher ScientificC10638-
Corn oilMillipore-SigmaC8267-
Decloaking ChamberBiocare MedicalDC2012-
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher BioReagentsBP231-100light sensitive
DNase-free proteinase KInvitrogenC10618Hdiluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647Jackson ImmunoResearch703-605-155
DPBSFisher Scientific21-031-CV-
EosinFisher ScientificS176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20XNikon
Fluoromount Aqueous Mounting MediumMillipore-SigmaF4680-25ML
Gamma Cell 40 ExactorBest Theratronics Ltd.-0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488Jackson ImmunoResearch111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3Millipore-SigmaGHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo ScientificFisher Scientific23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)Thermo Fisher ScientificH3569dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-603-252-
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)Millipore-Sigma11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificL119-5000.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mLVWR89215-218-
MethanolVWRBDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOFFisher ScientificNC1675398-
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS GradeCapitol ScientificAAP-281000ACSCSLT-
Rabbit anti-Ki67BioCare MedicalCRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting MediumFisher Scientific22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degreeFisher Scientific50-728-103
Sodium Citrate DihydrateFisher ScientificS279-500
Stainless Steel Dissecting KitVWR25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]VWR 48311-703
TamoxifenMillipore-SigmaT564830 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable HandleSakura4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile BladesSakura4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining SetSakura4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with LidSakura4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with LidSakura4457
Tween 20Millipore-SigmaP7949
Unisette Processing CassettesVWR87002-292-
VWR Micro Cover GlassesVWR48393-081
XyleneFisher ScientificX5P-1GAL

References

  1. Helander, H. F., Fandriks, L. Surface area of the digestive tract - Revisited. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 49 (6), 681-689 (2014).
  2. vander Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annual Review of Physiology. 71, 241-260 (2009).
  3. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
  4. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  5. Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 466-471 (2012).
  6. Liao, Z., Hu, C., Gao, Y. Mechanisms modulating the activities of intestinal stem cells upon radiation or chemical agent exposure. Journal of Radiation Research. 63 (2), 149-157 (2022).
  7. Meyer, A. R., Brown, M. E., McGrath, P. S., Dempsey, P. J. Injury-Induced Cellular Plasticity Drives Intestinal Regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (3), 843-856 (2022).
  8. Owens, B. M., Simmons, A. Intestinal stromal cells in mucosal immunity and homeostasis. Mucosal Immunology. 6 (2), 224-234 (2013).
  9. Barker, N. Adult intestinal stem cells: Critical drivers of epithelial homeostasis and regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 19-33 (2014).
  10. Cheng, H., Origin Leblond, C. P. differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine. V. Unitarian Theory of the origin of the four epithelial cell types. The American Journal of Anatomy. 141 (4), 537-561 (1974).
  11. Sender, R., Milo, R. The distribution of cellular turnover in the human body. Nature Medicine. 27 (1), 45-48 (2021).
  12. Metcalfe, C., Kljavin, N. M., Ybarra, R., de Sauvage, F. J. Lgr5+ stem cells are indispensable for radiation-induced intestinal regeneration. Cell Stem Cell. 14 (2), 149-159 (2014).
  13. Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
  14. Tirado, F. R., et al. Radiation-induced toxicity in rectal epithelial stem cell contributes to acute radiation injury in rectum. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 63 (2021).
  15. Tetteh, P. W., Farin, H. F., Clevers, H. Plasticity within stem cell hierarchies in mammalian epithelia. Trends in Cell Biology. 25 (2), 100-108 (2015).
  16. Breault, D. T., et al. Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (30), 10420-10425 (2008).
  17. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 179-184 (2011).
  18. Orzechowska, E. J., Katano, T., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Interplay among p21(Waf1/Cip1), MUSASHI-1 and Kruppel-like factor 4 in activation of Bmi1-Cre(ER) reserve intestinal stem cells after gamma radiation-induced injury. Scientific Reports. 10 (1), 18300 (2020).
  19. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  20. Wong, V. W., et al. Lrig1 controls intestinal stem-cell homeostasis by negative regulation of ErbB signalling. Nature Cell Biology. 14 (4), 401-408 (2012).
  21. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  22. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  23. Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
  24. Castillo-Azofeifa, D., et al. Atoh1(+) secretory progenitors possess renewal capacity independent of Lgr5(+) cells during colonic regeneration. The EMBO Journal. 38 (4), 99984 (2019).
  25. Van Landeghem, L., et al. Activation of two distinct Sox9-EGFP-expressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (10), 1111-1132 (2012).
  26. Roche, K. C., et al. SOX9 maintains reserve stem cells and preserves radioresistance in mouse small intestine. Gastroenterology. 149 (6), 1553-1563 (2015).
  27. Barriga, F. M., et al. Mex3a marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  28. May, R., et al. Brief report: Dclk1 deletion in tuft cells results in impaired epithelial repair after radiation injury. Stem Cells. 32 (3), 822-827 (2014).
  29. Tetteh, P. W., et al. Replacement of lost Lgr5-positive stem cells through plasticity of their enterocyte-lineage daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
  30. Bohin, N., et al. Rapid crypt cell remodeling regenerates the intestinal stem cell niche after Notch inhibition. Stem Cell Reports. 15 (1), 156-170 (2020).
  31. Li, N., et al. Single-cell analysis of proxy reporter allele-marked epithelial cells establishes intestinal stem cell hierarchy. Stem Cell Reports. 3 (5), 876-891 (2014).
  32. van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  33. Durand, A., et al. Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (23), 8965-8970 (2012).
  34. Hayakawa, Y., et al. BHLHA15-positive secretory precursor cells can give rise to tumors in intestine and colon in mice. Gastroenterology. 156 (4), 1066-1081 (2019).
  35. Yan, K. S., et al. Intestinal enteroendocrine lineage cells possess homeostatic and injury-inducible stem cell activity. Cell Stem Cell. 21 (1), 78-90 (2017).
  36. Chandrakesan, P., et al. Intestinal tuft cells regulate the ATM mediated DNA damage response via Dclk1 dependent mechanism for crypt restitution following radiation injury. Scientific Reports. 6, 37667 (2016).
  37. Yu, S., et al. Paneth cell multipotency induced by Notch activation following Injury. Cell Stem Cell. 23 (1), 46-59 (2018).
  38. Moussa, L., et al. Bowel radiation injury: Complexity of the pathophysiology and promises of cell and tissue engineering. Cell Transplantation. 25 (10), 1723-1746 (2016).
  39. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
  40. Tam, S. Y., Wu, V. W. C. A review on the special radiotherapy techniques of colorectal cancer. Frontiers in Oncology. 9, 208 (2019).
  41. Shadad, A. K., Sullivan, F. J., Martin, J. D., Egan, L. J. Gastrointestinal radiation injury: Symptoms, risk factors and mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 19 (2), 185-198 (2013).
  42. Serrano Martinez, P., Giuranno, L., Vooijs, M., Coppes, R. P. The radiation-induced regenerative response of adult tissue-specific stem cells: Models and signaling pathways. Cancers. 13 (4), 855 (2021).
  43. Stacey, R., Green, J. T. Radiation-induced small bowel disease: Latest developments and clinical guidance. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 5 (1), 15-29 (2014).
  44. Pan, Y. B., Maeda, Y., Wilson, A., Glynne-Jones, R., Vaizey, C. J. Late gastrointestinal toxicity after radiotherapy for anal cancer: A systematic literature review. Acta Oncologica. 57 (11), 1427-1437 (2018).
  45. Elhammali, A., et al. Late gastrointestinal tissue effects after hypofractionated radiation therapy of the pancreas. Radiation Oncology. 10, 186 (2015).
  46. You, S. H., Cho, M. Y., Sohn, J. H., Lee, C. G. Pancreatic radiation effect in apoptosis-related rectal radiation toxicity. Journal of Radiation Research. 59 (5), 529-540 (2018).
  47. Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29 (2015).
  48. Snider, A. J., et al. Murine model for colitis-associated cancer of the colon. Methods in Molecular Biology. 1438, 245-254 (2016).
  49. Clapper, M. L., Cooper, H. S., Chang, W. C. Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia: A promising model for the development of chemopreventive interventions. Acta Pharmacologica Sinica. 28 (9), 1450-1459 (2007).
  50. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).
  51. Fujimichi, Y., Otsuka, K., Tomita, M., Iwasaki, T. Ionizing radiation alters organoid forming potential and replenishment rate in a dose/dose-rate dependent manner. Journal of Radiation Research. 63 (2), 166-173 (2022).
  52. Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4alpha as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
  53. Nagle, P. W., Coppes, R. P. Current and future perspectives of the use of organoids in radiobiology. Cells. 9 (12), 2649 (2020).
  54. Taelman, J., Diaz, M., Guiu, J. Human Intestinal Organoids: Promise and Challenge. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854740 (2022).
  55. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).
  56. Kuruvilla, J. G., et al. Kruppel-like factor 4 modulates development of BMI1(+) intestinal stem cell-derived lineage following gamma-radiation-induced gut injury in mice. Stem Cell Reports. 6 (6), 815-824 (2016).
  57. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nature Genetics. 40 (7), 915-920 (2008).
  58. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
  59. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
  60. Booth, C., Tudor, G., Tudor, J., Katz, B. P., MacVittie, T. J. Acute gastrointestinal syndrome in high-dose irradiated mice. Health Physics. 103 (4), 383-399 (2012).
  61. Lu, L., Jiang, M., Zhu, C., He, J., Fan, S. Amelioration of whole abdominal irradiation-induced intestinal injury in mice with 3,3'-Diindolylmethane (DIM). Free Radical Biology & Medicine. 130, 244-255 (2019).
  62. Karlsson, J. A., Andersen, B. L. Radiation therapy and psychological distress in gynecologic oncology patients: Outcomes and recommendations for enhancing adjustment. Journal of Psychosomatic Obstetrics & Gynecology. 5 (4), 283-294 (1986).
  63. Yang, J., Cai, H., Xiao, Z. X., Wang, H., Yang, P. Effect of radiotherapy on the survival of cervical cancer patients: An analysis based on SEER database. Medicine. 98 (30), 16421 (2019).
  64. Giroux, V., et al. Mouse intestinal Krt15+ crypt cells are radio-resistant and tumor initiating. Stem Cell Reports. 10 (6), 1947-1958 (2018).
  65. Kim, C. K., et al. Kruppel-like factor 5 regulates stemness, lineage specification, and regeneration of intestinal epithelial stem cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 587-609 (2020).
  66. Sheng, X., et al. Cycling stem cells are radioresistant and regenerate the intestine. Cell Reports. 32 (4), 107952 (2020).
  67. Gross, S., et al. Nkx2.2 is expressed in a subset of enteroendocrine cells with expanded lineage potential. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (12), 975-987 (2015).
  68. Sato, T., et al. Characterization of radioresistant epithelial stem cell heterogeneity in the damaged mouse intestine. Scientific Reports. 10 (1), 8308 (2020).
  69. Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7 (6), 38965 (2012).
  70. Bohin, N., et al. Insulin-like growth factor-1 and mTORC1 signaling promote the intestinal regenerative response after irradiation injury. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (4), 797-810 (2020).
  71. Romesser, P. B., et al. Preclinical murine platform to evaluate therapeutic countermeasures against radiation-induced gastrointestinal syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (41), 20672-20678 (2019).
  72. Gu, J., et al. At what dose can total body and whole abdominal irradiation cause lethal intestinal injury among C57BL/6J mice. Dose Response. 18 (3), 1559325820956783 (2020).
  73. Huh, W. J., et al. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
  74. Keeley, T. M., Horita, N., Samuelson, L. C. Tamoxifen-induced gastric injury: Effects of dose and method of administration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 365-367 (2019).
  75. Bohin, N., Carlson, E. A., Samuelson, L. C. Genome toxicity and impaired stem cell function after conditional activation of CreER(T2) in the intestine. Stem Cell Reports. 11 (6), 1337-1346 (2018).
  76. Boynton, F. D. D., Ericsson, A. C., Uchihashi, M., Dunbar, M. L., Wilkinson, J. E. Doxycycline induces dysbiosis in female C57BL/6NCrl mice. BMC Research Notes. 10 (1), 644 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved