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요약

위장관은 방사선 치료 암 치료 시 손상에 가장 민감한 기관 중 하나입니다. 그것은 동시에 그러한 모욕에 이어 가장 높은 재생 능력 중 하나를 가진 장기 시스템입니다. 제시된 프로토콜은 장 상피의 재생 능력을 연구하는 효율적인 방법을 설명합니다.

초록

장 상피는 단일 층의 세포로 구성되어 있지만 장 선와(intestinal crypt)의 바닥에 위치한 장 줄기 세포의 활성 증식에 의해 생성되는 여러 유형의 말기 분화 세포를 포함합니다. 그러나 급성 장 손상이 발생하는 동안 이러한 활성 장 줄기 세포는 세포 사멸을 겪습니다. 감마선 조사는 널리 사용되는 대장암 치료제로, 치료적으로는 효과적이지만 활성 줄기 세포 풀을 고갈시키는 부작용이 있습니다. 실제로 환자들은 방사선 치료를 받는 동안 부분적으로 활성 줄기 세포 고갈로 인해 위장 방사선 증후군을 자주 경험합니다. 장 선와에서 활성 장 줄기 세포의 손실은 일반적으로 정지 상태의 예비 장 줄기 세포 풀을 활성화하고 분비 및 장 세포 전구체 세포의 탈분화를 유도합니다. 이러한 세포가 아니라면 장 상피는 방사선 요법 및 기타 주요 조직 손상으로부터 회복하는 능력이 부족할 것입니다. 계통 추적 기술의 새로운 발전은 재생 중 세포의 활성화, 분화 및 이동을 추적할 수 있게 해주며, 장에서 이를 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 본 연구는 방사선 손상 후 마우스 장 상피 내 세포를 분석하는 방법을 제시하는 것을 목적으로 한다.

서문

인간의 장 상피는 완전히 평평하게 놓으면 배드민턴 코트의 절반 표면을 덮을 것입니다1. 대신, 인간의 내장 내용물을 분리하는 이 단일 세포층은 일련의 손가락 모양의 돌기, 융모 및 움푹 들어간 곳, 장의 표면적을 최대화하는 선와로 압축됩니다. 상피의 세포는 crypt-villus 축을 따라 분화합니다. 융모는 주로 영양소를 흡수하는 장세포, 점액을 분비하는 잔 세포, 호르몬을 생성하는 장내분비 세포로 구성되며, 선와(crypt)는 주로 디펜신 생성 파네스 세포, 활성 및 예비 줄기 세포, 전구 세포 2,3,4,5로 구성됩니다. 또한, 이들 세포가 밑에 있는 중간엽 구획의 기질 및 면역 세포 및 내강의 미생물군과 갖는 양방향 통신은 장 항상성을 유지하고 손상 후 회복에 중요한 복잡한 상호 작용 네트워크를 생성합니다 6,7,8.

장 상피는 인체에서 가장 빠르게자가 재생되는 조직이며 회전율은 2-6 일 9,10,11입니다. 항상성 동안, 류신이 풍부한 반복 함유 G-단백질 결합 수용체 5(LGR5)의 발현으로 특징지어지는 장 선와(orbit base columnar cells)의 기저부에 있는 활성 줄기 세포는 빠르게 분열하여 다른 모든 장 상피 계통으로 분화하는 전구 세포를 제공합니다. 그러나, 이들의 높은 유사분열 속도 때문에, 활성 줄기 세포 및 이들의 직계 전구체는 감마선 손상에 특히 민감하며, 방사선 조사후 세포자멸사를 겪는다 5,12,13,14. 소실되면 장내 선와(異聓) 내의 예비 줄기세포와 비줄기세포(전구체 및 일부 말기 분화된 세포의 소집단)가 활성화되어 기저음와구획(basal crypt compartment)을 보충하여 융모의 세포군을 재구성하여 장 상피(intestinal epithelium)를 재생시킨다15. 혈통 추적 기술을 사용하여 여러 연구 그룹은 예비 (정지) 줄기 세포가 활성 줄기 세포 13,16,17,18,19,20,21,22의 손실시 재생을 지원할 수 있음을 입증했습니다. 이 세포는 폴리콤 복합 단백질 1 종양 유전자(Bmi1), 마우스 텔로머라제 역전사 효소 유전자(mTert), 홉 호메오박스(Hopx) 및 류신이 풍부한 반복 단백질 1 유전자(Lrig1)의 존재를 특징으로 합니다. 또한, 비 줄기 세포는 손상 23,24,25,26,27,28,29,30,31시 장 선와를 보충 할 수 있음이 밝혀졌습니다. 특히, 분비 세포 및 장 세포의 전구 세포는 손상시 탈분화를 겪고, 줄기 유사 세포로 되돌아 가며, 장 상피의 재생을 지원하는 것으로 나타났다. 최근 연구에서는 손상 시 줄기와 유사한 특성을 획득할 수 있는 능력을 가진 여러 마커(예: DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)를 발현하는 세포를 확인했습니다.32,33,34,35,36. 놀랍게도, Yu et al. 성숙한 파네스 세포(LYZ+)도 장 재생에 기여할 수 있음을 보여주었다37. 또한, 방사선 조사는 장 상피 세포의 세포 사멸을 유발하고 상피 장벽 기능을 방해하는 것 외에도 장내 세균총의 dysbiosis, 면역 세포 활성화 및 전 염증 반응의 시작, 중간 엽 및 기질 세포의 활성화를 초래합니다38,39.

감마선은 암 치료, 특히 결장직장 종양의 경우 귀중한 치료 도구이다40. 그러나 방사선 조사는 세포 손상을 유도하여 장 항상성에 큰 영향을 미치고, 이는 세포 사멸을 유발합니다. 방사선 노출은 환자의 회복을 늦추는 다중 섭동을 유발하며 급성기의 점막 손상 및 염증과 장기간의 설사, 요실금, 출혈 및 복통으로 표시됩니다. 이러한 증상의 파노라마를 위장 방사선 독성이라고 합니다. 또한, 경벽 섬유증 및/또는 혈관 경화증의 방사선 유발 진행은 치료 후 몇 년 후에 나타날 수 있습니다38,41. 손상 자체와 동시에, 방사선은 재생을 시작하고 조율하는 신호 전달 경로를 활성화하는 장 세포에서 복구 반응을 유도합니다42. 방사선 유발 소장 질환은 다른 장기 (예 : 자궁 경부, 전립선, 췌장, 직장)에 제공되는 골반 또는 복부 방사선 요법으로 인해 발생할 수 있습니다 41,43,44,45,46. 따라서 장 방사선 조사 손상은 중요한 임상적 문제이며 결과적인 병태생리학에 대한 더 나은 이해는 방사선 요법과 관련된 위장 합병증을 완화하기 위한 중재의 개발을 진전시킬 가능성이 있습니다. 방사선 외에 장 상피의 재생 목적을 조사할 수 있는 다른 기술이 있습니다. 염증 및 그 후의 재생을 연구하기 위한 형질전환 및 화학적 쥐 모델이 개발되었다47. 덱스트란 황산나트륨(DSS)은 장에서 염증을 유발하고 염증성 장 질환과 유사한 특성을 발달시킨다48. DSS 치료와 발암 성 화합물 인 아족시 메탄 (AOM)의 조합은 대장염 관련 암의 발병을 초래할 수 있습니다48,49. 허혈 재관류 유발 손상은 장 상피의 재생 가능성을 연구하는 데 사용되는 또 다른 방법입니다. 이 기술은 경험과 외과 지식이 필요합니다50. 또한, 앞서 언급 한 기술은 방사선과 다른 유형의 부상을 유발하고 다른 재생 메커니즘의 개입으로 이어질 수 있습니다. 또한 이러한 모델은 시간이 많이 걸리고 방사선 기술은 상당히 간단합니다. 최근, 장 재생의 기전을 연구하기 위해 장과 결장에서 생성된 엔테로이드와 콜로노이드를 방사선 손상과 병용하여 사용하는 시험관 내 방법이 사용되고 있다51,52. 그러나 이러한 기술은 그들이 모델링하는 기관을 완전히 요약하지 않습니다53,54.

제시된 프로토콜에는 타목시펜 치료 후 예비 줄기 세포 집단(Bmi1-CreER; Rosa26eYFP입니다. 이 모델은 12 Gy 전신 방사선 조사를 이용하는데, 이는 예비 줄기 세포를 활성화시키기에 충분히 상당한 장 손상을 유도하는 동시에 손상 후 7일 이내에 장 재생 능력의 후속 조사를 허용한다55.

프로토콜

모든 마우스는 스토니 브룩 대학 (Stony Brook University)의 실험실 동물 자원 부서 (DLAR)에 수용되었습니다. Stony Brook University IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)는 동물 피험자와 관련된 모든 연구와 절차를 승인했습니다. 동물 피험자를 대상으로 한 실험은 승인된 동물 취급 프로토콜(IACUC #245094)에 따라 엄격하게 수행되었습니다.

참고: 마우스 균주 B6;129-Bmi1 tm1(cre/ERT)Mrc/J(Bmi1-Cre ER) 및 B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J(Rosa26eYFP)를 상업적으로 얻고(재료 표 참조) Bmi1-Cre ER을 얻기 위해 교차했습니다. Rosa26eYFP (Bmi1ctrl) 마우스는 앞서 기술한 바와 같이56,57,58.

1. Bmi1-Cre ER의 주택; Rosa26 eYFP 마우스

  1. 68-72°F 범위의 온도와 30-70-70% 범위의 습도에서 물과 일반 차우 임의로 12시간/12시간 명암 주기로 동물 시설에 마우스를 보관하십시오.
  2. 실험에 앞서, 표준 PCR 유전자형 분석 기법57,58을 사용하여 마우스 유전자형을 확인하였다.

2. 동물 및 재료의 준비

  1. 마우스가 순응할 수 있도록 실험 최소 7일 전에 마우스를 실험 수용실로 옮깁니다.
  2. 성별과 연령에 따라 실험 동물과 대조 동물을 일치시킵니다.
  3. 대조군 동물은 타목시펜 유도 Cre 매개 재조합에 노출되지만 방사선 조사(가짜 처리, 0 Gy)는 하지 않도록 하면서 실험 동물이 타목시펜 주사를 받고 감마선 조사에 노출되도록 합니다.
  4. 타목시펜 용액을 준비하십시오. 멸균 옥수수 기름에 타목시펜 분말을 30mg/mL 농도로 재현탁합니다. 60% 진폭으로 30초 ON 및 30초 OFF 주기로 3분 동안 초음파 처리한 다음 실온(RT)에서 1시간 동안 어둠 속에서 회전합니다. 타목시펜 용액은 -20 °C에서 동결 할 수 있지만 두 번 이상 동결 / 해동하지 마십시오. 가급적이면 매번 신선한 용액을 준비하고 보관하지 마십시오.
    참고: 타목시펜은 빛에 민감합니다. 실온 회전 중에 은박지로 싸십시오.
    주의 : 타목시펜은 잠재적으로 위험한 물질입니다 : 건강 위험 (GHS08) 및 환경 위험 (GHS09).
  5. 5-ethynyl-2′-deoxyuridine(EdU) 원액을 준비합니다. 멸균 디메틸 설폭사이드(DMSO) 총 부피의 1/5에 EdU 분말을 재현탁하고 멸균 초순수 총 부피의 나머지 4/5를 천천히 추가합니다. 완전히 용해되면 분취액을 하고 -20°C에서 보관합니다.
    주의 : 5-ethynyl-2′-deoxyuridine(EdU) 및 dimethyl sulfoxide(DMSO)는 잠재적으로 위험한 물질입니다: 건강 위험(각각 H340 및 H631, H227, H315 및 H319). EdU는 유전적 결함을 유발할 수 있으며 생식 능력이나 태아에게 해를 끼칠 수 있다고 의심되며 DMSO는 피부와 눈에 자극을 줄 수 있습니다.
  6. 조직 수집 및 고정을 위한 시약 준비: 에탄올을 희석하여 70% 수용액, DPBS를 4°C로 냉각하고, 변형된 부인 고정 완충액(증류된H2O중 50% 에탄올 및 5% 아세트산) 및 10% 완충 포르말린을 준비합니다.
    주의: 에틸 알코올은 잠재적으로 위험한 물질입니다: 건강 위험(H225-H319), 인화성(GHS02) 및 급성 독성(GHS07)을 유발합니다. 아세트산은 건강 위험(H226-H314), 인화성(GHS02) 및 부식성(GHS05)과 같은 잠재적으로 위험한 물질입니다. 포르말린은(는) 잠재적으로 위험한 물질입니다: 건강 유해(H350, H315, H317, H318, H370) 및 부식성. 포르말린은 암, 피부 및 눈 자극, 장기 손상 및 알레르기성 피부 반응을 유발할 수 있습니다.
  7. 승인된 방법에 따라 안락사에 필요한 장비(예:CO2 챔버), 마우스 해부 키트(가위, 집게), 페트리 접시, 10mL 주사기에 부착된 16G 위관영양식 바늘을 준비하여 내장을 세척합니다.

3. 전신 감마선 조사(TBI) 및 조직 채취

  1. 감마선 노출 이틀 전에 실험 동물에게 단일 용량의 타목시펜을 주사하여 Cre 매개 재조합 및 BMI1/EYFP+ 세포 계통 추적을 유도합니다. 각 동물의 무게를 측정하고 옥수수 기름에 재현 된 타목시펜의 체중 kg 당 40mg의 용량을 계산합니다. 70% 에탄올로 복부를 소독하고 1mL 주사기에 부착된 27G 바늘을 사용하여 타목시펜을 복강 투여합니다.
  2. 잠재적인 타목시펜 독성을 배제하기 위해 다음 48시간 동안 동물을 관찰하십시오.
  3. 지역 기관에서 지정한 대로 마우스를 조사실로 옮깁니다.
  4. 현재 exactor 선량률에 따라 137Cs 소스에 의해 방출되는 방사선 노출 시간을 계산하십시오. 예를 들어, 현재 선량률이 75.9rad/min(0.759Gy min-1 = 75.9cGy m-1)인 경우 노출 시간(분)은 원하는 선량/0.759로 계산됩니다. 동물에게 12Gy TBI의 선량으로 조사하기 위해 노출 시간은 ~15.81분(15분 48초)입니다.
  5. 감마선 조사기에서 샘플 챔버를 70% 에탄올 용액으로 소독합니다. 흡수 매트와 동물을 샘플 챔버 안에 놓습니다.
    참고: 가짜 처리된 동물은 방사선 조사실에 두어야 하지만 감마선에 노출되지 않아야 합니다.
  6. 뚜껑을 덮고 챔버를 닫습니다.
  7. 동물을 12Gy TBI에 노출시키도록 감마선 조사기를 프로그래밍합니다.
    1. 키를 START 위치로 돌려 기기를 켭니다.
    2. 숫자 키보드를 사용하여 운영자 번호를 입력하고 ENTER를 눌러 확인합니다.
    3. 숫자 키보드를 사용하여 PIN 번호를 입력하고 ENTER를 눌러 확인합니다.
    4. 옵션을 보려면 1 을 누릅니다.
    5. 타이머 설정을 위해 1 을 누릅니다.
    6. 조사 시간은 1 을 누릅니다.
    7. 숫자 키보드(hh:mm:ss 형식)를 사용하여 다음 주기에 대한 타이머 설정을 입력하고 ENTER를 눌러 확인합니다.
    8. ENTER를 눌러 설정을 한 번 더 확인합니다.
    9. CLEAR 2x를 눌러 홈 메뉴로 돌아갑니다.
    10. START를 눌러 노출을 시작합니다.
  8. 활성 노출 시간 동안 방을 나가십시오. 미리 설정된 시간이 경과하면 기계가 자동으로 멈추고 신호음이 울리기 시작합니다.
    주의 : 세슘 -137 (137Cs)은 치명적인 유해 물질 (건강 위험 : H314)입니다. 다량의 137C에 외부 노출되면 화상, 급성 방사선 질환 및 사망까지 유발할 수 있습니다.
  9. 키를 STOP 위치로 돌려 기기를 끕니다.
  10. 샘플 챔버를 열고 뚜껑을 열고 동물을 케이지로 다시 옮기고 샘플 챔버를 70% 에탄올 용액으로 소독합니다.
  11. 동물을 기존의 주거실로 다시 옮기고 치료 후 상태를 관찰합니다.
  12. 매일 동물의 체중을 모니터링하고 시작 체중의 15%를 초과하는 웰빙 변화, 고통 또는 체중 감소 증상이 관찰되면 즉시 안락사시킵니다(계획된 시점에도 불구하고).
  13. 계획된 안락사 3시간 전에 복부를 소독하고 28G 인슐린 주사기를 사용하여 마우스에 100μL의 EdU 원액을 주사합니다(복강 내 투여).
  14. 방사선 조사 후 0시간, 3시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 168시간에 근위 장을 수집합니다.
    1. 가정 기관의 기준에 따라 CO2 안락사를 수행하십시오.
      주의 : 이산화탄소는 유해 물질(H280)입니다. 압력 하에서 가스를 포함합니다. 가열하면 폭발할 수 있음. 산소를 대체하고 급격한 질식을 유발할 수 있음.
    2. 그런 다음 소장의 근위 부분을 해부하고, 부착된 조직을 제거하고, 10mL 주사기에 부착된 16G 직선 공급 바늘을 사용하여 차가운 DPBS로 플러시하고, 10mL 주사기에 부착된 16G 직선 공급 바늘을 사용하여 변형된 Bouin's fixative buffer로 고정하고, 세로로 절단하고, 앞서 설명한바와 같이 swiss-roll 기술을 사용하여 근위 장을 굴립니다.
  15. 조직을 조직 학적 카세트에 넣고 10 % 완충 포르말린이 들어있는 용기에 실온에서 24-48 시간 동안 방치합니다. 포르말린의 부피는 조직 학적 카세트를 완전히 덮기에 충분해야합니다. 배양 시간이 경과하면 집게를 사용하여 조직 학적 카세트를 70 % 에탄올로 채워진 용기에 옮깁니다. 그런 다음 조직 파라핀 포매를 진행합니다.
    참고: 조직 파라핀 포매는 Stony Brook University의 Research Histology Core Laboratory에서 수행했습니다. 여기서 절차를 중지 할 수 있으며 파라핀 블록을 실온에서 보관할 수 있습니다.
    주의 : 포르말린은(는) 잠재적으로 위험한 물질입니다: 건강 위험(H350, H315, H317, H318, H370) 및 부식성. 포르말린은 암, 피부 및 눈 자극, 장기 손상 및 알레르기성 피부 반응을 유발할 수 있습니다.

4. 조직학적 분석

  1. 파라핀이 포함된 조직 표본이 들어 있는 조직학적 카세트를 최소 1시간 동안 얼음 위에 올려 놓아 식힙니다. 마이크로톰을 사용하여 염색을 위해 5μm 두께의 절편을 준비합니다. 모든 조직은 압연된 전체 표본을 덮기 위해 수평으로 슬라이스되어야 합니다.
    1. 파라핀 블록을 절단한 후, 조직 절편을 45°C까지 예열된 수조로 옮기고, 절편을 충전된 슬라이드 상에 놓는다. 슬라이드를 실온에서 밤새 랙에 두어 건조시킵니다.
      알림: 여기에서 절차를 중지할 수 있으며 슬라이드를 실온에서 보관할 수 있습니다.
  2. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 65°C 오븐에서 밤새 굽습니다. 슬라이드는 1-2시간의 짧은 시간 동안 구울 수 있습니다. 그러나 갓 (1 개월 미만) 절단 된 슬라이드의 경우에는 권장하지 않습니다.
    알림: 수동 슬라이드 염색 세트를 화학 후드 아래에 놓고 화학 후드 아래에서 자일렌, 에탄올 및 헤마톡실린으로 배양을 수행합니다.
  3. 다음날 슬라이드를 화학 후드 아래의 슬라이드 홀더에 10분 동안 넣어 식힙니다.
  4. 슬라이드 홀더를 100% 자일렌으로 채워진 용기에 3분 동안 넣어 조직을 탈파라핀화합니다. 신선한 100% 자일렌을 사용하여 배양을 반복합니다.
    알림: 그 순간부터 표본이 항상 젖어 있는지 확인하십시오.
    주의: 크실렌은 인화성(GHS02), 급성 독성(GHS07) 및 건강 위험(H226 - H304 - H312 + H332 - H315 - H319 - H335 - H373 - H412)과 같은 잠재적으로 위험한 물질입니다. 잠재적인 유해 영향은 삼키거나 기도로 들어가면 치명적이며 피부, 눈 및 호흡기 자극을 유발할 수 있다는 것입니다. 또한 졸음이나 현기증을 유발하여 운동 기능에 영향을 미칠 수 있으며 장기간 또는 반복적으로 노출될 경우 장기 손상을 일으킬 수 있습니다.
  5. 슬라이드 홀더를 다음 용액으로 채워진 용기에 순차적으로 배치하여 에탄올 구배에서 섹션을 재수화합니다: 100% 에탄올, 2분; 95% 에탄올, 2분; 70% 에탄올, 2분
  6. 슬라이드 홀더를 증류수가 채워진 용기에 옮기고 흐르는 증류수로 2분 동안 헹굽니다.
  7. 헤마톡실린 용액으로 채워진 용기에 슬라이드 홀더를 놓고 5분 동안 염색합니다(화학 후드 아래).
  8. 슬라이드 홀더를 수돗물이 채워진 용기로 옮기고 일반적으로 2분 후에 헤마톡실린 염색이 푸르스름해질 때까지 흐르는 수돗물로 헹굽니다.
  9. 슬라이드 홀더를 5%(w/v) 탄산리튬 용액으로 채워진 용기로 옮깁니다. 10배 딥.
    주의: 탄산리튬은(는) 급성 독성(GHS07) 및 건강 위험(H302 - H319)을 유발할 수 있는 잠재적으로 위험한 물질입니다. 삼키면 유해하고 피부에 닿으면 유해하며 심각한 눈 자극을 유발합니다.
  10. 슬라이드 홀더를 증류수가 채워진 용기에 옮기고 흐르는 증류수로 2분 동안 헹굽니다.
  11. 슬라이드 홀더를 에오신이 채워진 용기에 넣고 5분 동안 얼룩지게 합니다.
  12. 슬라이드 홀더를 70% 에탄올로 채워진 용기에 옮기고 짧게(10초) 헹굽니다.
  13. 슬라이드 홀더를 에탄올 구배 용액으로 채워진 용기에 순차적으로 배치하여 섹션을 탈수합니다: 95% 에탄올, 5 딥; 100 % 에탄올, 5 딥.
  14. 슬라이드 홀더를 100% 자일렌으로 채워진 용기에 3분 동안 넣어 슬라이드를 청소합니다. 신선한 100% 자일렌을 사용하여 배양을 반복합니다.
  15. 랙에서 슬라이드를 꺼내 종이 타월을 사용하여 티슈 주변을 건조시키고 시편의 크기에 따라 시편 표면에 자일렌 기반 장착 매체를 한두 방울 떨어뜨립니다. 유리 슬라이드 위에 커버슬립을 부드럽게 올려 장착합니다(기포가 남지 않도록 주의). 필요한 경우 부드럽게 누르십시오. 유리의 전체 표면을 덮고 밀봉해야 합니다.
  16. 슬라이드를 화학 후드 아래에 밤새 두어 건조시킵니다. 일반적으로 장착 매체는 24시간 이내에 응고됩니다. 슬라이드가 건조한지 확인하기 위해 샘플 슬라이드를 만들 수 있습니다. 빈 슬라이드를 사용하여 장착 매체를 한 방울 떨어뜨리고 화학 후드 아래에 밤새 그대로 두십시오. 다음날 방울을 터치하여 굳었는지 확인합니다.
  17. 슬라이드가 마르면 광학 현미경 또는 명시야 채널이 있는 고급 현미경을 사용하여 조직의 조직학을 분석합니다.
    1. s에 현미경 슬라이드를 배치tage, s가 field의 중앙에 올 때까지 움직입니다.amp초점 노브를 사용하여 초점을 조정하고 10x 및/또는 20x 배율 대물 렌즈를 사용하여 대조군 조직과 비교하여 조직학을 분석합니다(가짜 조사).
    2. 현미경에 카메라가 장착되어 있으면 이미지도 촬영합니다.
      참고: 여기서 절차를 중지할 수 있습니다. 슬라이드는 실온에서 보관하고 나중에 분석할 수 있습니다. 얼룩이 서서히 사라지므로 슬라이드를 30일 이상 보관하지 마십시오.

5. 면역형광염색

  1. 파라핀이 포함된 조직 표본이 포함된 조직학적 카세트를 최소 1시간 동안 얼음 위에 올려 놓아 식힙니다. 마이크로톰을 사용하여 염색을 위해 5μm 두께의 절편을 준비합니다. 모든 조직은 압연된 전체 표본을 덮기 위해 수평으로 슬라이스되어야 합니다.
    1. 파라핀 블록을 절단한 후, 조직 절편을 45°C로 가온된 수조로 옮기고, 절편을 충전된 슬라이드 상에 놓는다. 슬라이드를 실온에서 밤새 랙에 두어 건조시킵니다.
      알림: 여기에서 절차를 중지할 수 있으며 슬라이드를 실온에서 보관할 수 있습니다.
  2. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 65°C 오븐에서 밤새 굽습니다. 슬라이드는 1-2시간의 짧은 시간 동안 구울 수 있습니다. 그러나 갓 (1 개월 전) 잘라낸 슬라이드의 경우에는 권장하지 않습니다.
    알림: 화학 후드 아래에 수동 슬라이드 염색 세트를 놓고 화학 후드 아래에 자일렌, 에탄올 및 H2O2/메탄올로 배양을 수행합니다.
  3. 다음날 슬라이드를 화학 후드 아래의 슬라이드 홀더에 10분 동안 넣어 식힙니다.
  4. 슬라이드 홀더를 100% 자일렌으로 채워진 용기에 3분 동안 넣어 조직을 탈파라핀화합니다. 신선한 100% 자일렌을 사용하여 배양을 반복합니다.
    알림: 그 순간부터 표본이 항상 젖어 있는지 확인하십시오.
  5. 화학적 후드 아래의 메탄올 중 2% 과산화수소 용액으로 채워진 용기에서 슬라이드를 30분 동안 인큐베이션하여 내인성 퍼옥시다제를 소멸시킵니다.
    주의: 메틸 알코올은(는) 잠재적으로 위험한 물질입니다: 건강 위험(H225-H301, H311, H331-H370), 인화성(GHS02) 및 급성 독성(경구, 피부, 흡입)(GHS08)을 유발합니다. 과산화수소는 부식성(GHS05)과 급성 독성(GHS07)을 유발할 수 있는 잠재적으로 위험한 물질입니다.
  6. 슬라이드 홀더를 다음 용액으로 채워진 용기에 순차적으로 배치하여 에탄올 구배에서 섹션을 재수화합니다: 100% 에탄올, 3분; 95% 에탄올, 3분; 70% 에탄올, 3분
  7. 슬라이드 홀더를 증류수가 채워진 용기에 옮기고 흐르는 증류수로 2분 동안 헹굽니다.
  8. 항원을 회수하려면 슬라이드 홀더를 250mL의 구연산염 완충용액(10mM 구연산나트륨, 0.05% Tween-20, pH 6.0)이 담긴 용기로 옮기고 디클로킹 챔버를 사용하여 110°C에서 10분 동안 요리합니다.
  9. 전체 용기를 냉장실로 옮기고 30분 동안 점진적으로 식힙니다.
  10. 30분 후 구연산염 완충액을 증류수로 교체하고 흐르는 증류수로 모든 떠다니는 파라핀 조각이 제거될 때까지 헹굽니다.
  11. 홀더에서 슬라이드를 꺼내고(한 번에 하나씩) 종이 타월을 두드리고 종이 타월로 표본 주변을 조심스럽게 건조시킵니다. 소수성 장벽을 제공하는 펜(PAP pen)을 사용하여 시편 주위에 닫힌 모양을 그립니다. 가습 된 챔버에 넣으십시오.
  12. TBS-Tween에서 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 200μL의 용액을 검체 표면에 추가하여 차단합니다. 누출이 없는지 확인하십시오. 가습 챔버에서 37°C에서 30분 동안 인큐베이션합니다.
  13. 종이 타월에 유리 슬라이드를 두드려 차단 용액을 제거합니다. 가습된 챔버에 다시 넣으십시오. 적절한 농도의 1차 항체를 블로킹 완충액에 재현탁 100μL를 첨가하고 밤새 부드럽게 흔들면서 4°C에서 인큐베이션합니다. BMI1/EYFP의 경우 닭고기 항-GFP(희석 1:500)를 사용하십시오. Ki-67의 경우 토끼 항-Ki-67(희석 1:200)을 사용하십시오.
  14. 종이 타월에 유리 슬라이드를 두드려 항체 용액을 제거합니다. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 TBS-Tween으로 채워진 용기로 옮깁니다. 슬라이드를 5분 동안 흔들어 씻고 3회 반복합니다. 매번 TBS-Tween 버퍼의 새로운 부분을 사용하십시오.
  15. 홀더에서 슬라이드를 꺼내고(한 번에 하나씩) 유리 슬라이드를 종이 타월로 두드려 과도한 세척액을 제거한 다음 가습실에 넣습니다. 적절한 농도의 2차 항체 100μL를 블로킹 완충액에 재현탁하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 2차 항체는 형광단과 접합되어야 합니다. BMI1/EYFP의 경우 당나귀 안티 치킨 Alexa Fluor 647(희석 1:500)을 사용하십시오. Ki-67의 경우 염소 방지 토끼 Alexa Fluor 488(희석 1:500)을 사용하십시오.
  16. 종이 타월에 유리 슬라이드를 두드려 항체 용액을 제거합니다. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 TBS-Tween으로 채워진 용기로 옮깁니다. 슬라이드를 5분 동안 흔들어 씻고 3회 반복합니다. 매번 TBS-Tween 버퍼의 새로운 부분을 사용하십시오.
  17. 홀더에서 슬라이드를 꺼내고(한 번에 하나씩) 유리 슬라이드를 종이 타월로 두드려 과도한 세척액을 제거한 다음 가습실에 넣습니다. 제조업체의 지침에 따라 준비된 EdU 염색 용액 100μL를 추가하고 Alexa Fluor 555 형광단을 사용합니다.
  18. 종이 타월에 유리 슬라이드를 두드려 EdU 용액을 제거합니다. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 TBS-Tween으로 채워진 용기로 옮깁니다. 슬라이드를 5분 동안 흔들어 세척하고 2회 반복합니다. 매번 TBS-Tween 버퍼의 새로운 부분을 사용하십시오.
  19. 홀더에서 슬라이드를 꺼냅니다(한 번에 하나씩). 종이 타월에 유리 슬라이드를 두드려 과도한 세척액을 제거하고 가습 챔버에 넣습니다. Hoechst 33258 용액 100μL(TBS-Tween에서 1:1000 희석)를 표본 표면에 추가하여 Hoechst 33258 대조 염색을 수행합니다. 실온의 어두운 곳에서 5분 동안 배양합니다.
  20. 종이 타월에 유리 슬라이드를 두드려 Hoechst 33258 용액을 제거합니다. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 TBS-Tween으로 채워진 용기로 옮깁니다. 슬라이드를 5분 동안 흔들어 세척합니다.
  21. 슬라이드 홀더에서 슬라이드를 꺼내 종이 타월을 사용하여 티슈 주변을 건조시킨 다음 시편의 크기에 따라 시편 표면에 아쿠아 기반 장착 매체를 한두 방울 떨어뜨립니다. 유리 슬라이드 위에 커버슬립을 부드럽게 올려 장착합니다(기포가 남지 않도록 주의). 필요한 경우 부드럽게 누르십시오. 유리의 전체 표면을 덮고 밀봉해야 합니다.
  22. 슬라이드를 실온의 어두운 곳에 밤새 두어 건조시킵니다. 일반적으로 마운팅 미디어는 24시간 이내에 응고됩니다. 슬라이드가 건조한지 확인하기 위해 샘플 슬라이드를 만들 수 있습니다. 빈 슬라이드를 사용하십시오. 장착 매체를 한 방울 떨어뜨리고 화학 후드 아래에 밤새 두십시오. 다음날 방울을 터치하여 굳었는지 확인합니다.
  23. 슬라이드가 마르면 방출 파장 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 염색된 조직을 분석하여 Ki-67, EdU 및 BMI1/EYFP 염색(각각 535nm, 646nm 및 700nm)을 시각화할 수 있습니다.
  24. s에 현미경 슬라이드를 놓습니다.tage, s가 중앙에 있을 때까지 움직입니다.ample이 시야의 중심에 있을 때까지 움직입니다.view초점 노브를 사용하여 초점을 조정하고 10x 및/또는 20x 배율 대물 렌즈를 사용하여 대조군 조직과 비교하여 염색을 분석합니다(가짜 조사). 현미경에 카메라가 장착되어 있으면 이미지도 촬영할 수 있습니다. 각 채널의 이미지를 개별적으로 촬영하고 나중에 병합합니다.
    참고: 여기서 절차를 중지할 수 있습니다. 슬라이드는 4°C에서 보관하고 나중에 분석할 수 있습니다. 얼룩이 서서히 사라지므로 슬라이드를 14일 이상 보관하지 마십시오.

6. TUNEL 염색

  1. 파라핀이 포함된 조직 표본이 포함된 조직학적 카세트를 최소 1시간 동안 얼음 위에 올려 놓아 식힙니다. 마이크로톰을 사용하여 염색을 위해 5μm 두께의 절편을 준비합니다. 모든 조직은 압연된 전체 표본을 덮기 위해 수평으로 슬라이스되어야 합니다.
    1. 파라핀 블록을 절단한 후, 조직 절편을 45°C까지 예열된 수조로 옮기고, 절편을 충전된 슬라이드 상에 놓는다. 슬라이드를 실온에서 밤새 랙에 두어 건조시킵니다.
      알림: 여기에서 절차를 중지할 수 있으며 슬라이드를 실온에서 보관할 수 있습니다.
  2. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 65°C 오븐에서 밤새 굽습니다.
    알림: 슬라이드는 1-2시간의 더 짧은 시간 동안 구울 수 있습니다. 그러나 갓 (1 개월 전) 잘라낸 슬라이드의 경우에는 권장하지 않습니다. 수동 슬라이드 염색 세트를 케미컬 후드 아래에 놓고 케미컬 후드 아래에서 크실렌과 에탄올로 인큐베이션을 수행합니다.
  3. 다음날 슬라이드를 화학 후드 아래의 슬라이드 홀더에 10분 동안 넣어 식힙니다.
  4. 슬라이드 홀더를 100% 자일렌으로 채워진 용기에 3분 동안 넣어 조직을 탈파라핀화합니다. 신선한 100% 자일렌을 사용하여 배양을 반복합니다.
    알림: 이 시점부터 표본이 항상 젖어 있는지 확인하십시오.
  5. 슬라이드 홀더를 다음 용액으로 채워진 용기에 순차적으로 배치하여 에탄올 구배에서 섹션을 재수화합니다: 100% 에탄올, 3분; 95% 에탄올, 3분; 90 % 에탄올, 3 분; 80% 에탄올, 3분; 70% 에탄올, 3분
  6. 슬라이드 홀더를 증류수가 채워진 용기에 옮기고 흐르는 증류수로 1분 동안 헹굽니다.
  7. 홀더에서 슬라이드를 꺼내고(한 번에 하나씩) 종이 타월을 두드리고 종이 타월로 표본 주변을 조심스럽게 건조시킵니다. 소수성 장벽을 제공하는 펜(PAP pen)을 사용하여 시편 주위에 닫힌 모양을 그립니다. 가습 된 챔버에 넣으십시오.
  8. DNase가 없는 프로테이나제 K와 함께 배양합니다. 100μL의 DNase가 없는 프로테이나제 K 용액(DPBS에서 1:25로 희석)을 소수성 장벽 내의 표본 표면에 추가합니다. 가습 챔버에서 실온에서 15분 동안 배양합니다.
    주의: 프로테이나제 K은(는) 잠재적으로 위험한 물질입니다: 건강 유해(H315 - H319 - H334).
  9. 종이 타월에 유리 슬라이드를 두드려 단백질 분해 효소 K 용액을 제거합니다. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 DPBS로 채워진 용기로 옮깁니다. 슬라이드를 5분 동안 흔들어 세척하고 2회 반복합니다. 매번 DPBS의 새로운 부분을 사용하십시오.
  10. TUNEL 반응 혼합물 준비: 라벨 용액(1x)과 효소 용액(10x)을 혼합합니다. 잘 피펫.
  11. 홀더에서 슬라이드를 꺼냅니다(한 번에 하나씩). 종이 타월에 유리 슬라이드를 두드려 과도한 세척액을 제거하고 가습 챔버에 넣습니다. 50μL의 TUNEL 반응 혼합물을 시편 표면에 넣고 가습 챔버에서 37°C의 암실에서 60분 동안 배양합니다. 음성 대조군의 경우 라벨 용액만 사용하십시오(TdT 제외).
  12. 종이 타월에 유리 슬라이드를 두드려 TUNEL 용액을 제거합니다. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 DPBS로 채워진 용기로 옮깁니다. 슬라이드를 5분 동안 흔들어 세척하고 2회 반복합니다. 매번 DPBS의 새로운 부분을 사용하십시오.
  13. 홀더에서 슬라이드를 꺼냅니다(한 번에 하나씩). 종이 타월에 유리 슬라이드를 두드려 과도한 세척액을 제거하고 가습 챔버에 넣습니다. Hoechst 33258 용액 100μL(TBS-Tween에서 1:1000 희석)를 표본 표면에 추가하여 Hoechst 33258 대조 염색을 수행합니다. 실온의 어두운 곳에서 5분 동안 배양합니다.
  14. 종이 타월에 유리 슬라이드를 두드려 Hoechst 33258 용액을 제거합니다. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 DPBS로 채워진 용기로 옮깁니다. 슬라이드를 5분 동안 흔들어 세척합니다.
  15. 슬라이드 홀더에서 슬라이드를 꺼냅니다. 종이 타월을 사용하여 조직 주변을 말리고 시편의 크기에 따라 시편 표면에 아쿠아 기반 장착 매체를 한두 방울 떨어뜨립니다. 유리 슬라이드 위에 커버슬립을 부드럽게 올려 장착합니다(기포가 남지 않도록 주의). 필요한 경우 부드럽게 누르십시오. 유리의 전체 표면을 덮고 밀봉해야 합니다.
  16. 슬라이드를 실온의 어두운 곳에 밤새 두어 건조시킵니다. 일반적으로 장착 매체는 24시간 이내에 응고됩니다. 슬라이드가 건조한지 확인하기 위해 샘플 슬라이드를 만들 수 있습니다. 장착 매체를 한 방울 떨어뜨리고 실온에서 밤새 어두운 곳에 두십시오. 다음날 방울을 터치하여 굳었는지 확인합니다.
  17. 슬라이드가 마르면 방출 파장 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 염색된 조직을 분석하여 TUNEL 염색(535nm)을 시각화할 수 있습니다.
  18. s에 현미경 슬라이드를 놓습니다.tage, s가 시야의 중앙에 올 때까지 움직입니다.amp초점 노브를 사용하여 초점을 조정하고 10x 및/또는 20x 배율 대물 렌즈를 사용하여 대조군 조직과 비교하여 염색을 분석합니다(가짜 조사). 현미경에 카메라가 장착되어 있으면 이미지도 촬영할 수 있습니다. 각 채널의 이미지를 개별적으로 촬영하고 나중에 병합합니다.
    참고: 여기서 절차를 중지할 수 있습니다. 슬라이드는 4°C에서 보관하고 나중에 분석할 수 있습니다. 얼룩이 서서히 사라지므로 슬라이드를 14일 이상 보관하지 마십시오.

결과

쥐의 유전적 혈통 추적과 함께 12Gy 전신 방사선 조사(TBI)를 사용하면 장내 방사선 손상의 결과를 철저히 분석할 수 있습니다. 시작하려면 Bmi1-CreER; Rosa26eYFP 마우스는 Bmi1+ 예비 줄기 세포 집단 내에서 향상된 황색 형광 단백질(EYFP) 발현을 유도하는 단일 타목시펜 주사를 받았습니다. 타목시펜 주사 이틀 후, 마우스는 방사선 조사 또는 가짜 방사선 조사를 받았다. 안?...

토론

이 프로토콜은 강력하고 재현 가능한 방사선 손상 모델을 설명합니다. 이를 통해 손상 후 7일 동안 장 상피의 변화를 정확하게 분석할 수 있습니다. 중요하게도, 선택된 시점은 손상의 중요한 단계를 반영하며 장의 뚜렷한 변화(손상, 세포자멸사, 재생 및 정상화 단계)를 특징으로 합니다60. 이 방사선 조사 모델은 확립되고 신중하게 평가되어 방사선 요법을 받는 환자가 경험하는...

공개

저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

저자는 조직 표본 준비에 대한 전문가의 도움을 받은 Stony Brook Cancer Center Histology Research Core와 동물 관리 및 취급에 대한 지원을 제공한 Stony Brook University의 실험실 동물 자원 부서에 감사를 표하고자 합니다. 이 연구는 Agnieszka B. Bialkowska와 Vincent W. Yang 박사에게 수여된 DK052230에 수여된 국립 보건원 DK124342의 보조금으로 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
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27G x 1/2" needleBD305109-
28G x 1/2" Monoject 1mL insulin syringeCovidien1188128012-
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)Santa Cruz Biotechnologysc284628A10 mg/mL in sterile DMSO:water (1:4 v/v), aliquot and store in -20°C
Azer Scientific 10% Neutral Buffered FormalinFisher Scientific22-026-213-
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/JThe Jackson LaboratoryStrain #:006148
B6;129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/JThe Jackson LaboratoryStrain #:010531
Bovine Serum Albumin Fraction V, heat shockMillipore-Sigma3116956001
Chicken anti-GFPAvesGFP-1020
Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 imaging kit, InvitrogenThermo Fisher ScientificC10638-
Corn oilMillipore-SigmaC8267-
Decloaking ChamberBiocare MedicalDC2012-
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher BioReagentsBP231-100light sensitive
DNase-free proteinase KInvitrogenC10618Hdiluted 25x in DPBS
Donkey anti-chicken AF647Jackson ImmunoResearch703-605-155
DPBSFisher Scientific21-031-CV-
EosinFisher ScientificS176
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse 90i Bright and fluoerescent light, with objectives: 10X, 20XNikon
Fluoromount Aqueous Mounting MediumMillipore-SigmaF4680-25ML
Gamma Cell 40 ExactorBest Theratronics Ltd.-0.759 Gy min-1
Goat anti-rabbit AF488Jackson ImmunoResearch111-545-144
Hematoxylin Solution, Gill No. 3Millipore-SigmaGHS332
HM 325 Rotary Microtome from Thermo ScientificFisher Scientific23-900-668
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide)Thermo Fisher ScientificH3569dilution 1:1000
Hydrogen Peroxide Solution, ACS, 29-32%, Spectrum ChemicalFisher Scientific18-603-252-
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche)Millipore-Sigma11684795910
Liquid Blocker Super PAP PEN, MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Lithium Carbonate (Powder/Certified ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificL119-5000.5g/1L dH2O
Luer-Lok Syringe sterile, single use, 10 mLVWR89215-218-
MethanolVWRBDH1135-4LP
Pharmco Products Ethyl alcohol, 200 PROOFFisher ScientificNC1675398-
Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acetic Acid ACS GradeCapitol ScientificAAP-281000ACSCSLT-
Rabbit anti-Ki67BioCare MedicalCRM325
Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Mounting MediumFisher Scientific22-050-262
Scientific Industries Incubator-Genie for baking slides at 65 degreeFisher Scientific50-728-103
Sodium Citrate DihydrateFisher ScientificS279-500
Stainless Steel Dissecting KitVWR25640-002
Superfrost Plus micro slides [size: 25 x 75 x 1 mm]VWR 48311-703
TamoxifenMillipore-SigmaT564830 mg/mL in sterile corn oil, preferably fresh or short-sterm storage in -20°C, light sensitive
Tissue-Tek 24-Slide Holders with Detachable HandleSakura4465
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile BladesSakura4689
Tissue-Tek Manual Slide Staining SetSakura4451
Tissue-Tek Staining Dish, Green with LidSakura4456
Tissue-Tek Staining Dish, White with LidSakura4457
Tween 20Millipore-SigmaP7949
Unisette Processing CassettesVWR87002-292-
VWR Micro Cover GlassesVWR48393-081
XyleneFisher ScientificX5P-1GAL

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