Recopilación de datos crio-EM de una sola partícula con inclinación de la etapa utilizando Leginon

Resumen

El presente protocolo describe un esquema generalizado y fácil de implementar para la recopilación de datos inclinados de una sola partícula en experimentos crio-EM. Este procedimiento es especialmente útil para obtener un mapa EM de alta calidad para muestras que sufren un sesgo de orientación preferencial debido a la adherencia a la interfaz aire-agua.

Resumen

El análisis de partículas individuales (SPA) por microscopía crioelectrónica (crio-EM) es ahora una técnica convencional para la biología estructural de alta resolución. La determinación de la estructura por SPA se basa en la obtención de múltiples vistas distintas de un objeto macromolecular vitrificado dentro de una fina capa de hielo. Idealmente, una colección de orientaciones de proyección aleatorias uniformemente distribuidas equivaldría a todas las vistas posibles del objeto, dando lugar a reconstrucciones caracterizadas por una resolución direccional isotrópica. Sin embargo, en realidad, muchas muestras sufren de partículas orientadas preferentemente que se adhieren a la interfaz aire-agua. Esto conduce a distribuciones de orientación angular no uniformes en el conjunto de datos y a un muestreo del espacio de Fourier no homogéneo en la reconstrucción, lo que se traduce en mapas caracterizados por una resolución anisotrópica. La inclinación de la etapa de la muestra proporciona una solución generalizable para superar la anisotropía de resolución en virtud de mejorar la uniformidad de las distribuciones de orientación y, por lo tanto, la isotropía del muestreo del espacio de Fourier. El presente protocolo describe una estrategia de recopilación automatizada de datos de etapa inclinada utilizando Leginon, un software para la adquisición automatizada de imágenes. El procedimiento es simple de implementar, no requiere ningún equipo o software adicional, y es compatible con la mayoría de los microscopios electrónicos de transmisión estándar (TEM) utilizados para obtener imágenes de macromoléculas biológicas.

Introducción

El advenimiento de los detectores directos de electrones en la última década ^1,2,3 ha estimulado un aumento exponencial en el número de estructuras de alta resolución de macromoléculas y ensamblajes macromoleculares resueltos utilizando crio-EM 4,5,6 de una sola partícula. Se espera que casi todas las especies macromoleculares purificadas sean susceptibles de determinación de la estructura mediante crio-EM, excepto las proteínas más pequeñas ~ 10 kDa de tamaño o por debajo de⁷. La cantidad de material de partida necesario para la preparación de la rejilla y la determinación de la estructura es al menos un orden de magnitud menor que otras técnicas de determinación de la estructura, como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear y la cristalografía de rayos X ^4,5,6.

Sin embargo, un desafío principal para la determinación de la estructura mediante crio-EM implica una preparación adecuada de la rejilla para la obtención de imágenes. Un extenso estudio que evaluó diversas muestras utilizando diferentes estrategias y rejillas de vitrificación sugirió que la mayoría de los enfoques para vitrificar muestras en rejillas crio-EM conducen a la adhesión preferencial de macromoléculas a la interfaz aire-agua⁸. Tal adherencia puede causar potencialmente cuatro resultados subóptimos: (1) la muestra macromolecular se desnaturaliza por completo, en cuyo caso no es posible una recopilación y procesamiento de datos exitosos; (2) la muestra se desnaturaliza parcialmente, en cuyo caso puede ser posible obtener información estructural de regiones de la macromolécula que no están dañadas; (3) la muestra conserva la estructura nativa, pero solo un conjunto de orientaciones de partículas en relación con la dirección del haz de electrones está representado en las imágenes; (4) La muestra conserva la estructura nativa, y algunas, pero no todas, las posibles orientaciones de partículas en relación con la dirección del haz de electrones están representadas en las imágenes. Para los casos (3) y (4), la recolección de datos inclinados ayudará a minimizar la anisotropía de resolución direccional que afecta al mapa crio-EM reconstruido y proporciona una solución generalizable para una amplia variedad de muestras⁹. Técnicamente, la inclinación también puede beneficiar el caso (2), ya que la desnaturalización presumiblemente ocurre en la interfaz aire-agua y limita de manera similar el número de orientaciones distintas representadas dentro de los datos. El grado de sesgo de orientación en el conjunto de datos puede alterarse potencialmente experimentando con aditivos de solución, pero la falta de aplicabilidad amplia dificulta estos enfoques de prueba y error. Inclinar la etapa de la muestra en un solo ángulo de inclinación optimizado es suficiente para mejorar la distribución de las orientaciones en virtud de la alteración de la geometría del experimento de imagen⁹ (Figura 1). Debido a la configuración geométrica de la muestra orientada preferentemente con respecto al haz de electrones, para cada grupo de orientaciones preferenciales, inclinar la rejilla genera un cono de ángulos de iluminación con respecto al centroide del cúmulo. Por lo tanto, esto extiende las vistas y, en consecuencia, mejora el muestreo del espacio de Fourier y la isotropía de la resolución direccional.

Hay, en la práctica, algunos inconvenientes para inclinar el escenario. La inclinación de la etapa de la muestra introduce un gradiente de enfoque en todo el campo de visión, lo que puede afectar a la precisión de las estimaciones de la función de transferencia de contraste (CTF). La recopilación de datos inclinados también puede conducir a un aumento del movimiento de partículas inducido por el haz causado por el aumento de los efectos de carga al obtener imágenes de muestras inclinadas. La inclinación de la rejilla también conduce a un aumento en el espesor aparente del hielo, lo que a su vez conduce a micrografías más ruidosas y, en última instancia, puede afectar la resolución de las reconstrucciones 5,9,10. Puede ser posible superar estos problemas aplicando esquemas avanzados de procesamiento computacional de datos que se describen brevemente en las secciones de protocolo y discusión. Por último, la inclinación puede conducir a una mayor superposición de partículas, lo que dificulta la posterior canalización de procesamiento de imágenes. Aunque esto puede mitigarse hasta cierto punto optimizando la concentración de partículas en la red, no obstante es una consideración importante. Aquí, se describe un protocolo fácil de implementar para la recopilación de datos inclinados utilizando el paquete de software Leginon (un software automatizado de adquisición de imágenes), disponible en acceso abierto y compatible con una amplia gama de microscopios^11,12,13,14. El método requiere al menos la versión 3.0 o superior, con las versiones 3.3 en adelante que contienen mejoras dedicadas para permitir la recopilación de datos inclinados. No se necesita software o equipo adicional para este protocolo. En otra parte se proporcionan instrucciones extensas sobre infraestructura computacional y guías de instalación¹⁵.

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Utilice rejillas que contengan lámina de oro y soporte de rejilla dorada 16 (consulte la Tabla de materiales) porque la recopilación de datos inclinada puede acentuar el movimiento inducido por el haz¹⁷.
   NOTA: Para el presente estudio, las muestras en rejillas fueron vitrificadas utilizando la técnica manual de inmersión y secado¹⁸ en una cámara frigorífica humidificada (mayor del 80%) (~4 °C).
2. Evite el uso de rejillas que contengan soporte de cobre y lámina de carbono o una capa continua de carbono amorfo a menos que sea absolutamente necesario, ya que estas rejillas pueden conducir a un mayor movimiento inducido por el haz¹⁶ cuando la etapa de la muestra está inclinada.
   NOTA: Las capas de soporte alternativas, como el grafeno/óxido de grafeno, parecen reducir el movimiento inducido por el haz en comparación con el carbono amorfo^19,20.
3. Preseleccionar cuadrículas e identificar regiones caracterizadas por un espesor de hielo aceptable y una distribución de partículas. Las cuadrículas que contienen partículas demasiado compactas darán lugar a la superposición de partículas durante la recopilación de datos inclinados, lo que puede afectar los pasos posteriores al procesamiento de datos.
   NOTA: Estos pasos son subjetivos ya que la identificación de buenas áreas de hielo se realiza mediante la inspección visual de imágenes desenfocadas para regiones donde el contraste de partículas es claro. Esto puede no ser factible para todas las muestras, ya que algunas muestras no se distribuirán de manera eficiente en áreas de hielo delgado, lo que genera desafíos durante la recopilación de datos (descrito en la sección Discusión).
4. Vitrifique las rejillas que contienen su muestra de proteína. Aquí, para fines de demostración, utilizamos la proteína de protección del ADN durante la inanición (DPS) (consulte la Tabla de materiales) en un rango de 0.1-0.5 mg / ml con lámina de oro y rejillas de soporte de oro.
   NOTA: La proteína fue purificada como se describió anteriormente, excepto que no se realizó escisión de la proteasa TEV²¹. El rango de concentración de proteínas para una muestra de interés tendrá que optimizarse individualmente, ya que es difícil medir un rango ideal que sea universalmente aplicable y casi seguramente variará entre diferentes muestras.

2. Configuración de la recopilación de datos inclinada

1. Alinee el microscopio para asegurar la iluminación paralela de la muestra y minimizar las aberraciones de coma²².
   NOTA: El microscopio debe estar bien alineado para la recopilación de datos SPA estándar sin inclinación de la etapa. No se necesitan alineaciones especiales para la recopilación de datos inclinados, pero una buena alineación garantizará que la orientación y la creación de imágenes se realicen sin problemas. En la Figura 2 se proporciona un esquema general que compara la recopilación de datos inclinados y no inclinados.
2. Grabe un atlas de cuadrícula sin inclinación de escenario para identificar cuadrados adecuados para la recopilación de datos o inspeccione manualmente cuadrados con el aumento utilizado en Nodo de adquisición cuadrado. Busque cuadrados donde la lámina esté intacta, no se vea deshidratada y tenga un grosor de hielo ideal.
   NOTA: El nodo de adquisición cuadrado es el nodo de bajo aumento utilizado para imágenes multiescala en Leginon.
   1. Para la típica recopilación automatizada de datos sin inclinación, registre un atlas de cuadrícula, que proporciona una visión general de la calidad general de la cuadrícula y una indicación inicial de las áreas adecuadas para la recopilación de datos.
   2. Posteriormente, seleccione los cuadrados adecuados a través del atlas y envíelos a la cola. Luego, ya sea a través de la selección manual de agujeros o a través del buscador automático de agujeros EM, ponga en cola y envíe los objetivos de agujeros.
   3. Finalmente, utilice el buscador de orificios EM automatizado para enviar objetivos de exposición de gran aumento.
      NOTA: Para la recopilación de datos inclinados, es posible que los cuadrados deban ponerse en cola manualmente para obtener resultados coherentes, especialmente si el ángulo de inclinación óptimo no se ha predeterminado previamente y es probable que se ajuste durante la recopilación de datos. El atlas de la cuadrícula también podría registrarse utilizando una inclinación de etapa predefinida si se hubiera establecido previamente el ángulo de inclinación utilizado para la recopilación de datos.
3. Mueva la etapa de muestra a un cuadrado de interés.
4. Determine la altura eucéntrica para la posición del escenario utilizando α-wobbler en ± inclinación del escenario de 15°. Ajuste la altura Z para llevar el escenario a la altura eucéntrica utilizando el panel del teclado para el microscopio. Asegúrese de que el cambio de imagen sea mínimo durante la rutina de bamboleo α.
   NOTA: Si la altura eucéntrica no se identifica correctamente, se observará un gran desplazamiento de imagen al inclinar el escenario en el aumento cuadrado. Esto también puede suceder si hay deformaciones locales en la cuadrícula, por ejemplo, si la rejilla está rota o severamente doblada en las proximidades del área de la imagen. Aunque es mejor evitar tales regiones para la recopilación de datos, es imperativo estimar con precisión la altura eucéntrica si representan una de las pocas regiones prometedoras para la recopilación de datos. La figura 3 muestra cómo la focalización sin identificar adecuadamente la altura eucéntrica puede causar grandes cambios de imagen en el aumento cuadrado.
5. Busque una altura Z más precisa, utilice el nodo Enfocador y pulse Simular.
   1. Normalmente, estime la altura Z en el nodo Focuser con el aumento utilizado en el nodo de adquisición cuadrado.
      NOTA: La secuencia de enfoque del nodo Focuser también puede incluir una estimación de enfoque Z fino en el nodo de adquisición de agujeros (una herramienta del software Leginon) durante la recopilación de datos.
   2. Ajuste la configuración del nodo Enfocador y habilite/deshabilite la opción de enfoque Z fino durante la cola inicial de cuadrados.
      NOTA: Es importante asegurarse de que la altura eucéntrica se identifique con precisión cuando comience la recopilación automatizada de datos, lo que puede requerir volver a habilitar el enfoque Z fino (paso 2.10).
6. Incline la etapa de la muestra al ángulo de inclinación deseado para la recopilación de datos a la altura eucéntrica real y vuelva a centrar la etapa si es necesario. Para este estudio se utilizaron ángulos de inclinación de 0°, 30° y 60°. Pulse Simular en el nodo Adquisición cuadrada para comenzar a poner en cola los objetivos para las exposiciones del nodo Adquisición de agujeros .
   NOTA: Como se indica en el paso 2.2.1, el atlas de cuadrícula se puede grabar utilizando una inclinación de etapa predefinida, lo que evitaría la necesidad de inclinar la etapa nuevamente en este paso. Esto funciona bien y acelera el proceso si el ángulo de inclinación utilizado para la recopilación de datos está predefinido. El protocolo actual está escrito con nuevas muestras en mente, en las que el usuario puede desear probar diferentes ángulos de inclinación para la recopilación de datos.
7. Seleccione un objetivo de enfoque Z y regiones con orificios adecuados para exposiciones de gran aumento.
8. Presione Enviar destinos a la cola para obtener imágenes. No presione Enviar destinos en cola hasta que termine de poner en cola todos los cuadrados.
9. Lleve la etapa de la muestra a su estado no inclinado. Desplácese al siguiente cuadrado y repita los pasos 2.3-2.8 hasta que se haya puesto en cola un número adecuado de exposiciones de orificios.
10. Vaya al nodo Destino de agujero y pulse Enviar destinos en cola una vez que todos los cuadrados estén en cola.
    NOTA: Si el enfoque Z fino se desactivó anteriormente para ahorrar tiempo (paso 2.5), debe volver a habilitarse antes de enviar la cola.
11. Inspeccione manualmente los objetivos seleccionados por el nodo de adquisición de exposición de gran aumento para comprobar si el buscador de orificios EM automatizado puede identificar con precisión las regiones adecuadas para la adquisición de imágenes cuando la etapa de la muestra está inclinada.
    1. Durante este procedimiento, seleccione "Permitir la verificación por parte del usuario de los objetivos seleccionados" en la configuración del nodo Adquisición de exposición . Una vez que el usuario esté satisfecho con la precisión de la segmentación, anule la selección de esta opción para la recopilación automatizada de datos.
       NOTA: Los objetivos en el nodo de adquisición de exposición de gran aumento suelen obtener imágenes utilizando una estrategia de desplazamiento de imagen de inclinación del haz, que funciona igualmente bien para la recopilación de datos inclinados y no inclinados^23,24,25,26. Para una estimación precisa de CTF en los pasos de procesamiento de datos posteriores, se debe realizar la calibración de la aberración de la coma de la lente para la estrategia de recopilación de datos de desplazamiento de imagen de inclinación del haz.

3. Tratamiento de datos

1. Iniciar el procesamiento de datos sobre la marcha 10,27,28,29 con corrección de movimiento de películas grabadas, estimación de CTF^, selección de partículas y generación de reconstrucciones iniciales durante la recopilación de datos.
   NOTA: Para el presente estudio, cryoSPARC Live¹⁰ (ver Tabla de materiales) se ha utilizado para el preprocesamiento. El procesamiento de datos sobre la marcha proporciona una reconstrucción crio-EM inicial y una aproximación para la distribución angular, que puede informar al usuario sobre el alcance de la anisotropía de resolución. Estos, a su vez, se pueden utilizar para guiar al usuario en cuanto a si el ángulo de inclinación utilizado para la recopilación de datos es o no lo suficientemente alto.
2. Visualice el mapa reconstruido y trace la distribución del ángulo de Euler para medir la extensión de las orientaciones de partículas preferidas.
   NOTA: Las distribuciones de ángulo de Euler se pueden convertir directamente en distribuciones de muestreo del espacio de Fourier para determinar el grado potencial de anisotropía de resolución. Se ha desarrollado una interfaz gráfica de usuario (GUI) para ayudar al usuario a evaluar la calidad de una distribución de ángulo de Euler y determinar un ángulo de inclinación óptimo^30,31. La herramienta se puede obtener del repositorio de Github, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui.
3. Si es necesario, ajuste el ángulo de inclinación del escenario en el que se recopilan los datos para superar los efectos de la orientación preferencial. El ángulo se puede aumentar si la orientación preferencial sigue siendo un problema, como lo demuestra el mapa y la distribución de Euler en 3.2. Alternativamente, el usuario puede desear dividir la recopilación de datos en grupos y grabar utilizando varios ángulos de inclinación diferentes, como 20°, 30° y 40°.
   NOTA: Aunque la mayoría de los TEM deben tener la capacidad de inclinar la plataforma a 70°, las inclinaciones comunes de la etapa de muestra (que hemos utilizado) varían de 20° a 40°.

Resultados

Se utilizó DPS a 0,3 mg/ml para demostrar imágenes a 0°, 30° y 60° de inclinación. Los datos de diferentes ángulos de inclinación se recopilaron en la misma cuadrícula en diferentes regiones de la cuadrícula. Los ajustes de resolución CTF para inclinaciones de ángulo más alto tienden a ser más pobres, como fue el caso al comparar los tres conjuntos de datos en este estudio. La Figura 4 muestra imágenes representativas comparativas y promedios de clasificación 2D. Aunque la co...

Discusión

La orientación preferida de las partículas causada por la adherencia de la muestra a la interfaz aire-agua es uno de los últimos cuellos de botella importantes para la determinación rutinaria de estructuras de alta resolución utilizando cryo-EM SPA ^4,5,6. El esquema de recopilación de datos presentado aquí proporciona una estrategia fácil de implementar para mejorar la distribución de orientación de partículas dentro ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01