Leginon을 사용한 스테이지 틸트를 이용한 단일 입자 Cryo-EM 데이터 수집

요약

본 프로토콜은 Cryo-EM 실험에서 기울어진 단일 입자 데이터 수집을 위한 일반화되고 구현하기 쉬운 체계를 설명합니다. 이러한 절차는 공기-물 계면의 부착으로 인해 우선적인 방향 편향을 겪는 샘플에 대한 고품질 EM 맵을 얻는 데 특히 유용합니다.

초록

초저온 전자 현미경(Cryo-EM)에 의한 단일 입자 분석(SPA)은 이제 고분해능 구조 생물학의 주류 기술입니다. SPA에 의한 구조 결정은 얇은 얼음 층 내에서 유리화된 거대 분자 물체에 대한 여러 가지 뚜렷한 견해를 얻는 데 의존합니다. 이상적으로, 균일하게 분포 된 무작위 투영 방향의 집합은 물체의 모든 가능한 뷰에 해당하며, 등방성 방향 분해능을 특징으로하는 재구성을 발생시킵니다. 그러나 실제로 많은 샘플은 공기-물 계면에 부착된 우선적인 방향의 입자로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 이로 인해 데이터 세트에서 균일하지 않은 각도 방향 분포가 발생하고 재구성에서 불균일한 푸리에 공간 샘플링이 발생하여 이방성 분해능을 특징으로 하는 맵으로 변환됩니다. 시편 스테이지를 기울이는 것은 배향 분포의 균일성을 개선하여 분해능 이방성을 극복하고 푸리에 공간 샘플링의 등방성을 극복할 수 있는 일반화 가능한 솔루션을 제공합니다. 현재 프로토콜은 자동화된 이미지 획득을 위한 소프트웨어인 Leginon을 사용하는 기울어진 단계의 자동화된 데이터 수집 전략을 설명합니다. 이 절차는 구현이 간단하고 추가 장비나 소프트웨어가 필요하지 않으며 생물학적 거대분자 이미징에 사용되는 대부분의 표준 투과 전자 현미경(TEM)과 호환됩니다.

서문

지난 10년 동안 직접 전자 검출기 ^1,2,3의 출현 으로 단일 입자 Cryo-EM 4,5,6을 사용하여 해결된 거대분자 및 거대분자 어셈블리의 고분해능 구조 수가 기하급수적으로 증가했습니다. 크기가 ~10kDa 이하이거나⁷ 미만인 가장 작은 단백질을 제외하고 거의 모든 정제된 거대분자 종은 Cryo-EM을 사용하여 구조를 측정할 수 있을 것으로 예상됩니다. 그리드 준비 및 구조 결정에 필요한 출발 물질의 양은 핵 자기 공명 분광법 및 X선 결정학 ^4,5,6과 같은 다른 구조 결정 기술보다 적어도 한 단계 적습니다.

그러나 Cryo-EM에 의한 구조 결정의 주요 과제는 이미징을 위한 적절한 그리드 준비와 관련이 있습니다. 다양한 유리화 전략과 그리드를 사용하여 다양한 시료를 평가한 광범위한 연구에 따르면, Cryo-EM 그리드에서 시료를 유리화하는 대부분의 접근법은 거대분자가 공기-물 계면에 우선적으로 부착되는 것으로 나타났다⁸. 이러한 순응은 잠재적으로 4가지 차선의 결과를 초래할 수 있다: (1) 거대분자 샘플은 완전히 변성되며, 이 경우 성공적인 데이터 수집 및 처리가 불가능하다; (2) 샘플이 부분적으로 변성되며, 이 경우 손상되지 않은 거대분자 영역으로부터 구조적 통찰력을 얻을 수 있습니다. (3) 샘플은 기본 구조를 유지하지만 전자빔의 방향에 대한 입자 방향의 한 세트만 이미지에 표시됩니다. (4) 샘플은 본래의 구조를 유지하고, 전자빔의 방향에 대한 가능한 입자 방향이 전부는 아니지만 일부가 이미지에 표현된다. 사례 (3)과 (4)의 경우, 기울어진 데이터 수집은 재구성된 Cryo-EM 맵에 영향을 미치는 방향 분해능 이방성을 최소화하는 데 도움이 되며 다양한 샘플에 대한 일반화 가능한 솔루션을 제공합니다⁹. 기술적으로, 틸팅은 또한 사례 (2)에 도움이 될 수 있는데, 이는 변성이 아마도 공기-물 계면에서 발생하고 유사하게 데이터 내에서 표현되는 뚜렷한 방향의 수를 제한하기 때문입니다. 데이터 세트의 방향 편향 범위는 솔루션 첨가제를 실험하여 잠재적으로 변경할 수 있지만 광범위한 적용 가능성이 부족하면 이러한 시행착오 접근 방식이 방해를 받습니다. 시편 스테이지를 최적화된 단일 기울기 각도로 기울이는 것은 이미징 실험⁹ 의 기하학적 구조를 변경하여 방향 분포를 개선하기에 충분합니다(그림 1). 전자빔에 대한 우선적으로 배향된 샘플의 기하학적 구성으로 인해, 우선적인 배향의 각 클러스터에 대해, 그리드를 기울이는 것은 클러스터 중심에 대해 조명 각도의 원뿔을 생성한다. 따라서 이것은 뷰를 분산시키고 결과적으로 푸리에 공간 샘플링과 방향 분해능의 등방성을 향상시킵니다.

실제로 무대를 기울이는 데는 몇 가지 단점이 있습니다. 시편 스테이지를 기울이면 시야 전체에 초점 그라데이션이 발생하여 CTF(대비 전달 함수) 추정의 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다. 기울어진 데이터 수집은 또한 기울어진 표본을 이미징할 때 증가된 충전 효과로 인해 빔으로 인한 입자 이동을 증가시킬 수 있습니다. 그리드 기울기는 또한 겉보기 얼음 두께의 증가로 이어지며, 이는 차례로 더 시끄러운 현미경 사진으로 이어지고 궁극적으로 재구성 ^5,9,10의 해상도에 영향을 미칠 수 있습니다. 프로토콜 및 토론 섹션에서 간략하게 설명된 고급 계산 데이터 처리 방식을 적용하여 이러한 문제를 극복하는 것이 가능할 수 있습니다. 마지막으로, 틸팅은 입자 겹침을 증가시켜 후속 이미지 처리 파이프라인을 방해할 수 있습니다. 이는 그리드 상의 입자 농도를 최적화하여 어느 정도 완화할 수 있지만 그럼에도 불구하고 중요한 고려 사항입니다. 여기에서는 Leginon 소프트웨어 제품군(자동 이미지 획득 소프트웨어)을 사용하여 기울어진 데이터 수집을 위해 구현하기 쉬운 프로토콜에 대해 설명하며, 오픈 액세스가 가능하고 광범위한 현미경^11,12,13,14와 호환됩니다. 이 방법에는 버전 3.0 이상이 필요하며, 버전 3.3 이상에는 기울어진 데이터 수집을 가능하게 하는 전용 개선 사항이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜에는 추가 소프트웨어나 장비가 필요하지 않습니다. 전산 인프라스트럭처 및 설치 가이드에 대한 광범위한 지침은 다른 곳에서 제공된다¹⁵.

프로토콜

1. 시료 전처리

1. 금박과 금 그리드 지지대(¹⁶)를 포함하는 그리드를 사용하는데, 이는 기울어진 데이터 수집이 빔-유도 모션⁽¹⁷)을 강조할 수 있기 때문이다.
   참고: 본 연구를 위해, 그리드 상의 샘플은 가습된(80% 초과) 냉장실(~4°C)에서 수동 플런지 및 블로팅 기술¹⁸ 을 사용하여 유리화되었습니다.
2. 절대적으로 필요한 경우가 아니면 구리 지지체와 카본 호일 또는 비정질 탄소의 연속 층이 포함된 그리드를 사용하지 마십시오.
   참고: 그래핀/그래핀 옥사이드와 같은 대체 지지층은 비정질 탄소^19,20에 비해 빔 유도 이동을 감소시키는 것으로 보입니다.
3. 그리드를 사전 선별하고 허용 가능한 얼음 두께와 입자 분포를 특징으로 하는 영역을 식별합니다. 너무 빽빽하게 채워진 입자가 포함된 그리드는 기울어진 데이터 수집 중에 입자가 겹치게 하여 다운스트림 데이터 처리 단계에 영향을 줄 수 있습니다.
   알림: 이 단계는 입자 대비가 명확한 영역에 대해 초점이 흐려진 이미지를 육안으로 검사하여 얼음의 좋은 영역을 식별하기 때문에 주관적입니다. 일부 샘플은 얇은 얼음 영역에서 효율적으로 배포되지 않아 데이터 수집 중에 문제가 발생하기 때문에 모든 샘플에 대해 실현 가능하지 않을 수 있습니다(토론 섹션에 설명됨).
4. 단백질 샘플이 포함된 그리드를 유리화합니다. 여기에서는 시연 목적으로 금박 및 금 지지 그리드와 함께 0.1-0.5mg/mL 범위의 기아 중 DNA 보호(DPS) 단백질( 재료 표 참조)을 사용합니다.
   참고: 단백질은 TEV 프로테아제 절단이 수행되지 않은 것을 제외하고는 이전에 기술된 바와 같이 정제되었다²¹. 관심 샘플의 단백질 농도 범위는 보편적으로 적용 가능한 이상적인 범위를 측정하기 어렵고 샘플마다 거의 확실하게 다르기 때문에 개별적으로 최적화해야 합니다.

2. 기울어진 데이터 수집 설정

1. 현미경을 정렬하여 표본의 평행 조명을 보장하고 혼수 수차를 최소화합니다²².
   참고: 현미경은 s가 없는 표준 SPA 데이터 수집을 위해 잘 정렬되어야 합니다.tage 기울기. 기울어진 데이터 수집에는 특별한 정렬이 필요하지 않지만 정렬이 잘 이루어지면 타겟팅 및 이미징이 원활하게 진행됩니다. 기울어진 데이터 수집과 기울어지지 않은 데이터 수집을 비교하는 일반적인 체계가 그림 2에 나와 있습니다.
2. 스테이지 틸트 없이 그리드 아틀라스를 기록하여 데이터 수집에 적합한 사각형을 식별하거나 Square Acquisition Node에서 사용되는 배율로 사각형을 수동으로 검사할 수 있습니다. 호일이 손상되지 않고 탈수된 것처럼 보이지 않으며 이상적인 얼음 두께를 가진 사각형을 찾으십시오.
   참고: 정사각형 획득 노드는 Leginon의 멀티 스케일 이미징에 사용되는 저배율 노드입니다.
   1. 일반적인 기울어지지 않은 자동 데이터 수집의 경우 전체 그리드 품질에 대한 개요와 데이터 수집에 적합한 영역의 초기 표시를 제공하는 그리드 아틀라스를 기록합니다.
   2. 그런 다음 아틀라스를 통해 적합한 사각형을 선택하고 대기열에 제출하십시오. 그런 다음 수동으로 구멍을 선택하거나 자동 EM 구멍 파인더를 통해 구멍 대상을 대기열에 넣고 제출합니다.
   3. 마지막으로 자동 EM 구멍 파인더를 사용하여 고배율 노출 대상을 제출합니다.
      참고: 기울어진 데이터 수집의 경우, 특히 최적의 기울기 각도가 미리 결정되지 않았고 데이터 수집 중에 조정될 가능성이 있는 경우 일관된 결과를 위해 사각형을 수동으로 대기열에 넣어야 할 수 있습니다. 그리드 아틀라스는 데이터 수집에 사용된 기울기 각도가 이전에 설정된 경우 미리 정의된 스테이지 기울기를 사용하여 기록할 수도 있습니다.
3. 시편 스테이지를 관심 있는 제곱으로 이동합니다.
4. 유센트릭 높이 결정tage 15°에서 α-wobbler를 사용하여 위치tage 기울기±. Z-높이를 조정하여 s를 유센트릭 높이로 가져옵니다.tage 현미경용 키패드 패널을 사용합니다. α 흔들림 루틴 동안 이미지 이동이 최소화되었는지 확인합니다.
   알림: 유센트릭 높이가 제대로 식별되지 않으면 s를 기울일 때 큰 이미지 이동이 관찰됩니다.tage 정사각형 배율에서. 이는 그리드에 국부적 변형이 있는 경우(예: 그리드가 파손되거나 이미지화된 영역 부근에서 심하게 구부러진 경우)에도 발생할 수 있습니다. 데이터 수집을 위해 이러한 영역을 피하는 것이 가장 좋지만, 데이터 수집을 위한 몇 안 되는 유망한 영역 중 하나인 경우 유센트릭 높이를 정확하게 추정하는 것이 필수적입니다. 그림 3 은 유센트릭 높이를 제대로 식별하지 않고 타겟팅하면 정사각형 배율에서 큰 이미지 이동이 발생할 수 있음을 보여줍니다.
5. 더 정확한 Z 높이를 찾고, 포커서 노드를 사용하고, 시뮬레이트를 누릅니다.
   1. 일반적으로 포커서 노드의 Z 높이를 Square Acquisition Node에서 사용되는 배율로 추정합니다.
      참고: Focuser 노드 초점 시퀀스에는 데이터 수집 중 Hole Acquisition 노드 (Leginon 소프트웨어의 도구) 배율에서 미세한 Z 초점 추정이 포함될 수도 있습니다.
   2. 포커서 노드에 대한 설정을 조정하고 사각형의 초기 대기열 중에 미세 Z 초점 옵션을 활성화/비활성화합니다.
      알림: 자동 데이터 수집이 시작될 때 유센트릭 높이가 정확하게 식별되도록 하는 것이 중요하며, 이를 위해서는 미세 Z 초점을 다시 활성화해야 할 수 있습니다(2.10단계).
6. 표본 s를 기울입니다.tage 실제 유센트릭 높이에서 데이터 수집을 위해 원하는 기울기 각도로 이동하고 필요한 경우 s를 다시 중앙에 맞춥니다.tage. 이 연구에는 0°, 30° 및 60° 기울기 각도가 사용되었습니다. Square Acquisition 노드에서 Simulate 를 눌러 Hole Acquisition 노드 노출에 대한 타겟 대기열을 시작합니다.
   알림: 2.2.1 단계에서 표시한 바와 같이 그리드 아틀라스는 미리 정의된 s를 사용하여 기록할 수 있습니다.tage 기울기, s를 기울일 필요가 없습니다.tage 이 단계에서 다시. 이는 잘 작동하며 데이터 수집에 사용되는 기울기 각도가 미리 정의된 경우 프로세스 속도를 높입니다. 현재 프로토콜은 새로운 표본을 염두에 두고 작성되었으며, 사용자는 데이터 수집을 위해 다양한 기울기 각도를 테스트할 수 있습니다.
7. Z 초점 대상과 고배율 노출에 적합한 구멍이 있는 영역을 선택합니다.
8. Submit targets to queue for imaging(이미징을 위해 대기열에 대상 제출)을 누릅니다. 모든 사각형의 대기열이 완료될 때까지 Submit Queued Targets를 누르지 마십시오.
9. 시편 스테이지를 기울이지 않은 상태로 되돌립니다. 다음 사각형으로 이동하고 적절한 수의 구멍 노출이 대기열에 포함될 때까지 2.3-2.8단계를 반복합니다.
10. 구멍 타깃팅(Hole Targeting Node) 으로 이동하여 모든 사각형이 대기열에 들어간 후 대기열에 있는 타겟 제출(Submit Queued Targets) 을 누릅니다.
    참고: 시간을 절약하기 위해 이전에 미세 Z 포커스를 비활성화한 경우(2.5단계) 대기열을 제출하기 전에 다시 활성화해야 합니다.
11. 고배율 노출 획득 노드에서 선택한 대상을 수동으로 검사하여 시편 스테이지가 기울어졌을 때 자동 EM 구멍 파인더가 이미지 획득에 적합한 영역을 정확하게 식별할 수 있는지 테스트합니다.
    1. 이 절차 중에 노출 획득 노드 설정에서 '선택한 대상에 대한 사용자 확인 허용'을 선택합니다. 사용자가 타겟팅 정확도에 만족하면 자동 데이터 수집을 위해 이 옵션을 선택 취소합니다.
       참고: 고배율 노출 획득 노드의 대상은 일반적으로 빔-틸트 이미지 시프트 전략을 사용하여 이미지화되며, 이는 기울어진 데이터 수집 및 기울어지지 않은 데이터 수집^23,24,25,26 모두에 대해 동일하게 작동합니다. 다운스트림 데이터 처리 단계에서 정확한 CTF 추정을 위해서는 빔-틸트 이미지 시프트 데이터 수집 전략에 대해 렌즈-코마 수차 보정을 수행해야 합니다.

3. 데이터 처리

1. 데이터 수집 중 녹화된 동영상의 동작 보정, CTF 추정, 입자 선택 및 초기 재구성 생성을 통해 즉석 데이터 처리(10,27,28,29)를 시작합니다.
   참고: 본 연구에서는 cryoSPARC Live¹⁰ ( 재료 표 참조)을 전처리에 활용했습니다. 즉석 데이터 처리는 초기 Cryo-EM 재구성 및 각도 분포에 대한 근사치를 제공하여 사용자에게 분해능 이방성의 정도를 알릴 수 있습니다. 이들은, 차례로, 데이터 수집에 사용되는 틸트 각도가 충분히 높은지 아닌지에 대해 사용자를 안내하는 데 사용될 수 있다.
2. 재구성된 맵을 시각화하고 오일러 각도 분포를 플로팅하여 선호하는 입자 방향의 정도를 측정합니다.
   참고: 오일러 각도 분포는 분해능 이방성의 잠재적 범위를 결정하기 위해 푸리에 공간 샘플링 분포로 직접 변환될 수 있습니다. 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)는 사용자가 오일러 각도 분포의 품질을 평가하고 최적의 틸트 각도(^{30, 31})를 결정하는 것을 돕기 위해 개발되었다. 이 도구는 Github 리포지토리 https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui 에서 얻을 수 있습니다.
3. 필요한 경우 우선 방향의 영향을 극복하기 위해 데이터가 수집되는 스테이지 기울기 각도를 조정합니다. 3.2의 지도와 오일러 분포에서 알 수 있듯이 우선 방향이 문제로 남아 있는 경우 각도를 늘릴 수 있습니다. 대안적으로, 사용자는 데이터 수집을 그룹들로 분할하고, 20°, 30°, 및 40°와 같은 여러 상이한 틸트 각도를 사용하여 기록하기를 원할 수 있다.
   참고: 대부분의 TEM에는 스테이지를 70°로 기울일 수 있는 기능이 있어야 하지만 일반적인 시편 스테이지 틸트(우리가 사용한) 범위는 20°-40°입니다.

결과

0.3mg/mL의 DPS를 사용하여 0°, 30° 및 60° 기울기에서 이미징을 시연했습니다. 서로 다른 기울기 각도의 데이터는 서로 다른 그리드 영역의 동일한 그리드에서 수집되었습니다. 더 높은 각도 기울기에 대한 CTF 해상도 적합은 이 연구에서 세 가지 데이터 세트를 비교할 때와 같이 더 좋지 않은 경향이 있습니다. 그림 4 는 비교 대표 이미지와 2D 분류 평균을 보여줍니다. 단백질 농...

토론

공기-물 계면에 대한 시편 부착으로 인한 바람직한 입자 배향은 Cryo-EM SPA ^4,5,6을 사용한 일상적인 고분해능 구조 측정의 마지막 주요 병목 현상 중 하나입니다. 여기에 제시된 데이터 수집 체계는 데이터 세트 내에서 입자의 방향 분포를 개선하기 위한 구현하기 쉬운 전략을 제공합니다. 이 프로토콜은 추가 장비나 소프트웨어?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01