レギノンを用いたステージチルトを用いた単粒子クライオ電子顕微鏡データ収集

要約

本プロトコルは、クライオEM実験における傾斜した単一粒子データ収集のための一般化された実装が容易なスキームを記述している。このような手順は、空気-水界面への付着による優先配向バイアスに苦しんでいるサンプルの高品質のEMマップを取得するのに特に役立ちます。

要約

クライオ電子顕微鏡(クライオEM)による単粒子分析(SPA)は、現在、高分解能構造生物学の主流技術です。SPAによる構造決定は、氷の薄い層内でガラス化された高分子オブジェクトの複数の異なるビューを取得することに依存しています。理想的には、均一に分布したランダムな投影方向の集まりは、オブジェクトのすべての可能なビューになり、等方性の方向分解能を特徴とする再構成を引き起こします。しかし、実際には、多くのサンプルは、空気と水の界面に付着する優先配向粒子に苦しんでいます。これにより、データセット内の不均一な角度方位分布と再構成における不均一なフーリエ空間サンプリングが発生し、異方性分解能を特徴とするマップに変換されます。試料ステージを傾けると、方位分布の均一性、ひいてはフーリエ空間サンプリングの等方性が改善されるため、分解能異方性を克服するための一般化可能な解決策が提供されます。本プロトコルは、自動画像取得のためのソフトウェアであるLeginonを用いた傾斜ステージ自動データ収集戦略を記述する。この手順は実装が簡単で、追加の機器やソフトウェアを必要とせず、生体高分子のイメージングに使用されるほとんどの標準的な透過型電子顕微鏡(TEM)と互換性があります。

概要

過去10年間の直接電子検出器^の出現1,2,3は、単一粒子クライオEM4,5,6を使用して解決された高分子および高分子集合体の高分解能構造の数が指数関数的に増加しました。ほとんどすべての精製高分子種は、サイズが~10 kDa^{以下の最小}のタンパク質を除いて、クライオEMを使用した構造決定に適していると予想されます。グリッド調製および構造決定に必要な出発物質の量は、核磁気共鳴分光法およびX線結晶構造解析などの他の構造決定技術よりも少なくとも桁違いに少ない^4,5,6。

しかし、クライオEMによる構造決定の主な課題は、イメージングに適したグリッド調製です。さまざまなガラス化戦略とグリッドを使用して多様なサンプルを評価する広範な研究では、クライオEMグリッド上のサンプルをガラス化するためのほとんどのアプローチが、空気-水界面への高分子の優先接着につながることが示唆されました⁸。このような遵守は、潜在的に4つの最適ではない結果を引き起こす可能性があります:(1)高分子サンプルは完全に変性し、その場合、データ収集と処理を成功させることはできません。(2)サンプルが部分的に変性し、その場合、損傷を受けていない高分子の領域から構造的洞察を得ることができる可能性があります。(3)サンプルはネイティブ構造を保持していますが、電子ビームの方向に対する粒子の向きは1セットのみで画像に表されています。(4)サンプルはネイティブ構造を保持しており、電子ビームの方向に対する可能な粒子の向きがすべてではないが一部が画像に表されています。ケース(3)および(4)の場合、傾斜データ収集は、再構築されたクライオEMマップに影響を与える方向分解能異方性を最小限に抑えるのに役立ち、さまざまなサンプルに対して一般化可能なソリューションを提供します⁹。技術的には、変性はおそらく空気と水の界面で発生し、同様にデータ内で表される異なる方向の数を制限するため、傾斜はケース(2)にも利益をもたらす可能性があります。データセットの配向バイアスの程度は、溶液添加剤を試すことで変更できる可能性がありますが、幅広い適用性の欠如は、これらの試行錯誤のアプローチを妨げます。単一の最適化された傾斜角度で試料ステージを傾けることは、イメージング実験⁹ の形状を変更することにより、向きの分布を改善するのに十分である(図1)。電子線に対する優先配向試料の幾何学的構成に起因して、優先配向の各クラスターについて、グリッドを傾けると、クラスター重心に対する照明角度の円錐を生成する。したがって、これによりビューが広がり、その結果、フーリエ空間サンプリングと方向分解能の等方性が向上します。

実際には、ステージを傾けることにはいくつかの欠点があります。試料ステージを傾けると、視野全体に焦点勾配が導入され、コントラスト伝達関数(CTF)推定の精度に影響を与える可能性があります。傾斜したデータ収集は、傾斜した試料をイメージングする際の帯電効果の増加によって引き起こされるビーム誘起粒子の動きの増加にもつながる可能性があります。グリッドの傾きはまた、見かけの氷の厚さの増加につながり、それが今度はよりノイズの多い顕微鏡写真につながり、最終的には再構成の解像度に影響を与える可能性があります^5、9、10。プロトコルとディスカッションのセクションで簡単に説明されている高度な計算データ処理スキームを適用することで、これらの問題を克服できる場合があります。最後に、傾けると粒子のオーバーラップが増加し、その後の画像処理パイプラインが妨げられる可能性があります。これは、グリッド上の粒子濃度を最適化することである程度軽減できますが、それでも重要な考慮事項です。ここでは、Leginonソフトウェアスイート(自動画像取得ソフトウェア)を使用した傾斜データ収集のための実装が簡単なプロトコルが説明され、オープンアクセスが利用可能で、広範囲の顕微鏡と互換性がある¹¹、^12、13、14。この方法には少なくともバージョン3.0以降が必要であり、バージョン3.3以降には、傾斜したデータ収集を可能にするための専用の改善が含まれています。このプロトコルには、追加のソフトウェアや機器は必要ありません。計算インフラストラクチャとインストールガイドに関する広範な手順は、他の場所で提供されています¹⁵。

プロトコル

1. サンプル調製

1. 金箔と金グリッドサポート¹⁶ ( 材料表を参照)を含むグリッドを使用すると、傾斜したデータ収集がビーム誘起運動を強調する可能性があるため¹⁷。
   注:本研究では、グリッド上のサンプルを、加湿された(80%を超える)冷蔵室(~4°C)で手動プランジおよびブロッティング技術¹⁸ を使用してガラス化しました。
2. 銅支持体とカーボンフォイルを含むグリッド、またはアモルファスカーボンの連続層は、試験片ステージが傾いたときにビーム誘起運動¹⁶ を大きくする可能性があるため、絶対に必要な場合を除いて使用しないでください。
   注:グラフェン/酸化グラフェンなどの代替支持層は、アモルファスカーボン^19,20と比較してビーム誘起運動を減少させるようです。
3. グリッドを事前にスクリーニングし、許容可能な氷の厚さと粒子分布によって特徴付けられる領域を特定します。粒子が密集しすぎると、傾斜したデータ収集中に粒子が重なり、下流のデータ処理ステップに影響を与える可能性があります。
   注:氷の良い領域を特定するには、粒子のコントラストが明確な領域の焦点が合っていない画像を視覚的に検査することによって実行されるため、これらの手順は主観的です。一部のサンプルは薄い氷の領域に効率的に分布せず、データ収集中に課題が生じるため、これはすべてのサンプルで実現可能とは限りません(ディスカッションセクションで説明)。
4. タンパク質サンプルを含むグリッドをガラス化します。ここでは、デモンストレーションの目的で、飢餓中のDNA保護(DPS)タンパク質( 材料の表を参照)を金箔と金サポートグリッドで0.1〜0.5 mg / mLの範囲で使用します。
   注:タンパク質は、TEVプロテアーゼ切断が行われなかったことを除いて、前述のように精製した²¹。対象サンプルのタンパク質濃度範囲は、普遍的に適用可能な理想的な範囲を測定することが困難であり、ほぼ確実に異なるサンプル間で異なるため、個別に最適化する必要があります。

2. 傾斜データ収集の設定

1. 顕微鏡の位置を合わせて、標本の平行照明を確保し、コマ収差を最小限に抑えます²²。
   注:顕微鏡は、ステージチルトのない標準的なSPAデータ収集のために適切に位置合わせされている必要があります。傾斜したデータ収集に特別なアライメントは必要ありませんが、適切なアライメントにより、ターゲティングとイメージングがスムーズに進行します。傾斜したデータ収集と傾斜していないデータ収集を比較する一般的なスキームを 図2に示します。
2. ステージチルトのないグリッドアトラスを記録して、データ収集に適した正方形を特定するか、正方形 取得ノードで使用される倍率で正方形を手動で検査します。ホイルが無傷で、脱水状態ではなく、理想的な氷の厚さの正方形を探します。
   注意: スクエアアクイジション ノードは、レジノンでのマルチスケールイメージングに使用される低倍率ノードです。
   1. 典型的な傾斜のない自動データ収集では、グリッドアトラスを記録し、グリッド全体の品質の概要とデータ収集に適した領域の初期表示を提供します。
   2. その後、アトラスから適切な正方形を選択し、キューに送信します。次に、穴を手動で選択するか、自動EM穴ファインダーを使用して、穴ターゲットをキューに入れて送信します。
   3. 最後に、自動EMホールファインダーを使用して、高倍率露光ターゲットを送信します。
      注意: 傾斜データ収集の場合、特に最適な傾斜角度が事前に決定されておらず、データ収集中に調整される可能性がある場合は、一貫した結果を得るために正方形を手動でキューに入れる必要がある場合があります。グリッドアトラスは、データ収集に使用される傾斜角度が以前に確立されている場合、事前定義されたステージチルトを使用して記録することもできます。
3. 試験片ステージを目的の正方形に移動します。
4. ステージ位置のユーセントリック高さは、ステージを15°傾けたαワブラーを使用して±決定します。顕微鏡のキーパッドパネルを使用して、Z高さを調整してステージをユーセントリックの高さにします。αウォブルルーチン中の画像シフトが最小限であることを確認してください。
   注意: ユーセントリックの高さが正しく特定されていない場合、正方形の倍率でステージを傾けると、大きな画像シフトが観察されます。これは、グリッドに局所的な変形がある場合、たとえば、グリッドが壊れたり、画像化された領域の近くで大きく曲がったりした場合にも発生する可能性があります。このような領域はデータ収集には避けるのが最善ですが、真心円の高さがデータ収集に有望な数少ない領域の1つである場合は、正確に推定することが不可欠です。 図3 は、ユーセントリックの高さを適切に特定せずにターゲティングすると、正方形の倍率で大きな画像シフトが発生する可能性があることを示しています。
5. より正確な Z 高さを検索し、[ フォーカサー] ノードを使用して [シミュレーション] を押します。
   1. 通常、 フォーカサーノードの Z高さは、 正方形取得ノードで使用される倍率で推定します。
      注意: フォーカサーノードの フォーカスシーケンスには、データ収集中の 穴取得ノード (Leginonソフトウェアのツール)倍率での細かいZフォーカス推定を含めることもできます。
   2. フォーカサーノードの設定を調整し、正方形の初期キューイング中に細かいZフォーカスオプションを有効/無効にします。
      注意: 自動データ収集の開始時にユーセントリックの高さが正確に識別されていることを確認することが重要であり、細かいZフォーカスを再度有効にする必要がある場合があります(ステップ2.10)。
6. 真のユーセントリック高さでデータ収集のために試料ステージを希望の傾斜角度に傾け、必要に応じてステージを再センタリングします。この研究では、0°、30°、および60°の傾斜角を使用しました。スクエア取得ノードの「シミュレーション」(Simise) を押して、穴取得ノードの露出のターゲットのキューイングを開始します。
   注意: ステップ2.2.1で示されているように、グリッドアトラスは事前定義されたステージチルトを使用して記録できるため、このステップでステージを再度チルトする必要がなくなります。これはうまく機能し、データ収集に使用される傾斜角が事前に定義されている場合、プロセスを高速化します。現在のプロトコルは、新しい標本を念頭に置いて書かれており、ユーザーはデータ収集のためにさまざまな傾斜角度をテストしたいと思うかもしれません。
7. Z フォーカスターゲットと、高倍率露光に適した穴のある領域を選択します。
8. [ターゲットを送信してイメージングのキューに入れる] を押します。すべての正方形をキューに入れ終えるまで、[キューに入れられたターゲットの送信]を押さないでください。
9. 試験片ステージを傾けていない状態に戻します。次の正方形に移動し、適切な数の穴露光がキューに入れられるまで手順2.3〜2.8を繰り返します。
10. ホールターゲティングノードに移動し、すべてのマスがキューに入れられたら、キューに入れられたターゲットを送信を押します。
    注: 時間を節約するために以前に Z フォーカスを無効にしていた場合 (手順 2.5)、キューを送信する前に再度有効にする必要があります。
11. 高倍率 露光取得ノード によって選択されたターゲットを手動で検査して、自動EMホールファインダーが標本ステージを傾けたときに画像取得に適した領域を正確に識別できるかどうかをテストします。
    1. この手順では、 露出取得ノード の設定で[選択したターゲットのユーザー検証を許可する]を選択します。ユーザーがターゲティングの精度に満足したら、このオプションの選択を解除して自動データ収集を行います。
       注:高倍率露光取得ノードのターゲットは、通常、ビームチルト画像シフト戦略を使用して画像化され、傾斜したデータ収集と傾いていないデータ収集の両方で等しく機能します²³、^24、25、26。ダウンストリームデータ処理ステップで正確なCTF推定を行うには、ビームチルト画像シフトデータ収集戦略のためにレンズコマ収差キャリブレーションを実行する必要があります。

3. データ処理

1. 記録された動画の動き補正、CTF推定、粒子選択、およびデータ収集中の初期再構成の生成により、オンザフライデータ処理¹⁰、^27、28、29を開始します。
   注:本研究では、cryoSPARC Live¹⁰ ( 材料表を参照)が前処理に利用されています。オンザフライのデータ処理により、最初のクライオEM再構成と角度分布の近似が得られ、分解能の異方性の程度をユーザーに知らせることができます。これらは、次に、データ収集に使用される傾斜角が十分に高いかどうかをユーザに案内するために使用することができる。
2. 再構築されたマップを視覚化し、オイラー角分布をプロットして、好ましい粒子の向きの範囲を測定します。
   注:オイラー角分布をフーリエ空間サンプリング分布に直接変換して、分解能異方性の潜在的な範囲を決定できます。グラフィカルユーザインタフェース(GUI)は、ユーザがオイラー角分布の品質を評価し、最適な傾斜角を決定するのを支援するために開発された^30,31。このツールは、https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui Github リポジトリから入手できます。
3. 必要に応じて、データが収集されるステージ傾斜角度を調整して、優先方向の影響を克服します。3.2のマップとオイラー分布によって証明されるように、優先方向が問題のままである場合は、角度を増やすことができます。あるいは、ユーザーはデータ収集をグループに分割し、20°、30°、40°などのいくつかの異なる傾斜角度を使用して記録することもできます。
   注:ほとんどのTEMにはステージを70°傾ける機能が必要ですが、一般的な試料ステージの傾き(私たちが使用した)は20°〜40°の範囲です。

結果

0.3 mg/mLのDPSを使用して、0°、30°、および60°の傾斜でのイメージングを実証しました。異なる傾斜角度からのデータは、異なるグリッド領域の同じグリッド上で収集された。この研究の3つのデータセットを比較する場合と同様に、より高い角度の傾きに対するCTF解像度の適合度は低くなる傾向があります。 図4 は、比較代表画像と2D分類平均を示しています。タンパク?...

ディスカッション

空気-水界面への試料の付着によって引き起こされる好ましい粒子配向は、クライオEM SPA ^4,5,6を使用した日常的な高分解能構造決定の最後の主要なボトルネックの1つです。ここで紹介するデータ収集スキームは、データセット内の粒子の配向分布を改善するための実装が容易な戦略を提供します。このプロトコルは追加の?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cryosparc Live v3.1.0+210216	Structura Biotechnology
DPS protein			Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector	Gatan
Leginon software suite			C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device			Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica	FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids	Quantifoil	N1-A14nAu30-01