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Resumen

Muchos genes regulados al alza estimulan la migración y la invasión de las células tumorales, lo que lleva a un mal pronóstico. Es fundamental determinar qué genes regulan la migración y la invasión de las células tumorales. Este protocolo presenta un método para investigar los efectos del aumento de la expresión de un gen en la migración e invasión de células tumorales en tiempo real.

Resumen

Las células tumorales son altamente móviles e invasivas y muestran patrones de expresión génica alterados. El conocimiento de cómo los cambios en la expresión génica regulan la migración e invasión de células tumorales es esencial para comprender los mecanismos de infiltración de células tumorales en los tejidos sanos vecinos y la metástasis. Anteriormente, se demostró que la eliminación de genes seguida de la medición en tiempo real basada en impedancia de la migración e invasión de células tumorales permite la identificación de los genes necesarios para la migración e invasión de células tumorales. Recientemente, las vacunas de ARNm contra el SARS-CoV-2 han aumentado el interés en el uso de ARNm sintético con fines terapéuticos. Aquí, se revisó el método que utiliza ARNm sintético para estudiar el efecto de la sobreexpresión génica en la migración e invasión de células tumorales. Este estudio demuestra que la expresión génica elevada con transfección sintética de ARNm seguida de una medición en tiempo real basada en impedancia puede ayudar a identificar los genes que estimulan la migración e invasión de células tumorales. Este artículo sobre el método proporciona detalles importantes sobre los procedimientos para examinar el efecto de la expresión génica alterada en la migración e invasión de células tumorales.

Introducción

La motilidad de las células tumorales juega un papel crucial en la metástasis 1,2. La diseminación de las células tumorales a los tejidos sanos vecinos y remotos dificulta el tratamiento del cáncer y contribuye a la recurrencia 3,4. Por lo tanto, es esencial comprender los mecanismos de motilidad de las células tumorales y desarrollar estrategias terapéuticas relevantes. Dado que muchas células tumorales tienen perfiles de expresión génica alterados, es crucial comprender qué cambios en el perfil de expresión génica conducen a una motilidad alterada de las células tumorales 5,6.

Se han desarrollado varios ensayos para medir la migración celular in vitro. Algunos ensayos solo proporcionan información limitada debido a que solo permiten mediciones en puntos de tiempo específicos, mientras que otros ofrecen información completa sobre la motilidad de las células tumorales en tiempo real7. Aunque muchos de estos ensayos de motilidad celular pueden proporcionar resultados cuantitativos en un momento dado o en el punto final, no proporcionan información suficientemente detallada sobre los cambios dinámicos en la tasa de migración celular durante el período experimental. Además, puede ser difícil examinar los posibles cambios en la tasa de migración celular dependiendo del diseño experimental, los tipos de células y el número de células. Además, los efectos de los tratamientos sin complicaciones pueden investigarse mediante la cuantificación simple de los ensayos de motilidad tradicionales, pero puede ser necesaria una cuantificación más sofisticada para estudiar los efectos complejos de varios tratamientos combinados8.

Se ha desarrollado un instrumento para monitorizar la corriente eléctrica de un pozo de placa de microtitulación cubierto con microelectrodos9. La adhesión de las células a la superficie del pozo impide el flujo de electrones, y la impedancia se correlaciona con la unión cuantitativa y cualitativa de las células. La presencia de los microelectrodos en el fondo del pozo permite medir la adhesión, propagación y proliferación celular. La presencia de los microelectrodos debajo de una membrana microporosa de la cámara superior permite medir la migración celular y la invasión hacia la cámara inferior, con la cámara superior recubierta con proteínas de la matriz extracelular (MEC) para permitir la invasión10.

Anteriormente, se demostró que las mediciones en tiempo real basadas en impedancia de la migración e invasión de células tumorales proporcionan datos en tiempo real durante todo el experimento, así como comparaciones y cuantificaciones instantáneas en diversas condiciones experimentales11. En ese artículo de método, se indujo la eliminación de genes para probar el papel de las proteínas de interés en la migración e invasión de células tumorales. Dado que un efecto de eliminación de genes en toda regla en las condiciones experimentales probadas tardó 3-4 días después de la electroporación con pequeños ARN interferentes (siRNAs)8, las células se recolocaron después de la electroporación y se volvieron a cosechar 3 días después para la medición en tiempo real basada en la impedancia de la migración e invasión de las células tumorales.

CT10 regulador de la quinasa (Crk) y similar a la Crk (CrkL) son proteínas adaptadoras que median las interacciones proteína-proteína aguas abajo de varias vías de la quinasa receptora del factor de crecimiento y las vías de la tirosina quinasa no receptora12. Los niveles elevados de las proteínas Crk y CrkL contribuyen a un mal pronóstico en varios cánceres humanos, incluido el glioblastoma13. Sin embargo, no está claro cómo las proteínas Crk y CrkL elevadas conducen a un mal pronóstico. Por lo tanto, es importante definir el efecto de la sobreexpresión de Crk y CrkL sobre las funciones de las células tumorales. Anteriormente, se realizó un estudio de knockdown génico para demostrar que los niveles endógenos de las proteínas Crk y CrkL son necesarios para la migración e invasión de células de glioblastoma8. Aquí, se ha desarrollado un sistema de ensayo modificado para abordar el efecto de la sobreexpresión de Crk y CrkL en la migración e invasión de células tumorales.

Recientemente, la síntesis in vitro de ARNm y sus aplicaciones terapéuticas han vuelto a llamar la atención debido al desarrollo de las vacunas de ARNm contra el SARS-CoV-2 (revisado por Verbeke et al.14). Además, se han logrado avances notables en el uso de ARNm sintético en cáncer y otras enfermedades15,16. La electroporación de células es un método eficaz para administrar ARNm sintético e inducir modificaciones genéticas transitorias (revisado por Campillo-Davo et al.17), y el uso de ARNm sintético permite una expresión génica rápida y eficiente en fibroblastos inmortalizados18. Este artículo de método combina la sobreexpresión génica utilizando ARNm sintético con análisis celulares en tiempo real para estudiar la migración e invasión de células tumorales. Sin embargo, el esquema experimental utilizado para los siRNAs no funciona con la transfección de ARNm sintético, ya que el nivel de proteínas exógenas aumenta rápidamente y disminuye gradualmente tras la transfección de ARNm sintético18. Por lo tanto, el método se ha modificado para llevar a cabo el análisis en tiempo real de la migración e invasión celular justo después de la transfección sin cultivar adicionalmente las células.

Este artículo de método demuestra que la combinación de mediciones en tiempo real basadas en impedancia con la transfección de células tumorales con ARNm sintéticos proporciona un análisis rápido y completo de los efectos de la regulación positiva de genes en la migración e invasión de células tumorales. Este artículo describe procedimientos detallados para medir cómo la migración y la invasión de las células de glioblastoma se ven afectadas por la sobreexpresión de Crk y CrkL. Al examinar los efectos dependientes de la concentración del ARNm sintético en la migración de células tumorales, el artículo describe claramente cómo un aumento en los niveles de proteínas estimula la migración de células tumorales. Además, se presenta un enfoque de variación de la concentración del gel de MEC para evaluar los efectos de los cambios en la expresión génica sobre la invasión de células tumorales.

Protocolo

1. Síntesis de ARNm

NOTA: Para la síntesis de ARNm, todos los reactivos y equipos deben ser tratados especialmente para inactivar las ARNasas antes de su uso. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, instrumentos y reactivos utilizados en este protocolo.

  1. Linealización del ADN
    NOTA: Los ADNc de ratón de CrkI y CrkL se clonaron en el vector de expresión pFLAG-CMV-5a para añadir la etiqueta de epítopo FLAG en el extremo C-terminal y se subclonaron en el vector pcDNA3.1/myc-His para incorporar el promotor T7, como se ha descrito anteriormente18,19.
    1. Añadir 10 μL de tampón de reacción 10x, 1,5 μL de PmeI (10.000 unidades/mL) y 10 μg de ADN plasmídico a un tubo de microcentrífuga para linealizar el ADN plasmídico con la enzima de restricción. Agregue agua sin nucleasa para llevar el volumen de reacción a 100 μL.
    2. Mezclar golpeando, centrifugar e incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante la noche.
    3. Centrifugar y añadir 5 μL de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% y 1 μL de proteinasa K (20 mg/mL, grado ARN) a la mezcla de reacción. Mezclar golpeando, centrifugar e incubar a 50 °C durante 30 min.
    4. Debajo de la campana extractora, agregue 100 μL de la fase inferior de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico a la mezcla de reacción de plásmidos. Vórtice y luego centrifugar a 18.800 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Mueva la fase superior a un nuevo tubo.
    5. Repita el paso 1.1.4 con cloroformo:alcohol isoamílico a 24:1.
    6. En el nuevo tubo, lleve el volumen de reacción a 300 μL agregando 200 μL de agua libre de nucleasa, y luego agregue 30 μL de acetato de sodio 3 M y 600 μL de etanol al 100%.
    7. Mezclar por vórtice y luego colocar a -20 °C durante 30-60 min para la precipitación de etanol del ADN.
    8. Centrifugar a 18.800 × g durante 20 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y enjuagar el pellet con 1 mL de etanol al 70%. Repita la centrifugación durante 10 minutos y luego retire el sobrenadante por completo.
    9. Secar con el tapón abierto durante 2 min, añadir 30 μL de agua sin nucleasa y volver a suspender el gránulo de ADN.
    10. Determinar la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro.
    11. Verificar el tamaño y la cantidad del ADN linealizado mediante electroforesis en gel de agarosa.
  2. Síntesis de ARN utilizando la ARN polimerasa T7
    1. Agregue 2 μL de cada uno de 10x tampón de transcripción, ATP, GTP, UTP, CTP y T7 y 1 μg de un ADN linealizado a un tubo de microcentrífuga. Añadir agua sin nucleasa para llevar el volumen de reacción a 20 μL.
    2. Mezclar golpeando, centrifugar e incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 2 h para la síntesis de ARN.
    3. Centrifugar, añadir 1 μL de DNasa (2 U/μL) e incubar a 37 °C durante 15 min para eliminar el ADN molde.
  3. Precipitación de cloruro de litio del ARN
    1. Añadir 10 μL de cloruro de litio (7,5 M) a la mezcla de reacción. Mezclar golpeando, centrifugar e incubar la mezcla de reacción a -20 °C durante 30 min.
    2. Centrifugar a 18.800 × g durante 20 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y enjuagar el pellet con 500 μL de etanol al 70%. Repita la centrifugación durante 10 minutos y luego retire el sobrenadante por completo.
    3. Secar con el tapón abierto durante 2 min, añadir 30 μL de agua libre de nucleasa y volver a suspender el gránulo de ARN.
  4. Capsular
    1. Calentar la muestra de ARN a 65 °C durante 10 minutos y, a continuación, colocarla en hielo para que se enfríe.
    2. Agregue 5 μL de cada uno de 10x de tampón de taponamiento, 10 mM de GTP y 1 mM (10x) de S-adenosilmetionina (SAM), 2 μL de cada una mezcla de enzimas de recubrimiento y una mezcla de enzimas O-metiltransferasa, y 1,25 μL de inhibidor de RNasa. Mezclar golpeando, centrifugar e incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 1 h.
  5. Relaves Poly(A)
    1. Gire la muestra y luego agregue 6 μL de agua libre de nucleasas, 20 μL de tampón E-PAP 5x, 10 μL de 25 mM MnCl2, 10 μL de ATP 10 mM y 4 μL de enzima de relaves E-PAP poli(A). Mezclar golpeando, centrifugar e incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 2 h.
  6. Precipitación de cloruro de litio y cuantificación del ARNm sintético
    1. Añadir 50 μL de cloruro de litio (7,5 M) y realizar la precipitación de cloruro de litio como se describe en los pasos 1.3.1-1.3.3.
    2. Mida la concentración del ARNm con un espectrofotómetro.
    3. Verificar el tamaño y la cantidad de ARNm mediante electroforesis en gel de formaldehído (1%-2%) de agarosa (1%).

2. Recubrimiento en gel de matriz extracelular (MEC) de las placas de invasión y migración celular (CIM)

NOTA: Una placa de invasión y migración celular (CIM) es una placa de 16 pocillos fabricada comercialmente para el análisis celular en tiempo real basado en impedancia. Para el ensayo de invasión celular, recubra las placas CIM con gel ECM, como se describió anteriormente, pero con algunas modificaciones11.

  1. Retire una alícuota de caldo de gel ECM del congelador y manténgala en hielo.
  2. Diluir el gel de ECM (10 mg/mL) a una concentración de trabajo (100 μg/mL) mezclando 990 μL de Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco (sin suero ni antibióticos) con 10 μL de gel de ECM en un tubo de microcentrífuga. Mezclar mediante un pipeteo suave.
  3. Añadir 60 μL de gel de ECM diluido a cada uno de los 16 pocillos de la cámara superior de la placa CIM. Aplicar el método de pipeteo inverso evitando las burbujas de aire20,21.
    NOTA: Optimice la concentración del gel de ECM para cada línea celular. Para las líneas celulares de glioblastoma, se utilizó gel de ECM de 0,1 μg/μl a 1 μg/μl para la optimización.
  4. Coloque la cámara superior de la placa CIM sin la cubierta de la placa sobre una lámina protectora de plástico dentro de una incubadora deCO2 durante aproximadamente 4 h para formar una capa de gel.
    PRECAUCIÓN: Durante el recubrimiento de la placa CIM con gel ECM, los electrodos de la cámara superior de la placa CIM no deben tener contacto directo con las manos del experimentador o las superficies del equipo, incluida la cabina de bioseguridad o la incubadora de CO2 .

3. Preparación de las células tumorales

NOTA: Todos los materiales de cultivo celular deben mantenerse estériles. Recolectar y electropopar las células tumorales bajo una cabina de seguridad biológica con equipo de protección personal (EPP) adecuado, como se describió anteriormente, pero con algunas modificaciones11.

  1. Cultivo de las células tumorales
    1. Cultivo de células U-118MG en 10 mL de DMEM que contienen un 5% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de antibióticos por placa de cultivo de tejidos de poliestireno de 100 mm x 20 mm a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% (condición de cultivo).
  2. Depleción sérica de las células tumorales
    NOTA: La exposición de las células a los quimioatrayentes presentes en el FBS debe minimizarse antes de los ensayos de migración e invasión celular mediante el uso de una alta concentración de FBS.
    1. Retire el medio viejo y agregue 10 ml de DMEM precalentado que contenga 0.5% de FBS y 1% de antibióticos por placa (medio con bajo contenido sérico).
    2. Repita el paso 3.2.1.
    3. Incubar las células a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2 durante 4 h o más.
  3. Recolección de las células tumorales
    1. Retire el medio viejo, agregue 8 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) precalentada de Dulbecco por placa, retire el DPBS, agregue tripsina-EDTA precalentada al 0,05% (2 ml/placa) para cubrir la superficie e incube en la incubadora deCO2 durante 30 s.
    2. Aspire la tripsina-EDTA con cuidado, agregue medio sérico bajo (7 ml/placa) y luego recoja las células en un tubo de centrífuga de 50 ml o 15 ml.
    3. Alícuota un pequeño volumen de células y utilice un contador de células automatizado de mano para contar las células.
    4. Calcule el número total de células y el volumen necesario para 10.000 células/μL.
    5. Centrifugar las células centrifugando a 100 × g durante 5 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante, añadir el volumen calculado de DMEM que contenga un 0,5% de FBS (sin antibióticos) y resuspender suavemente el gránulo celular.
    6. Transfiera 110 μL de la suspensión celular, que contiene 1,1 millones de células, a un tubo de microcentrífuga para cada tratamiento.
    7. Repita el paso 3.3.6 para transferir las células a cuatro tubos de microcentrífuga para cuatro tratamientos diferentes.
      NOTA: Una placa CIM tiene un total de 16 pocillos. Diseñe cuatro tratamientos diferentes para la comparación, de modo que se puedan asignar cuatro pocillos de la placa CIM para cada tratamiento. Utilice las células electroporadas para los siguientes experimentos: análisis de Western blot (0,3 millones de células por placa de cultivo de tejidos de 35 mm), cuatro pocillos de ensayos de migración celular en tiempo real (0,1 millones de células/pocillo) y cuatro pocillos de ensayos de invasión celular en tiempo real (0,1 millones de células/pocillo) para cada tratamiento. Ajuste el número de celdas que deben electroporarse si cambia el diseño experimental.

4. Electroporación de las células tumorales

  1. Para eliminar el medio, agregue 1 ml de DPBS a la suspensión celular en cada tubo, gire la suspensión celular tres veces durante 10 s cada vez mientras gira el tubo 180° cada 10 s con una mini centrífuga y retire el sobrenadante con una micropipeta.
    NOTA: Es importante formar un gránulo celular compacto pero fácilmente resuspendible.
  2. Agregue 110 μL de tampón de resuspensión R al gránulo celular para obtener 0,1 millones de células en 10 μL.
  3. Añadir ARNm sintético al gránulo celular para obtener una concentración de 0,2-20 ng/μL dependiendo del nivel de expresión deseado. Mezcle y vuelva a suspender el gránulo celular suavemente mediante golpecitos o pipeteos suaves.
    NOTA: Utilice diferentes concentraciones de ARNm sintético, examine la expresión de la proteína mediante el análisis de Western blot y determine la concentración de ARNm sintético que conduce al nivel de expresión deseado para investigar la correlación específica entre la expresión de la proteína y los efectos biológicos.
  4. Electroporar 10 μL de la suspensión celular con un sistema de electroporación a 1.350 V durante 10 ms con tres pulsos cada vez.
  5. Transfiera las celdas electroporadas a un nuevo tubo de microcentrífuga con 1,1 mL de DMEM que contenga 0,5% de FBS.
  6. Repita la electroporación hasta que el resto de la suspensión celular esté electroporada. Combine las celdas electroporadas en el tubo de microcentrífuga para obtener 1,1 millones de celdas en 1,1 mL.
    NOTA: Las puntas de electroporación de 100 μL y 10 μL se pueden usar para electroporear un gran volumen de células, pero las puntas de electroporación para 10 μL y 100 μL se incluyen en dos kits separados y deben comprarse por separado. El tampón de resuspensión R está incluido en ambos kits.
  7. Una vez completadas todas las electroporaciones respectivas, vuelva a suspender suavemente las células agrupadas.
  8. Coloque 0,3 millones de células en una placa de cultivo de tejidos de poliestireno de 35 mm x 10 mm con 2 ml de DMEM que contenga un 5% de FBS, y cultive las células durante 1 día en condiciones de cultivo para la preparación de lisado celular total y análisis de Western blot.
  9. Mantenga el resto de las celdas electroporadas a temperatura ambiente hasta que el sistema de análisis de celdas en tiempo real esté listo.

5. Configuración del analizador celular en tiempo real, el programa y las placas CIM

NOTA: Prepare el analizador celular en tiempo real y dos placas CIM, como se describió anteriormente11.

  1. Equilibrio del analizador de células en tiempo real
    1. Mueva el analizador celular en tiempo real a una incubadora deCO2 varias horas antes de su uso para equilibrar el sistema en condiciones de cultivo.
  2. Configuración del programa de análisis
    1. Abra el programa de análisis haciendo doble clic en el icono del software de análisis de celdas en tiempo real en el escritorio.
    2. Una vez abierta la opción Configuración predeterminada del patrón de experimento , seleccione la opción para ejecutar tres experimentos por separado.
      NOTA: Cada cuna tiene una ventana separada. Hay diferentes pestañas para configurar el intervalo y la duración de la medición, el análisis de datos y otras condiciones experimentales.
    3. Abra cada base haciendo clic en la pestaña Número .
    4. Haga clic en la pestaña Notas del experimento, seleccione la carpeta en la que se guardarán los datos e introduzca el nombre del experimento .
    5. Haga clic en la pestaña Diseño , configure pocillos cuadruplicados para cada condición de tratamiento seleccionando cuatro pocillos a la vez e ingresando la información de la muestra, y luego haga clic en Aplicar.
    6. Haga clic en la pestaña Programación | Agregue un paso para configurar el modo de dos pasos de las mediciones de impedancia de la celda. A continuación, haz clic en Aplicar para configurar el primer paso.
    7. Vuelva a hacer clic en Agregar un paso, ingrese 10 minutos para el intervalo y 48 h para la duración de la migración y la invasión, y haga clic en Aplicar para configurar el segundo paso.
      NOTA: El primer paso realiza una medición de referencia única (un barrido con un intervalo de 1 minuto). El segundo paso mide la impedancia celular para el experimento (por ejemplo, 289 barridos con un intervalo de 10 minutos durante 48 h) en la cuna. Ajustar el intervalo y la duración en función del diseño experimental.
    8. Desplácese a la siguiente base y configúrela repitiendo los pasos 5.2.3-5.2.7.
  3. Preparación de las placas CIM
    1. Una hora antes de que comience la medición de la impedancia celular, llene los pocillos de la cámara inferior de la placa CIM con 160 μL de DMEM que contenga un 10% de suero u otros quimioatrayentes.
    2. Ensamble la cámara superior que contiene los pocillos recubiertos de gel ECM (para invasión) o pocillos no recubiertos (para migración) con la cámara inferior.
    3. Agregue 50 μL de medio sérico bajo a los pocillos de la cámara superior de la placa CIM para el ensayo de migración celular y coloque la placa CIM en la cuna del sistema.
    4. Haga clic en la pestaña Mensaje y asegúrese de que se muestre el mensaje Conexiones correctas . La placa CIM ya está lista para el experimento.
    5. Preincube la placa CIM ensamblada en la incubadora de CO2 durante 30-60 minutos antes del análisis celular en tiempo real para aclimatar la placa CIM a la condición de cultivo.

6. Análisis de celdas en tiempo real y exportación de datos

NOTA: Realice una lectura de línea base, siembra de celdas, medición de impedancia de celda y exportación de datos como se describió anteriormente11.

  1. Lectura de línea de base
    NOTA: La línea de base debe leerse después de que la placa CIM esté aclimatada y antes de que las celdas se agreguen a los pocillos de la cámara superior.
    1. Haga clic en el botón Inicio de cada base. Cuando aparezca la ventana Guardar como , guarde el archivo experimental para realizar la lectura de la línea base.
  2. Siembra celular
    1. Retire la placa CIM de la base y colóquela en el gabinete de bioseguridad en el soporte de la placa.
    2. Añadir 100 μL (que contiene 100.000 células) de células electroporadas a los pocillos de la cámara superior de la placa CIM según el programa de la unidad de control. Aplique el método de pipeteo inverso evitando las burbujas de aire.
    3. Deje la placa CIM debajo de la cabina de bioseguridad durante 30 minutos a temperatura ambiente para asegurarse de que las células se esparzan uniformemente en el fondo del pocillo.
  3. Medición de impedancia de celda
    1. Mueva la placa CIM completamente ensamblada de nuevo a la base respectiva. Haga clic en el botón Inicio de la base para comenzar la medición de la impedancia de la celda para el segundo paso.
    2. Haga clic en la pestaña Trazar y, a continuación, haga clic en el botón Agregar todo y seleccione las casillas Promedio y STD DEV para visualizar los datos en tiempo real.
      NOTA: La opción de trazado predeterminada es Tiempo para el eje x e Índice de celda para el eje y. La sección Selección de trazado permite al usuario seleccionar opciones alternativas para el eje Y: Índice de celda normalizado o Índice de celda Delta. Una vez realizado el barrido final, se completa el experimento y los resultados se guardan automáticamente.
  4. Exportación de los datos para su análisis
    1. Haga clic en la pestaña Trazar y seleccione las casillas Promedio y STD DEV para copiar los datos de cada pozo individualmente.
    2. Haga clic con el botón derecho en el área de trazado y seleccione Copiar datos en formato de lista.
    3. Abra un archivo de hoja de cálculo vacío, pegue los datos y, a continuación, guarde el archivo.
    4. Vuelva al programa de análisis, haga clic en la pestaña Placa de cada base y seleccione Liberar para cerrar el experimento de la base.
    5. Vuelva al archivo de hoja de cálculo y ajuste la hora de los datos sin procesar para que la hora de inicio en el segundo paso se convierta en la hora de inicio real de la medición.

Resultados

Las proteínas Crk y CrkL desempeñan un papel importante en la motilidad de muchos tipos de células, incluidas las neuronas22, las células T23, los fibroblastos 18,19 y una variedad de células tumorales13. Dado que se ha descrito que las proteínas Crk y CrkL están elevadas en el glioblastoma24,25,26, en este trabajo se estudiaron los efectos de la sobreexpresión...

Discusión

La migración y la invasión son características importantes de las células tumorales. La medición de la motilidad de las células tumorales y la comprensión del mecanismo subyacente que controla la motilidad de las células tumorales proporcionan información crítica sobre las intervenciones terapéuticas 2,27. Se han desarrollado varios métodos para estudiar la migración celular7. El ensayo de cicatrización de heridas mediante ar...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Centro de Redacción Médica de Children's Mercy Kansas City por editar este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Fundación A.R.T. de Natalie (a T.P.) y por una subvención de la Junta Asesora de Socios de MCA del Children's Mercy Hospital (CMH) y el Centro Oncológico de la Universidad de Kansas (KUCC) (a T.P.).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AlphaImager HPProteinSimple92-13823-00Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibodySigmaT9026Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16Agilent Technologies, Inc5665825001Cell invasion and migration plates
Crk antibodyBD Biosciences610035Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibodySanta Cruzsc-319Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)ATCC302002Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Corning21-031-CVBuffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS)HycloneSH30910.03Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubatorThermo Scientific51030285CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibodyLi-Cor926-32210Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibodyLi-Cor926-32211Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride InvitrogenAM9480Used for RNA precipitation
Matrigel matrixCorning354234Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kitInvitrogenAM1334Used for RNA synthesis
Millennium RNA markersInvitrogenAM7150Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifugeISC BioExpressC1301P-ISCUsed to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNATaKaRa637301Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuantTecanM200PRONucleic acid quantification system
Neon electroporation system ThermoFisher ScientificMPK5000Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kitThermoFisher ScientificMPK1025Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kitThermoFisher ScientificMPK10096Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel bufferInvitrogenAM8676Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dyeInvitrogenAM8552Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running bufferInvitrogenAM8671Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free waterTeknovaW3331Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx ImagerLi-CorImager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-HisInvitrogenV80020The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5aMillipore SigmaE7523Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol SigmaP2069Used for DNA extraction
PmeINew England BioLabsR0560LUsed to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kitInvitrogenAM1350Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)Corning353003Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)Corning353001Used for culturing transfected cells
Proteinase KInvitrogen25530049Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1Labconco Corporation304410001Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer RThermoFisher ScientificA buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZapInvitrogenAM9780RNA decontamination solution
ScepterMilliporeC85360Handheld automated cell counter 
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kitCellscriptC-SCMT0625Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping systemCellscriptC-SCCE0625Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solutionInvitrogen15553-035Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifugeThermo Scientific75004532Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTAGibco25300-054Used for dissociation of cells
U-118MG ATCCHTB15An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibodySigmaV9131Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DPAgilent Technologies, Inc380601050Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).

Referencias

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