Количественное измерение миграции и инвазии опухолевых клеток в режиме реального времени после синтетической трансфекции мРНК

Резюме

Многие повышенные гены стимулируют миграцию и инвазию опухолевых клеток, что приводит к неблагоприятному прогнозу. Определение того, какие гены регулируют миграцию и инвазию опухолевых клеток, имеет решающее значение. Данный протокол представляет собой метод исследования влияния повышенной экспрессии гена на миграцию и инвазию опухолевых клеток в режиме реального времени.

Аннотация

Опухолевые клетки очень подвижны и инвазивны и демонстрируют измененные паттерны экспрессии генов. Знания о том, как изменения в экспрессии генов регулируют миграцию и инвазию опухолевых клеток, необходимы для понимания механизмов инфильтрации опухолевых клеток в соседние здоровые ткани и метастазирования. Ранее было продемонстрировано, что нокдаун генов с последующим измерением миграции и инвазии опухолевых клеток в режиме реального времени на основе импеданса позволяет идентифицировать гены, необходимые для миграции и инвазии опухолевых клеток. В последнее время мРНК-вакцины против SARS-CoV-2 вызывают повышенный интерес к использованию синтетических мРНК в терапевтических целях. Здесь метод с использованием синтетической мРНК был пересмотрен для изучения влияния гиперэкспрессии генов на миграцию и инвазию опухолевых клеток. Это исследование демонстрирует, что повышенная экспрессия генов с помощью синтетической трансфекции мРНК с последующим измерением на основе импеданса в режиме реального времени может помочь идентифицировать гены, которые стимулируют миграцию и инвазию опухолевых клеток. В данной методологической работе приводятся важные сведения о процедурах изучения влияния измененной экспрессии генов на миграцию и инвазию опухолевых клеток.

Введение

Подвижность опухолевых клеток играет решающую роль в метастазировании ^1,2. Распространение опухолевых клеток на соседние и отдаленные здоровые ткани затрудняет лечение рака и способствует рецидиву ^3,4. Поэтому важно понимать механизмы подвижности опухолевых клеток и разрабатывать соответствующие терапевтические стратегии. Поскольку многие опухолевые клетки имеют измененные профили экспрессии генов, крайне важно понять, какие изменения в профиле экспрессии генов приводят к изменению подвижности опухолевых клеток ^5,6

протокол

1. Синтез мРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для синтеза мРНК все реагенты и оборудование должны быть специально обработаны для инактивации РНКаз перед использованием. Подробные сведения обо всех материалах, инструментах и реагентах, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .

1. Линеаризация ДНК
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиные кДНК CrkI и CrkL клонировали в вектор экспрессии pFLAG-CMV-5a для добавления эпитопной метки FLAG на С-конце и субклонировали в вектор pcDNA3.1/myc-His для включения промотора T7, как описано ранее^18,19.<....

Результаты

Белки Crk и CrkL играют важную роль в подвижности многих типов клеток, включая нейроны²², Т-клетки²³, фибробласты ^18,19 и различные опухолевые клетки¹³. Поскольку сообщалось о повышенном уровне белков Crk и CrkL при глиобластоме.......

Обсуждение

Миграция и инвазия являются важными особенностями опухолевых клеток. Измерение подвижности опухолевых клеток и понимание основного механизма, контролирующего подвижность опухолевых клеток, дают критически важное представление о терапевтических вмешательствах ^2,27

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlphaImager HP	ProteinSimple	92-13823-00	Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibody	Sigma	T9026	Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16	Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk antibody	BD Biosciences	610035	Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibody	Santa Cruz	sc-319	Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	ATCC	302002	Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CV	Buffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03	Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific	51030285	CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32210	Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32211	Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride	Invitrogen	AM9480	Used for RNA precipitation
Matrigel matrix	Corning	354234	Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kit	Invitrogen	AM1334	Used for RNA synthesis
Millennium RNA markers	Invitrogen	AM7150	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifuge	ISC BioExpress	C1301P-ISC	Used to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNA	TaKaRa	637301	Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuant	Tecan	M200PRO	Nucleic acid quantification system
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK10096	Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel buffer	Invitrogen	AM8676	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dye	Invitrogen	AM8552	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running buffer	Invitrogen	AM8671	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free water	Teknova	W3331	Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx Imager	Li-Cor		Imager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-His	Invitrogen	V80020	The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5a	Millipore Sigma	E7523	Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Sigma	P2069	Used for DNA extraction
PmeI	New England BioLabs	R0560L	Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kit	Invitrogen	AM1350	Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)	Corning	353003	Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)	Corning	353001	Used for culturing transfected cells
Proteinase K	Invitrogen	25530049	Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1	Labconco Corporation	304410001	Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer R	ThermoFisher Scientific		A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZap	Invitrogen	AM9780	RNA decontamination solution
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit	Cellscript	C-SCMT0625	Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping system	Cellscript	C-SCCE0625	Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solution	Invitrogen	15553-035	Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifuge	Thermo Scientific	75004532	Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Used for dissociation of cells
U-118MG	ATCC	HTB15	An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibody	Sigma	V9131	Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DP	Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).