합성 mRNA transfection 후 종양 세포 이동 및 침습의 실시간 정량 측정

요약

상향 조절된 많은 유전자는 종양 세포의 이동과 침입을 자극하여 예후를 악화시킵니다. 어떤 유전자가 종양 세포의 이동과 침입을 조절하는지 알아내는 것은 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 종양 세포의 이동 및 침입에 대한 유전자 발현 증가의 효과를 실시간으로 조사하는 방법을 제시합니다.

초록

종양 세포는 운동성이 높고 침습적이며 변형된 유전자 발현 패턴을 나타냅니다. 유전자 발현의 변화가 종양 세포의 이동과 침입을 어떻게 조절하는지에 대한 지식은 종양 세포가 인접한 건강한 조직으로 침투하여 전이되는 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 이전에는 유전자 녹다운(knockdown)에 이은 임피던스 기반 종양 세포 이동 및 침습 실시간 측정을 통해 종양 세포 이동 및 침습에 필요한 유전자를 식별할 수 있음을 입증했습니다. 최근 SARS-CoV-2에 대한 mRNA 백신은 치료 목적으로 합성 mRNA를 사용하는 것에 대한 관심이 높아졌습니다. 여기서는 유전자 과발현이 종양 세포 이동 및 침습에 미치는 영향을 연구하기 위해 합성 mRNA를 이용한 방법을 수정하였다. 이 연구는 합성 mRNA transfection을 통한 유전자 발현 증가 후 임피던스 기반 실시간 측정이 종양 세포 이동 및 침입을 자극하는 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있음을 보여줍니다. 이 방법 논문은 종양 세포 이동 및 침습에 대한 변경된 유전자 발현의 영향을 조사하는 절차에 대한 중요한 세부 정보를 제공합니다.

서문

종양 세포 운동성은 전이 ^1,2에 중요한 역할을 합니다. 종양 세포가 인접 및 원격 건강 조직으로 퍼지면 암 치료가 어려워지고 재발에 기여합니다 ^3,4. 따라서 종양 세포 운동성의 메커니즘을 이해하고 관련 치료 전략을 개발하는 것이 필수적입니다. 많은 종양 세포가 유전자 발현 프로파일을 변경했기 때문에 유전자 발현 프로파일의 어떤 변화가 종양 세포 운동성의 변화로 이어지는지 이해하는 것이 중요합니다 ^5,6.

in vitro에서 세포 이동을 측정하기 위해 여러 분석법이 개발되었습니다. 일부 분석법은 특정 시점에서만 측정이 가능하기 때문에 제한된 정보만 제공하는 반면, 다른 분석법은 종양 세포 운동성에 대한 포괄적인 정보를 실시간으로 제공한다⁷. 이러한 세포 운동성 분석의 대부분은 주어진 시간 또는 종말점에서 정량적 결과를 제공할 수 있지만 실험 기간 동안 세포 이동 속도의 동적 변화에 대한 충분히 자세한 정보를 제공하지 못합니다. 또한 실험 설계, 세포 유형 및 세포 수에 따라 세포 이동 속도의 잠재적 변화를 조사하기 어려울 수 있습니다. 또한, 복잡하지 않은 치료의 효과는 전통적인 운동성 분석의 간단한 정량화로 조사할 수 있지만, 다양한 복합 치료의 복잡한 효과를 연구하기 위해서는 보다 정교한 정량화가 필요할 수 있다⁸.

미세전극으로 덮인 마이크로타이터 플레이트 웰 바닥의 전류를 모니터링하는 기기가 개발되었다⁹. 우물 표면에 대한 세포의 접착은 전자 흐름을 방해하고 임피던스는 세포의 양적 및 질적 결합과 관련이 있습니다. 웰 바닥에 미세 전극이 있으면 세포 접착, 확산 및 증식을 측정할 수 있습니다. 상부 챔버의 미세 다공성 막 아래에 미세 전극이 존재하면 하부 챔버로의 세포 이동 및 침범을 측정할 수 있으며, 상부 챔버는 침범을 허용하기 위해 세포외 기질(ECM) 단백질로 코팅되어 있다¹⁰.

이전에는 종양 세포 이동 및 침습에 대한 임피던스 기반 실시간 측정이 전체 실험 동안 실시간 데이터를 제공할 뿐만 아니라 다양한 실험 조건 하에서 즉각적인 비교 및 정량화를 제공한다는 것이 입증되었습니다¹¹. 이 방법 논문에서는 종양 세포 이동 및 침입에서 관심 단백질의 역할을 테스트하기 위해 유전자 녹다운을 유도했습니다. 테스트된 실험 조건에서 완전한 유전자 녹다운 효과는 작은 간섭 RNA(siRNA^)를 사용한 전기천공법 후 3-4일이 걸렸기 때문에8, 전기천공법 후 세포를 다시 도금하고 3일 후에 종양 세포 이동 및 침습의 임피던스 기반 실시간 측정을 위해 재수확했습니다.

키나아제(Crk) 및 Crk-유사(CrkL)의 CT10 조절자는 다양한 성장 인자 수용체 키나아제 경로 및 비수용체 티로신 키나아제 경로의 다운스트림에서 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 어댑터 단백질이다¹². Crk 및 CrkL 단백질의 수치가 높아지면 교모세포종을 포함한 여러 인간 암의 예후가 좋지 않습니다¹³. 그러나 Crk 및 CrkL 단백질의 증가가 어떻게 나쁜 예후로 이어지는지는 불분명합니다. 따라서 Crk 및 CrkL 과발현이 종양 세포 기능에 미치는 영향을 정의하는 것이 중요합니다. 이전에는 Crk 및 CrkL 단백질의 내인성 수준이 교모세포종 세포 이동 및 침습에 필요하다는 것을 입증하기 위해 유전자 knockdown 연구가 수행되었습니다⁸. 여기에서 종양 세포 이동 및 침습에 대한 Crk 및 CrkL 과발현의 영향을 해결하기 위해 수정된 분석 시스템이 개발되었습니다.

최근 SARS-CoV-2에 대한 mRNA 백신의 개발로 인해 mRNA의 체외 합성 및 치료 응용 분야가 다시 주목을 받고 있습니다(Verbeke et al.14 검토). 또한 암 및 기타 질병에서 합성 mRNA를 사용하는 데 있어 놀라운 발전이 이루어졌습니다^15,16. 세포의 전기천공법은 합성 mRNA를 전달하고 일시적인 유전자 변형을 유도하는 효과적인 방법이며(Campillo-Davo et al.17에 의해 검토됨), 합성 mRNA의 사용은 불멸화된 섬유아세포에서 빠르고 효율적인 유전자 발현을 가능하게 한다 ¹⁸. 이 방법 논문은 합성 mRNA를 사용한 유전자 과발현과 실시간 세포 분석을 결합하여 종양 세포 이동 및 침입을 연구합니다. 그러나, siRNA에 사용되는 실험 방식은 합성 mRNA 형질주입 시 외인성 단백질의 수준이 급격히 증가하고 점차적으로 감소하기 때문에 합성 mRNA 형질주입에는 효과가 없다¹⁸. 따라서, 세포를 추가로 배양하지 않고 형질주입 직후 세포 이동 및 침습에 대한 실시간 분석을 수행할 수 있도록 방법을 수정하였다.

이 분석법 논문은 임피던스 기반 실시간 측정과 종양 세포의 합성 mRNA의 transfection을 결합하면 종양 세포 이동 및 침습에 대한 유전자 상향 조절의 효과에 대한 빠르고 포괄적인 분석을 제공한다는 것을 보여줍니다. 이 분석법 논문은 교모세포종 세포의 이동 및 침습이 Crk 및 CrkL의 과발현에 의해 어떻게 영향을 받는지 측정하기 위한 자세한 절차를 설명합니다. 이 논문은 종양 세포 이동에 대한 합성 mRNA의 농도 의존적 효과를 조사함으로써 단백질 수준의 증가가 종양 세포 이동을 어떻게 자극하는지 명확하게 설명합니다. 또한, 종양 세포 침범에 대한 유전자 발현 변화의 영향을 평가하기 위해 ECM 겔의 농도를 변화시키는 접근법을 제시합니다.

프로토콜

1. mRNA의 합성

참고: mRNA 합성을 위해 모든 시약과 장비는 사용하기 전에 RNase를 비활성화하도록 특수 처리해야 합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기 및 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. DNA의 선형화
   참고: CrkI 및 CrkL의 마우스 cDNA를 pFLAG-CMV-5a 발현 벡터로 클로닝하여 C-말단에 FLAG 에피토프 태그를 추가하고, 이전에 기술된 바와 같이, T7 프로모터를 통합하기 위해 pcDNA3.1/myc-His 벡터로 서브클로닝하였다(^18,19).
   1. 10 μL의 10x 반응 완충액, 1.5 μL의 PmeI(10,000 units/mL) 및 10 μg의 플라스미드 DNA를 마이크로 원심분리 튜브에 추가하여 플라스미드 DNA를 제한 효소로 선형화합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 반응 부피를 100μL로 만듭니다.
   2. 두드려서 혼합하고, 스핀 다운하고, 반응 혼합물을 37°C에서 밤새 배양합니다.
   3. 스핀 다운하고 반응 혼합물에 5μL의 10% 도데실 황산나트륨(SDS)과 1μL의 proteinase K(20mg/mL, RNA 등급)를 추가합니다. 두드려서 혼합하고 탈수한 후 50°C에서 30분 동안 배양합니다.
   4. 흄 후드 아래에서 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올의 바닥상 100μL를 추출을 위해 플라스미드 반응 혼합물에 첨가합니다. 와류를 가열한 다음 실온에서 18,800× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상부 위상을 새 튜브로 이동합니다.
   5. 클로로포름:이소아밀 알코올로 1.1.4:24 단계를 반복합니다.
   6. 새 튜브에 200μL의 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 반응 부피를 300μL로 만든 다음 3M 아세트산나트륨 30μL와 100% 에탄올 600μL를 추가합니다.
   7. 와류에 의해 혼합하고, DNA의 에탄올 침전을 위해 30-60 분 동안 -20 °C에 두십시오.
   8. 4°C에서 20분 동안 18,800× g 으로 원심분리하고 상층액을 버리고 펠릿을 70% 에탄올 1mL로 헹굽니다. 10분 동안 원심분리를 반복한 다음 상층액을 완전히 제거합니다.
   9. 뚜껑을 열고 2분 동안 건조시킨 후 30μL의 뉴클레아제가 없는 물을 넣고 DNA 펠릿을 재현탁시킵니다.
   10. 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.
   11. 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 선형화된 DNA의 크기와 양을 확인합니다.
2. T7 RNA 중합효소를 이용한 RNA 합성
   1. 10x 전사 완충액, ATP, GTP, UTP, CTP 및 T7 각각 2μL와 선형화된 DNA 1μg을 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 반응 부피를 20μL로 만듭니다.
   2. 탭핑하여 혼합하고, 스핀 다운하고, RNA 합성을 위해 반응 혼합물을 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
   3. 스핀 다운하고 1μL의 DNase(2U/μL)를 추가하고 37°C에서 15분 동안 배양하여 템플릿 DNA를 제거합니다.
3. RNA의 염화 리튬 침전
   1. 반응 혼합물에 10μL의 염화 리튬(7.5M)을 추가합니다. 탭핑하여 혼합하고, 스핀 다운하고, 반응 혼합물을 -20°C에서 30분 동안 배양합니다.
   2. 4°C에서 20분 동안 18,800× g 의 원심분리기를 하고 상층액을 버리고 펠릿을 500μL의 70% 에탄올로 헹굽니다. 10분 동안 원심분리를 반복한 다음 상층액을 완전히 제거합니다.
   3. 뚜껑을 열고 2분 동안 건조시키고, 뉴클레아제가 없는 물 30μL를 첨가하고, RNA 펠릿을 재현탁시킵니다.
4. 상한
   1. RNA 샘플을 65°C에서 10분 동안 가열한 다음 얼음 위에 올려 냉각합니다.
   2. 10x 캡핑 완충액 각각 5μL, 10mM GTP 및 1mM(10x) S-아데노실메티오닌(SAM), 캡핑 효소 믹스 및 O-메틸전이효소 믹스 각각 2μL, RNase 억제제 1.25μL를 추가합니다. 탭핑하여 혼합하고, 스핀 다운하고, 반응 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
5. 폴리(A) 테일링
   1. 샘플을 스핀다운한 다음 6μL의 뉴클레아제가 없는 물, 20μL의 5x E-PAP 완충액, 10μL의 25mM_MnCl2, 10μL의 10mM ATP 및 4μL의 E-PAP 폴리(A) 테일링 효소를 추가합니다. 탭핑하여 혼합하고, 스핀 다운하고, 반응 혼합물을 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
6. 합성 mRNA의 염화 리튬 침전 및 정량
   1. 50μL의 염화 리튬(7.5M)을 추가하고 1.3.1-1.3.3단계에 설명된 대로 염화 리튬 침전을 수행합니다.
   2. 분광광도계를 사용하여 mRNA의 농도를 측정합니다.
   3. 포름알데히드(1%-2%) 아가로스(1%) 겔 전기영동을 사용하여 mRNA의 크기와 양을 확인합니다.

2. 세포 침습 및 이동(CIM) 플레이트의 세포외 기질(ECM) 겔 코팅

참고: CIM(Cell Invasion and Migration) 플레이트는 임피던스 기반 실시간 세포 분석을 위해 상업적으로 제조된 16웰 플레이트입니다. 세포 침습 분석의 경우, 앞서 설명한 대로 CIM 플레이트를 ECM 겔로 코팅하되 일부 수정을 가한다¹¹.

1. 냉동실에서 ECM 겔 스톡의 부분 표본을 꺼내 얼음 위에 보관하십시오.
2. 마이크로 원심분리 튜브에 990μL의 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(혈청 또는 항생제 없음)과 10μL의 ECM 겔을 혼합하여 ECM 겔(10mg/mL)을 작동 농도(100μg/mL)로 희석합니다. 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다.
3. 희석된 ECM 겔 60μL를 CIM 플레이트 상부 챔버의 16개 웰 각각에 추가합니다. 기포를 피하면서 역 피펫팅 방법을 적용하십시오^20,21.
   참고: 각 세포주에 대한 ECM 겔의 농도를 최적화합니다. 교모세포종 세포주의 경우 최적화를 위해 0.1μg/μL - 1μg/μL ECM 겔을 사용했습니다.
4. 플레이트 덮개가 벗겨진 CIM 플레이트의 상부 챔버를 CO₂ 인큐베이터 내부의 보호 플라스틱 시트에 약 4시간 동안 놓아 겔 층을 형성합니다.
   주의 : CIM 플레이트를 ECM 겔로 코팅하는 동안 CIM 플레이트 상부 챔버의 전극은 실험자의 손이나 생물 안전 캐비닛 또는_CO2 인큐베이터를 포함한 장비 표면과 직접 접촉하지 않아야 합니다.

3. 종양세포의 준비

알림: 모든 세포 배양 물질은 멸균 상태로 유지해야 합니다. 앞서 설명한 바와 같이 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하여 생물 안전 캐비닛 아래에서 종양 세포를 채취하고 전기포가하지만 일부 수정을 가합니다¹¹.

1. 종양 세포의 배양
   1. 5%_CO2 인큐베이터(배양 조건)에서 37°C에서 100mm x 20mm 폴리스티렌 조직 배양 접시당 5% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 항생제를 포함하는 10mL의 DMEM에 U-118MG 세포를 배양합니다(배양 조건).
2. 종양 세포의 혈청 고갈
   참고: FBS에 존재하는 화학 유인제에 대한 세포의 노출은 고농도의 FBS를 사용하여 세포 이동 및 침입 분석 전에 최소화해야 합니다.
   1. 기존 배지를 제거하고 접시당 0.5% FBS 및 1% 항생제가 포함된 예열된 DMEM 10mL를 추가합니다(저혈청 배지).
   2. 3.2.1단계를 반복합니다.
   3. 세포를 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 4시간 이상 배양합니다.
3. 종양 세포 채취
   1. 기존 배지를 제거하고, 접시당 예열된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 8mL를 추가하고, DPBS를 제거하고, 예열된 0.05% 트립신-EDTA(2mL/접시)를 추가하여 표면을 덮고, CO₂ 인큐베이터에서 30초 동안 배양합니다.
   2. 트립신-EDTA를 조심스럽게 흡입하고 저혈청 배지(접시당 7mL)를 추가한 다음 세포를 50mL 또는 15mL 원심분리 튜브에 수집합니다.
   3. 소량의 세포를 분취하고 휴대용 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다.
   4. 총 세포 수와 10,000 cells/μL에 필요한 부피를 계산합니다.
   5. 실온에서 100× g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 회전시키고, 상층액을 흡인하고, 0.5% FBS(항생제 없음)를 포함하는 DMEM의 계산된 부피를 추가하고, 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁시킵니다.
   6. 110만 개의 세포가 들어 있는 세포 현탁액 110μL를 각 처리를 위해 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   7. 3.3.6단계를 반복하여 4가지 다른 처리를 위해 세포를 4개의 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
      참고: CIM 플레이트에는 총 16개의 웰이 있습니다. 각 처리에 대해 CIM 플레이트의 웰 4개를 할당할 수 있도록 비교를 위해 4개의 서로 다른 처리를 설계합니다. 각 처리에 대해 웨스턴 블롯 분석(35mm 조직 배양 접시당 30만 개의 세포), 4개의 실시간 세포 이동 분석 웰(10만 개 세포/웰) 및 4개의 실시간 세포 침습 분석 웰(10만 세포/웰)과 같은 실험에 전기 천공 셀을 사용합니다. 실험 설계가 변경되는 경우 전기천공해야 하는 셀의 수를 조정합니다.

4. 종양 세포의 전기천공법

1. 배지를 제거하려면 각 튜브의 세포 현탁액에 1mL의 DPBS를 추가하고, 미니 원심분리기를 사용하여 10초마다 튜브를 180° 회전시키면서 세포 현탁액을 매번 10초 동안 3회 회전시킨 다음, 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.
   알림: 작지만 쉽게 재현탁할 수 있는 셀 펠릿을 형성하는 것이 중요합니다.
2. 110μL의 재현탁 완충액 R을 세포 펠릿에 첨가하여 10μL에서 10만 개의 세포를 얻습니다.
3. 세포 펠릿에 합성 mRNA를 첨가하여 원하는 발현 수준에 따라 0.2-20ng/μL의 농도를 얻습니다. 세포 펠릿을 가볍게 혼합하고 두드리거나 부드러운 피펫팅으로 재현탁합니다.
   참고: 단백질 발현과 생물학적 효과 사이의 특정 상관 관계를 조사하기 위해 다양한 농도의 합성 mRNA를 사용하고, 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 단백질 발현을 검사하고, 원하는 발현 수준으로 이어지는 합성 mRNA의 농도를 결정합니다.
4. 1,350V에서 전기천공법 시스템을 사용하여 10μL의 셀 현탁액을 매번 3개의 펄스로 10ms 동안 전기포레이션합니다.
5. 전기천공된 세포를 0.5% FBS가 포함된 1.1mL의 DMEM이 있는 새로운 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
6. 나머지 셀 현탁액이 전기천공될 때까지 전기천공법을 반복합니다. 마이크로 원심분리 튜브에 전기 천공된 세포를 결합하여 1.1mL에서 110만 개의 세포를 얻습니다.
   참고: 100 μL 및 10 μL 전기천공법 팁은 모두 많은 양의 셀을 전기포레이션하는 데 사용할 수 있지만 10 μL 및 100 μL용 전기천공법 팁은 두 개의 별도 키트에 포함되어 있으며 별도로 구매해야 합니다. 재현탁 버퍼 R은 두 키트 모두에 포함되어 있습니다.
7. 각각의 전기천공법이 모두 완료되면 풀링된 셀을 부드럽게 재현탁합니다.
8. 5% FBS가 함유된 2mL의 DMEM이 포함된 35mm x 10mm 폴리스티렌 조직 배양 접시에 30만 개의 세포를 플레이트하고 전체 세포 용해물 준비 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 배양 조건에서 1일 동안 세포를 배양합니다.
9. 나머지 전기천공 셀은 실시간 셀 분석 시스템이 준비될 때까지 실온에 보관합니다.

5. 실시간 셀 분석기, 프로그램 및 CIM 플레이트 설정

참고: 앞에서 설명한 대로 Real-Time Cell 분석기와 두 개의 CIM 플레이트를 준비합니다¹¹.

1. Real-Time Cell 분석기의 평형
   1. 사용하기 몇 시간 전에 Real-Time 세포 분석기를_CO2 인큐베이터로 이동하여 배양 조건에서 시스템을 평형화합니다.
2. 분석 프로그램 설정
   1. 바탕 화면에서 실시간 세포 분석 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 분석 프로그램을 엽니다.
   2. 기본 실험 패턴 설정 옵션이 열리면 세 가지 실험을 별도로 실행하는 옵션을 선택합니다.
      알림: 각 크래들에는 별도의 창이 있습니다. 측정 간격 및 기간, 데이터 분석 및 기타 실험 조건을 설정하는 다양한 탭이 있습니다.
   3. 번호 탭을 클릭하여 각 크래들을 엽니다.
   4. 실험 노트 탭을 클릭하고, 데이터를 저장할 폴더를 선택하고, 실험의 이름을 입력합니다.
   5. 레이아웃(Layout) 탭을 클릭하고 한 번에 4개의 웰을 선택하고 샘플 정보를 입력하여 각 처리 조건에 대해 4개의 웰을 설정한 다음 적용(Apply)을 클릭합니다.
   6. Schedule(일정) 탭 | 셀 임피던스 측정의 2단계 모드를 설정하는 단계를 추가합니다. 그런 다음 적용을 클릭하여 첫 번째 단계를 설정합니다.
   7. 단계 추가를 다시 클릭하고, 간격에 10분, 이동 및 침입 기간에 48시간을 입력한 다음, 적용을 클릭하여 두 번째 단계를 설정합니다.
      알림: 첫 번째 단계는 일회성 기준선 측정(1분 간격으로 한 번의 스윕)을 수행합니다. 두 번째 단계는 크래들에서 실험에 대한 셀 임피던스를 측정합니다(예: 48시간 동안 10분 간격으로 289회 스윕). 실험 설계에 따라 간격과 기간을 조정합니다.
   8. 다음 크래들로 이동하고 5.2.3-5.2.7단계를 반복하여 설정합니다.
3. CIM 플레이트 준비
   1. 세포 임피던스 측정이 시작되기 1시간 전에 CIM 플레이트의 하부 챔버 웰을 10% 혈청 또는 기타 화학 유인제가 포함된 160μL의 DMEM으로 채웁니다.
   2. ECM 겔 코팅된 웰(침습용) 또는 코팅되지 않은 웰(이동용)이 포함된 상부 챔버를 하부 챔버와 함께 조립합니다.
   3. 세포 이동 분석을 위해 CIM 플레이트의 상부 챔버 웰에 50μL의 저혈청 배지를 추가하고 CIM 플레이트를 시스템의 크래들에 놓습니다.
   4. 메시지 탭을 클릭하고 연결 확인 메시지가 표시되는지 확인합니다. 이제 CIM 플레이트를 실험할 준비가 되었습니다.
   5. CIM 플레이트를 배양 조건에 적응시키기 위해 실시간 세포 분석 전에_CO2 인큐베이터에서 30-60분 동안 조립된 CIM 플레이트를 사전 배양합니다.

6. 실시간 세포 분석 및 데이터 내보내기

알림: 앞서 설명한 대로 기준선 판독, 셀 시드, 셀 임피던스 측정 및 데이터 내보내기를 수행합니다¹¹.

1. 기준선 판독값
   알림: 기준선은 CIM 플레이트가 적응된 후 셀이 상부 챔버의 웰에 추가되기 전에 판독해야 합니다.
   1. 각 크래들의 시작 버튼을 클릭합니다. 다른 이름으로 저장 창이 나타나면 실험 파일을 저장하여 기준선 읽기를 수행합니다.
2. 세포 시딩(Cell seeding)
   1. 크래들에서 CIM 플레이트를 제거하고 플레이트 홀더의 생물 안전 캐비닛에 넣습니다.
   2. 제어 장치의 프로그램에 따라 100μL(100,000개 세포 포함)의 전기 천공된 셀을 CIM 플레이트의 상부 챔버 웰에 추가합니다. 기포를 피하면서 역 피펫팅 방법을 적용하십시오.
   3. CIM 플레이트를 생물 안전 캐비닛 아래에 실온에서 30분 동안 그대로 두어 세포가 웰 바닥에 고르게 퍼지도록 합니다.
3. 셀 임피던스 측정
   1. 완전히 조립된 CIM 플레이트를 해당 크래들로 다시 이동합니다. 크래들 시작 버튼을 클릭하여 두 번째 단계의 셀 임피던스 측정을 시작합니다.
   2. 플롯 탭을 클릭한 다음 모두 추가 버튼을 클릭하고 평균 및 STD DEV 상자를 선택하여 데이터를 실시간으로 시각화합니다.
      참고: 기본 플로팅 옵션은 x축의 경우 시간 이고 y축의 경우 셀 색인 입니다. 플롯 선택 섹션에서는 사용자가 y축에 대한 대체 옵션( 정규화된 셀 인덱스 또는 델타 셀 인덱스)을 선택할 수 있습니다. 최종 스윕이 완료되면 실험이 완료되고 결과가 자동으로 저장됩니다.
4. 분석을 위한 데이터 내보내기
   1. 플롯 탭을 클릭하고 평균 및 STD DEV 상자를 선택하여 각 웰에 대한 데이터를 개별적으로 복사합니다.
   2. 플롯 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 목록 형식으로 데이터 복사를 선택합니다.
   3. 빈 스프레드시트 파일을 열고 데이터를 붙여 넣은 다음 파일을 저장합니다.
   4. 분석 프로그램으로 돌아가서 각 크래들에 대한 플레이트 탭을 클릭하고 해제 를 선택하여 크래들에 대한 실험을 닫습니다.
   5. 스프레드시트 파일로 돌아가서 두 번째 단계의 시작 시간이 실제 측정 시작 시간이 되도록 원시 데이터의 시간을 조정합니다.

결과

Crk 및 CrkL 단백질은 뉴런²², T 세포²³, 섬유아세포 ^18,19 및 다양한 종양 세포¹³를 포함한 많은 세포 유형의 운동성에 중요한 역할을 한다. Crk 및 CrkL 단백질이 교모세포종^24,25,26에서 상승하는 것으로 보고되었기 때문에 Crk의 접합 변?...

토론

이동과 침입은 종양 세포의 중요한 특징입니다. 종양 세포의 운동성을 측정하고 종양 세포 운동성을 조절하는 근본적인 메커니즘을 이해하면 치료 개입에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다 ^2,27. 세포 이동을 연구하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었다⁷. 스크래치 또는 배양 삽입물을 사용하는 상처 치유 분석은 간극 봉합의 대조 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlphaImager HP	ProteinSimple	92-13823-00	Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibody	Sigma	T9026	Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16	Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk antibody	BD Biosciences	610035	Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibody	Santa Cruz	sc-319	Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	ATCC	302002	Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CV	Buffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03	Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific	51030285	CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32210	Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32211	Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride	Invitrogen	AM9480	Used for RNA precipitation
Matrigel matrix	Corning	354234	Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kit	Invitrogen	AM1334	Used for RNA synthesis
Millennium RNA markers	Invitrogen	AM7150	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifuge	ISC BioExpress	C1301P-ISC	Used to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNA	TaKaRa	637301	Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuant	Tecan	M200PRO	Nucleic acid quantification system
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK10096	Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel buffer	Invitrogen	AM8676	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dye	Invitrogen	AM8552	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running buffer	Invitrogen	AM8671	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free water	Teknova	W3331	Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx Imager	Li-Cor		Imager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-His	Invitrogen	V80020	The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5a	Millipore Sigma	E7523	Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Sigma	P2069	Used for DNA extraction
PmeI	New England BioLabs	R0560L	Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kit	Invitrogen	AM1350	Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)	Corning	353003	Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)	Corning	353001	Used for culturing transfected cells
Proteinase K	Invitrogen	25530049	Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1	Labconco Corporation	304410001	Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer R	ThermoFisher Scientific		A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZap	Invitrogen	AM9780	RNA decontamination solution
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit	Cellscript	C-SCMT0625	Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping system	Cellscript	C-SCCE0625	Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solution	Invitrogen	15553-035	Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifuge	Thermo Scientific	75004532	Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Used for dissociation of cells
U-118MG	ATCC	HTB15	An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibody	Sigma	V9131	Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DP	Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).