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Resumo

Muitos genes regulados estimulam a migração e invasão de células tumorais, levando a um prognóstico ruim. Determinar quais genes regulam a migração e invasão de células tumorais é fundamental. Este protocolo apresenta um método para investigar os efeitos do aumento da expressão de um gene sobre a migração e invasão de células tumorais em tempo real.

Resumo

As células tumorais são altamente móveis e invasivas e apresentam padrões alterados de expressão gênica. O conhecimento de como as alterações na expressão gênica regulam a migração e invasão de células tumorais é essencial para a compreensão dos mecanismos de infiltração de células tumorais em tecidos saudáveis vizinhos e metástases. Anteriormente, foi demonstrado que o knockdown gênico seguido da medição em tempo real baseada em impedância da migração e invasão de células tumorais permite a identificação dos genes necessários para a migração e invasão de células tumorais. Recentemente, as vacinas de mRNA contra SARS-CoV-2 aumentaram o interesse em usar mRNA sintético para fins terapêuticos. Aqui, o método usando mRNA sintético foi revisado para estudar o efeito da superexpressão gênica na migração e invasão de células tumorais. Este estudo demonstra que a expressão gênica elevada com transfecção de RNAm sintético seguida de medição em tempo real baseada em impedância pode ajudar a identificar os genes que estimulam a migração e invasão de células tumorais. Este artigo fornece detalhes importantes sobre os procedimentos para examinar o efeito da expressão gênica alterada na migração e invasão de células tumorais.

Introdução

A motilidade das células tumorais desempenha um papel crucial na metástase1,2. A disseminação de células tumorais para tecidos saudáveis vizinhos e remotos dificulta o tratamento do câncer e contribui para arecidiva3,4. Portanto, é essencial compreender os mecanismos de motilidade celular tumoral e desenvolver estratégias terapêuticas relevantes. Como muitas células tumorais apresentam perfis de expressão gênica alterados, é crucial entender quais alterações no perfil de expressão gênica levam à alteração da motilidade das célulastumorais5,6.

Vários ensaios têm sido desenvolvidos para medir a migração celular in vitro. Alguns ensaios fornecem apenas informações limitadas por permitirem apenas medições em momentos específicos, enquanto outros oferecem informações abrangentes sobre a motilidade celular tumoral em tempo real7. Embora muitos desses ensaios de motilidade celular possam fornecer resultados quantitativos em um determinado momento ou no desfecho, eles falham em fornecer informações suficientemente detalhadas sobre mudanças dinâmicas na taxa de migração celular ao longo do período experimental. Além disso, pode ser difícil examinar possíveis mudanças na taxa de migração celular dependendo do planejamento experimental, tipos de células e números de células. Além disso, os efeitos de tratamentos não complicados podem ser investigados pela simples quantificação de ensaios tradicionais de motilidade, mas quantificações mais sofisticadas podem ser necessárias para estudar os efeitos complexos de vários tratamentos combinados8.

Foi desenvolvido um instrumento para monitorar a corrente elétrica de uma placa de microtitulação coberta com microeletrodos9. A adesão das células à superfície do poço impede o fluxo de elétrons, e a impedância correlaciona-se com a ligação quantitativa e qualitativa das células. A presença dos microeletrodos no fundo do poço permite a medição da adesão, espalhamento e proliferação celular. A presença dos microeletrodos sob uma membrana microporosa da câmara superior permite medir a migração e invasão celular para a câmara inferior, com a câmara superior revestida com proteínas da matriz extracelular (MEC) para permitir a invasão10.

Anteriormente, foi demonstrado que medidas em tempo real baseadas em impedância da migração e invasão de células tumorais fornecem dados em tempo real durante todo o experimento, bem como comparações e quantificações instantâneas sob várias condiçõesexperimentais11. Nesse artigo, o knockdown gênico foi induzido para testar o papel de proteínas de interesse na migração e invasão de células tumorais. Como um efeito knockdown completo do gene nas condições experimentais testadas levou 3-4 dias após a eletroporação com pequenos RNAs interferentes (siRNAs)8, as células foram replaqueadas após a eletroporação e recolhidas 3 dias depois para a medição em tempo real baseada em impedância da migração e invasão de células tumorais.

CT10 regulador da quinase (Crk) e Crk-like (CrkL) são proteínas adaptadoras que medeiam interações proteína-proteína a jusante de várias vias da quinase do receptor do fator de crescimento e vias da tirosina quinase não-receptora12. Níveis elevados das proteínas Crk e CrkL contribuem para o mau prognóstico em vários cânceres humanos, incluindo o glioblastoma13. No entanto, não está claro como as proteínas Crk e CrkL elevadas levam a um prognóstico ruim. Portanto, é importante definir o efeito da superexpressão de Crk e CrkL sobre as funções das células tumorais. Anteriormente, um estudo de knockdown genético foi realizado para demonstrar que os níveis endógenos das proteínas Crk e CrkL são necessários para a migração e invasão de células de glioblastoma8. Aqui, um sistema de ensaio modificado foi desenvolvido para abordar o efeito da superexpressão de Crk e CrkL na migração e invasão de células tumorais.

Recentemente, a síntese in vitro de mRNA e suas aplicações terapêuticas têm chamado atenção renovada devido ao desenvolvimento das vacinas de mRNA contra SARS-CoV-2 (revisado por Verbeke et al.14). Além disso, avanços notáveis têm sido obtidos no uso do RNAm sintético em câncer e outras doenças15,16. A eletroporação de células é um método eficaz para liberar RNAm sintético e induzir modificações genéticas transitórias (revisado por Campillo-Davo et al.17), e o uso de RNAm sintético permite expressão gênica rápida e eficiente em fibroblastosimortalizados18. Este artigo de método combina a superexpressão gênica usando mRNA sintético com análises celulares em tempo real para estudar a migração e invasão de células tumorais. Entretanto, o esquema experimental utilizado para siRNAs não funciona com transfecção de RNAm sintético, pois o nível de proteínas exógenas aumenta rapidamente e diminui gradualmente com a transfecção de RNAm sintético18. Portanto, o método foi modificado para realizar a análise em tempo real da migração e invasão celular logo após a transfecção sem a cultura adicional das células.

Este artigo de método demonstra que a combinação de medidas em tempo real baseadas em impedância com a transfecção de células tumorais com mRNAs sintéticos fornece uma análise rápida e abrangente dos efeitos da upregulation gênica na migração e invasão de células tumorais. Este artigo descreve procedimentos detalhados para medir como a migração e invasão de células de glioblastoma são afetadas pela superexpressão de Crk e CrkL. Ao examinar os efeitos dependentes da concentração do mRNA sintético na migração de células tumorais, o artigo descreve claramente como um aumento nos níveis de proteína estimula a migração de células tumorais. Além disso, uma abordagem de variação da concentração do gel de MEC é apresentada para avaliar os efeitos de alterações na expressão gênica sobre a invasão de células tumorais.

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Protocolo

1. Síntese de mRNA

NOTA: Para a síntese de RNAm, todos os reagentes e equipamentos devem ser especialmente tratados para inativar as RNases antes do uso. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, instrumentos e reagentes usados neste protocolo.

  1. Linearização do DNA
    NOTA: Os cDNAs de camundongos de CrkI e CrkL foram clonados no vetor de expressão pFLAG-CMV-5a para adicionar o epítopo FLAG no terminal C e subclonados no vetor pcDNA3.1/myc-His para incorporar o promotor T7, como descrito anteriormente 18,19.
    1. Adicionar 10 μL de tampão de reação 10x, 1,5 μL de PmeI (10.000 unidades/mL) e 10 μg de DNA plasmidial a um tubo de microcentrífuga para linearizar o DNA plasmidial com a enzima de restrição. Adicione água livre de nucleases para elevar o volume de reação a 100 μL.
    2. Misture batendo, gire para baixo e incube a mistura de reação a 37 °C durante a noite.
    3. Gire para baixo e adicione 5 μL de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10% e 1 μL de proteinase K (20 mg/mL, grau RNA) à mistura de reação. Misture batendo, gire para baixo e incube a 50 °C por 30 min.
    4. Sob o exaustor, adicionar 100 μL da fase inferior de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico à mistura de reação plasmidial para extração. Vórtice e, em seguida, centrifugar a 18.800 × g por 5 min à temperatura ambiente. Mova a fase superior para um novo tubo.
    5. Repetir o passo 1.1.4 com clorofórmio:álcool isoamílico a 24:1.
    6. No novo tubo, levar o volume de reação para 300 μL adicionando 200 μL de água livre de nuclease e, em seguida, adicionar 30 μL de acetato de sódio 3 M e 600 μL de etanol 100%.
    7. Misturar por vórtice e, em seguida, colocar a -20 °C por 30-60 min para a precipitação de etanol do DNA.
    8. Centrifugar a 18.800 × g por 20 min a 4 °C, descartar o sobrenadante e enxaguar o pellet com 1 mL de etanol 70%. Repita a centrifugação por 10 minutos e, em seguida, remova completamente o sobrenadante.
    9. Secar com a tampa aberta por 2 min, adicionar 30 μL de água livre de nucleases e ressuspender o pellet de DNA.
    10. Determinar a concentração de DNA usando um espectrofotômetro.
    11. Verificar o tamanho e a quantidade do DNA linearizado usando eletroforese em gel de agarose.
  2. Síntese de RNA utilizando T7 RNA polimerase
    1. Adicionar 2 μL de 10x de tampão de transcrição, ATP, GTP, UTP, CTP e T7 e 1 μg de um DNA linearizado a um tubo de microcentrífuga. Adicione água livre de nucleases para elevar o volume de reação para 20 μL.
    2. Misturar por batida, girar para baixo e incubar a mistura de reação a 37 °C por 2 h para síntese de RNA.
    3. Gire para baixo, adicione 1 μL de DNase (2 U/μL) e incube a 37 °C por 15 min para remover o DNA do molde.
  3. Precipitação de cloreto de lítio do RNA
    1. Adicionar 10 μL de cloreto de lítio (7,5 M) à mistura de reacção. Misture batendo, girando para baixo e incube a mistura de reação a -20 °C por 30 min.
    2. Centrifugar a 18.800 × g por 20 min a 4 °C, descartar o sobrenadante e enxaguar o pellet com 500 μL de etanol 70%. Repita a centrifugação por 10 minutos e, em seguida, remova completamente o sobrenadante.
    3. Secar com a tampa aberta por 2 min, adicionar 30 μL de água livre de nuclease e ressuspender o pellet de RNA.
  4. Nivelamento
    1. Aqueça a amostra de RNA a 65 °C por 10 min e, em seguida, coloque-a no gelo para resfriamento.
    2. Adicionar 5 μL cada de 10x tampão de cobertura, 10 mM GTP e 1 mM (10x) S-adenosilmetionina (SAM), 2 μL cada de uma mistura de enzimas de capping e mistura de enzimas O-metiltransferase, e 1,25 μL de inibidor de RNase. Misturar por batida, girar para baixo e incubar a mistura de reação a 37 °C por 1 h.
  5. Rejeito de poli(A)
    1. Gire a amostra e, em seguida, adicione 6 μL de água livre de nucleases, 20 μL de tampão E-PAP 5x, 10 μL de 25 mM MnCl2, 10 μL de 10 mM ATP e 4 μL de enzima de rejeito E-PAP poli(A). Misturar por batida, girar para baixo e incubar a mistura de reação a 37 °C por 2 h.
  6. Precipitação de cloreto de lítio e quantificação do RNAm sintético
    1. Adicionar 50 μL de cloreto de lítio (7,5 M) e efectuar a precipitação de cloreto de lítio conforme descrito nos passos 1.3.1-1.3.3.
    2. Medir a concentração do mRNA usando um espectrofotômetro.
    3. Verificar o tamanho e a quantidade de RNAm usando eletroforese em gel de formaldeído (1%-2%), agarose (1%).

2. Revestimento em gel da matriz extracelular (MEC) das placas de invasão e migração celular (CIM)

NOTA: Uma placa de invasão e migração celular (CIM) é uma placa de 16 poços fabricada comercialmente para análise celular em tempo real baseada em impedância. Para o ensaio de invasão celular, revestir placas CIM com gel de MEC, como descrito anteriormente, mas com algumas modificações11.

  1. Retire uma alíquota de caldo de gel ECM do congelador e mantenha-a no gelo.
  2. Diluir o gel de MEC (10 mg/mL) para uma concentração de trabalho (100 μg/mL) misturando 990 μL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (sem soro ou antibióticos) com 10 μL de gel de MEC em um tubo de microcentrífuga. Misture por pipetagem suave.
  3. Adicionar 60 μL de gel de ECM diluído a cada um dos 16 orifícios da câmara superior da placa CIM. Aplicar o método de pipetagem reversa evitando bolhas de ar20,21.
    NOTA: Otimizar a concentração do gel de MEC para cada linhagem celular. Para linhagens celulares de glioblastoma, foi utilizado gel de MEC de 0,1 μg/μL a 1 μg/μL para otimização.
  4. Coloque a câmara superior da placa CIM com a tampa da placa desligada em uma folha plástica protetora dentro de uma incubadora de CO2 por aproximadamente 4 h para formar uma camada de gel.
    CUIDADO: Durante o revestimento da placa CIM com gel de ECM, os eletrodos da câmara superior da placa CIM não devem ter contato direto com as mãos do experimentador ou com as superfícies do equipamento, incluindo o gabinete de biossegurança ou a incubadora CO2 .

3. Preparação das células tumorais

NOTA: Todos os materiais de cultura celular devem ser mantidos estéreis. Colher e eletroporar as células tumorais sob uma cabine de segurança biológica com equipamento de proteção individual (EPI) apropriado, como descrito anteriormente, mas com algumasmodificações11.

  1. Cultura de células tumorais
    1. Cultura de células U-118MG em 10 mL de DMEM contendo 5% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de antibióticos por placa de cultura de tecido de poliestireno 100 mm x 20 mm a 37 °C em incubadora de 5% CO2 (condição de cultura).
  2. Depleção sérica das células tumorais
    NOTA: A exposição das células aos quimioatrativos presentes na SFB deve ser minimizada antes dos ensaios de migração e invasão celular usando uma alta concentração de SFB.
    1. Retire o meio velho e adicione 10 mL de DMEM pré-aquecido contendo 0,5% de SFB e 1% de antibióticos por prato (meio de soro baixo).
    2. Repita a etapa 3.2.1.
    3. Incubar as células a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5% durante 4 h ou mais.
  3. Colheita das células tumorais
    1. Remova o meio antigo, adicione 8 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) pré-aquecido de Dulbecco por prato, remova o DPBS, adicione tripsina-EDTA 0,05% pré-aquecido (2 mL/prato) para cobrir a superfície e incube na incubadora CO2 por 30 s.
    2. Aspirar o EDTA-tripsina cuidadosamente, adicionar meio de soro baixo (7 mL/placa) e, em seguida, coletar células em um tubo de centrífuga de 50 mL ou 15 mL.
    3. Aliquot um pequeno volume de células, e use um contador de células automatizado portátil para contar as células.
    4. Calcular o número total de células e o volume necessário para 10.000 células/μL.
    5. Gire as células centrifugando-as a 100 × g por 5 min à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante, adicionar o volume calculado de DMEM contendo 0,5% de SFB (sem antibióticos) e ressuspender suavemente o pellet celular.
    6. Transferir 110 μL da suspensão celular, contendo 1,1 milhão de células, para um tubo de microcentrífuga para cada tratamento.
    7. Repetir o passo 3.3.6 para transferir as células para quatro tubos de microcentrífuga para quatro tratamentos diferentes.
      NOTA: Uma placa CIM tem um total de 16 poços. Projetar quatro tratamentos diferentes para comparação de modo que quatro poços da placa CIM possam ser atribuídos para cada tratamento. Utilizar as células eletroporadas para os seguintes experimentos: análises de western blot (0,3 milhão de células por placa de cultura de tecido de 35 mm), quatro poços de ensaios de migração celular em tempo real (0,1 milhão de células/poço) e quatro poços de ensaios de invasão celular em tempo real (0,1 milhão de células/poço) para cada tratamento. Ajustar o número de células que precisam ser eletroporosas se o desenho experimental mudar.

4. Eletroporação das células tumorais

  1. Para remover o meio, adicione 1 mL de DPBS à suspensão celular em cada tubo, gire a suspensão da célula três vezes por 10 s cada vez enquanto gira o tubo 180° a cada 10 s usando uma mini centrífuga e remova o sobrenadante usando uma micropipeta.
    NOTA: É importante formar um pellet de célula compacto, mas facilmente ressussuspensável.
  2. Adicionar 110 μL de tampão de ressuspensão R ao pellet celular para obter 0,1 milhão de células em 10 μL.
  3. Adicionar mRNA sintético ao pellet celular para obter uma concentração de 0,2-20 ng/μL dependendo do nível de expressão desejado. Misture e ressuspenda o pellet de células suavemente batendo ou pipetando suavemente.
    NOTA: Use diferentes concentrações de mRNA sintético, examine a expressão de proteínas usando a análise de western blot e determine a concentração de mRNA sintético que leva ao nível de expressão desejado, a fim de investigar a correlação específica entre a expressão de proteínas e efeitos biológicos.
  4. Eletroporato de 10 μL da suspensão celular com sistema de eletroporação a 1.350 V por 10 ms com três pulsos de cada vez.
  5. Transferir as células eletroporadas para um novo tubo de microcentrífuga com 1,1 mL de DMEM contendo SFB a 0,5%.
  6. Repita a eletroporação até que o restante da suspensão celular seja eletroporado. Combinar as células eletroporadas no tubo de microcentrífuga para obter 1,1 milhão de células em 1,1 mL.
    NOTA: Ambas as pontas de eletroporação de 100 μL e 10 μL podem ser usadas para eletroporar um grande volume de células, mas as pontas de eletroporação para 10 μL e 100 μL estão incluídas em dois kits separados e precisam ser adquiridas separadamente. O buffer de ressuspensão R está incluído em ambos os kits.
  7. Ao completar todas as respectivas eletroporações, ressuspenda suavemente as células agrupadas.
  8. Placa de 0,3 milhão de células em placa de cultura de tecido de poliestireno de 35 mm x 10 mm com 2 mL de DMEM contendo 5% de SFB e cultura das células por 1 dia sob condição de cultura para preparação de lisado celular total e análises de western blot.
  9. Mantenha o restante das células eletroporosas à temperatura ambiente até que o sistema de análise celular em tempo real esteja pronto.

5. Configuração do analisador de células em tempo real, do programa e das placas CIM

NOTA: Prepare o analisador de células em tempo real e duas placas CIM, conforme descrito anteriormente11.

  1. Equilíbrio do analisador de células em tempo real
    1. Mova o analisador de células em tempo real para uma incubadora de CO2 várias horas antes do uso para equilibrar o sistema sob a condição de cultura.
  2. Configurando o programa de análise
    1. Abra o programa de análise clicando duas vezes no ícone do software de análise de células em tempo real na área de trabalho.
    2. Quando a opção Configuração de Padrão de Experimento estiver aberta, selecione a opção para executar três experimentos separadamente.
      Observação : cada berço tem uma janela separada. Existem diferentes guias para configurar o intervalo de medição e a duração, a análise de dados e outras condições experimentais.
    3. Abra cada berço clicando na guia Número .
    4. Clique na guia Notas do experimento, selecione a pasta na qual os dados serão salvos e insira o nome do experimento .
    5. Clique na guia Layout , configure poços quádruplos para cada condição de tratamento selecionando quatro poços de cada vez e inserindo as informações da amostra e, em seguida, clique em Aplicar.
    6. Clique na aba Programação | Adicione uma etapa para configurar o modo de duas etapas das medições de impedância da célula. Em seguida, clique em Aplicar para configurar a primeira etapa.
    7. Clique em Adicionar uma etapa novamente, digite 10 min para o intervalo e 48 h para a duração da migração e invasão, e clique em Aplicar para configurar a segunda etapa.
      NOTA: O primeiro passo faz uma medição de linha de base única (uma varredura com um intervalo de 1 minuto). A segunda etapa mede a impedância celular para o experimento (por exemplo, 289 varreduras com intervalo de 10 min por 48 h) no berço. Ajustar o intervalo e a duração em função do desenho experimental.
    8. Mova para o próximo suporte e configure-o repetindo as etapas 5.2.3-5.2.7.
  3. Preparação das placas CIM
    1. Uma hora antes do início da impedância celular, preencher os orifícios da câmara inferior da placa CIM com 160 μL de DMEM contendo 10% de soro ou outros quimioatrativos.
    2. Montar a câmara superior que contém os poços revestidos com gel de MEC (para invasão) ou poços não revestidos (para migração) com a câmara inferior.
    3. Adicionar 50 μL de soro baixo aos orifícios da câmara superior da placa CIM para o ensaio de migração celular e colocar a placa CIM no berço do sistema.
    4. Clique na guia Mensagem e verifique se a mensagem Conexões ok é exibida. A placa CIM já está pronta para o experimento.
    5. Pré-incubar a placa CIM montada na incubadora CO2 por 30-60 min antes da análise celular em tempo real para aclimatar a placa CIM à condição de cultura.

6. Análise de células em tempo real e exportação de dados

Observação : execute uma leitura de linha de base, propagação de célula, medição de impedância de célula e exportação de dados conforme descrito anteriormente11.

  1. Leitura da linha de base
    NOTA: A linha de base deve ser lida após a placa CIM ser aclimatada e antes que as células sejam adicionadas aos poços da câmara superior.
    1. Clique no botão Iniciar para cada suporte. Quando a janela Salvar como for exibida, salve o arquivo experimental para executar a leitura da linha de base.
  2. Semeadura de células
    1. Retire a placa CIM do berço e coloque-a no armário de biossegurança no suporte da placa.
    2. Adicionar 100 μL (contendo 100.000 células) de células eletroporosas aos orifícios da câmara superior da placa CIM de acordo com o programa na unidade de controle. Aplique o método de pipetagem reversa evitando bolhas de ar.
    3. Deixe a placa CIM sob o gabinete de biossegurança por 30 minutos à temperatura ambiente para garantir que as células se espalhem uniformemente no fundo do poço.
  3. Medição de impedância celular
    1. Mova a placa CIM totalmente montada de volta para o respectivo berço. Clique no botão Iniciar do suporte para iniciar a medição da impedância da célula para a segunda etapa.
    2. Clique na guia Plotar , clique no botão Adicionar Tudo e selecione as caixas Average e STD DEV para visualizar os dados em tempo real.
      Observação : A opção de plotagem padrão é tempo para o eixo x e índice de célula para o eixo y. A seção Plot Selection permite que o usuário selecione opções alternativas para o eixo y: Normalized Cell Index ou Delta Cell Index. Uma vez que a varredura final é feita, o experimento é concluído e os resultados são salvos automaticamente.
  4. Exportação dos dados para análise
    1. Clique na guia Plotar e selecione as caixas Average e STD DEV para copiar os dados de cada poço individualmente.
    2. Clique com o botão direito do mouse na área de plotagem e selecione Copiar dados em formato de lista.
    3. Abra um arquivo de planilha vazio, cole os dados e salve o arquivo.
    4. Volte para o programa de análise, clique na guia Placa para cada berço e selecione Liberar para fechar o experimento para o berço.
    5. Volte para o arquivo de planilha e ajuste a hora dos dados brutos para que a hora de início na segunda etapa se torne a hora de início real da medição.

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Resultados

As proteínas Crk e CrkL desempenham papéis importantes na motilidade de muitos tipos celulares, incluindo neurônios22, células T23, fibroblastos 18,19 e uma variedade de células tumorais13. Uma vez que as proteínas Crk e CrkL foram relatadas como elevadas no glioblastoma24,25,26, os efeitos da superexpressão de CrkI, uma variante de emenda de Crk

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Discussão

Migração e invasão são características importantes das células tumorais. A mensuração da motilidade das células tumorais e a compreensão do mecanismo subjacente que controla a motilidade das células tumorais fornecem informações críticas para intervenções terapêuticas 2,27. Vários métodos têm sido desenvolvidos para estudar a migração celular7. O ensaio de cicatrização de feridas com arranhões ou pastilhas de cultu...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Medical Writing Center at Children's Mercy Kansas City pela edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Fundação A.R.T. de Natalie (para T.P.) e por uma concessão do Conselho Consultivo de Parceiros da MCA do Children's Mercy Hospital (CMH) e do University of Kansas Cancer Center (KUCC) (para T.P.).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AlphaImager HPProteinSimple92-13823-00Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibodySigmaT9026Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16Agilent Technologies, Inc5665825001Cell invasion and migration plates
Crk antibodyBD Biosciences610035Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibodySanta Cruzsc-319Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)ATCC302002Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Corning21-031-CVBuffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS)HycloneSH30910.03Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubatorThermo Scientific51030285CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibodyLi-Cor926-32210Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibodyLi-Cor926-32211Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride InvitrogenAM9480Used for RNA precipitation
Matrigel matrixCorning354234Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kitInvitrogenAM1334Used for RNA synthesis
Millennium RNA markersInvitrogenAM7150Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifugeISC BioExpressC1301P-ISCUsed to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNATaKaRa637301Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuantTecanM200PRONucleic acid quantification system
Neon electroporation system ThermoFisher ScientificMPK5000Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kitThermoFisher ScientificMPK1025Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kitThermoFisher ScientificMPK10096Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel bufferInvitrogenAM8676Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dyeInvitrogenAM8552Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running bufferInvitrogenAM8671Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free waterTeknovaW3331Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx ImagerLi-CorImager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-HisInvitrogenV80020The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5aMillipore SigmaE7523Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol SigmaP2069Used for DNA extraction
PmeINew England BioLabsR0560LUsed to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kitInvitrogenAM1350Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)Corning353003Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)Corning353001Used for culturing transfected cells
Proteinase KInvitrogen25530049Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1Labconco Corporation304410001Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer RThermoFisher ScientificA buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZapInvitrogenAM9780RNA decontamination solution
ScepterMilliporeC85360Handheld automated cell counter 
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kitCellscriptC-SCMT0625Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping systemCellscriptC-SCCE0625Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solutionInvitrogen15553-035Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifugeThermo Scientific75004532Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTAGibco25300-054Used for dissociation of cells
U-118MG ATCCHTB15An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibodySigmaV9131Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DPAgilent Technologies, Inc380601050Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).

Referências

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