Una técnica mínimamente invasiva, precisa y eficiente para la inyección intratímica en ratones

Resumen

El presente protocolo describe un procedimiento de radiología intervencionista establecido para la inyección intratímica en ratones para evitar el riesgo de cirugía abierta y mejorar la precisión de las inyecciones percutáneas ciegas.

Resumen

La inyección intratímica en modelos de ratón es una técnica importante para estudiar la función tímica e inmune, incluidos los trastornos genéticos y adquiridos de células T. Esto requiere métodos para la deposición directa de reactivos y / o células en el timo de ratones vivos. Los métodos tradicionales de inyección intratímica incluyen cirugía torácica o inyecciones percutáneas ciegas mínimamente invasivas, las cuales tienen limitaciones significativas. Los dispositivos de imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta han hecho posibles las inyecciones percutáneas guiadas por imágenes en ratones, mejorando en gran medida la precisión de la inyección del enfoque de inyección percutánea y permitiendo la inyección de objetivos más pequeños. Sin embargo, las inyecciones guiadas por imágenes dependen de la utilización de un sistema ferroviario integrado, lo que lo convierte en un procedimiento rígido y lento. Aquí se presenta un método único, seguro y eficiente para inyecciones intratímicas percutáneas en ratones, eliminando la dependencia del sistema de rieles para las inyecciones. La técnica se basa en el uso de una unidad de micro-ultrasonido de alta resolución para obtener imágenes del timo del ratón de forma no invasiva. Usando una técnica de mano alzada, un radiólogo puede colocar una punta de aguja directamente en el timo del ratón bajo guía ecográfica. Los ratones se limpian y anestesian antes de la obtención de imágenes. Para un radiólogo experimentado experto en procedimientos guiados por ultrasonido, el período de aprendizaje para la técnica indicada es bastante corto, generalmente dentro de una sesión. El método tiene una baja tasa de morbilidad y mortalidad para los ratones y es mucho más rápido que las técnicas actuales asistidas mecánicamente para la inyección percutánea. Permite al investigador realizar de manera eficiente inyecciones percutáneas precisas y confiables de timos de cualquier tamaño (incluidos órganos muy pequeños como el timo de ratones envejecidos o inmunodeficientes) con un estrés mínimo en el animal. Este método permite la inyección de lóbulos individuales si se desea y facilita experimentos a gran escala debido a la naturaleza de ahorro de tiempo del procedimiento.

Introducción

El timo tiene un papel esencial en el desarrollo de las células T y la inmunidad. La deficiencia de células T, que puede ser causada por la involución tímica, trastornos genéticos, infecciones y tratamientos contra el cáncer, entre otros factores, conduce a una alta mortalidad y morbilidad ^1,2. Los modelos de ratón son indispensables en la investigación de inmunología básica y traslacional y se han utilizado durante décadas para estudiar la biología tímica y el desarrollo de células T, así como para desarrollar tratamientos para aquellos que sufren de disfunción tímica y deficiencia de células T ^3,4,5.

Una parte central de las investigaciones tímicas ha sido la inyección intratímica de materiales biológicos como células, genes o proteínas en modelos de ratón 6,7,8,9,10,11,12. Los métodos convencionales de inyección intratímica utilizan toracotomía seguida de inyección intratímica bajo visualización directa o inyección percutánea "ciega" en el mediastino. El abordaje quirúrgico aumenta significativamente el riesgo de neumotórax, entre otros. Además, el estrés elevado durante esta cirugía resulta en inmunosupresión, comprometiendo potencialmente los datos inmunológicos¹³. Los investigadores experimentados, después de algo de práctica, pueden realizar la técnica de inyección ciega, pero este enfoque es menos preciso y, por lo tanto, limita a los sujetos experimentales a ratones jóvenes con un timo grande.

La utilización de la guía ecográfica ha sido introducida como una alternativa precisa y mínimamente invasiva a los enfoques tradicionales de inyección intratímica¹⁴. Sin embargo, este procedimiento requiere mucho tiempo cuando se utiliza el sistema ferroviario integrado en lugar de la técnica de mano alzada. La realización de inyecciones con el soporte de inyección requiere una cuidadosa optimización de imágenes y posicionamiento del transductor con la ayuda de los diversos accesorios, como el soporte y el soporte del transductor, el sistema de posicionamiento X, Y y Z, así como un funcionamiento competente de los controles de micromanipulación y las extensiones del sistema de rieles. Una técnica alternativa simple, la inyección tímica guiada por ultrasonido, se presenta aquí realizada por un radiólogo utilizando un enfoque a mano alzada¹⁵, que es una alternativa mínimamente invasiva rápida y precisa a los métodos descritos anteriormente. Es importante destacar que el enfoque actual se puede realizar con cualquier sistema de imágenes de ultrasonido de alta resolución sin necesidad de un soporte de inyección y un sistema de riel integrado. Es especialmente útil para estudios que requieren la inyección de un gran número de ratones¹¹, para experimentos que involucran la inyección de ambos lóbulos tímicos, o para la inyección precisa de timos pequeños en ratones envejecidos, irradiados o inmunocomprometidos¹².

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las pautas de cuidado animal en el Centro para el Descubrimiento y la Innovación (protocolo IACUC 290). Para el presente estudio, ratones C57BL/6 (hembra, 4-6 semanas de edad), ratones C57BL/6 (hembra, 6 meses de edad), ratones hembra J:NU, ratones hembra NOD scid gamma (NSG) y B6; Se utilizaron ratones CAG-luc, -GFP como modelo de ratón joven, modelo de ratón envejecido, modelo de desnudo atímico, modelo inmunodeficiente y fuente de células de bioluminiscencia, respectivamente. Los ratones se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales). Este procedimiento generalmente requerirá dos personas (una para permanecer estéril mientras realiza las inyecciones y otra para manejar a los ratones).

1. Preparación de animales

1. Inducir la anestesia en los ratones usando 3% -4% de gas isoflurano y mantener la anestesia usando 1% -3% de gas isoflurano administrado a través de un cono nasal y vaporizador calibrado con precisión (ver Tabla de materiales).
2. Confirme la profundidad/inconsciencia anestésica apropiada por falta de respuesta al pellizco de la pata trasera.
3. Retire el pelaje del área anterior del pecho de los ratones aplicando una capa delgada de crema depilatoria durante menos de 1 minuto. Use una toalla de papel húmeda para eliminar la crema completamente junto con el pelaje suelto.
   NOTA: La aplicación de demasiada crema hará que la piel del área del pecho se inflame.
4. Coloque un ratón a la vez, en decúbito supino, en la plataforma calentada de la estación de imágenes de ultrasonido de animales pequeños (consulte la Tabla de materiales) con el cono de la nariz en su lugar (Figura 1).
5. Asegure el ratón al escenario con cinta adhesiva médica en la parte posterior y las extremidades anteriores (Figura 1).
6. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar el secado de la córnea.
7. Desinfecte la piel de la parte superior del tórax sin pelaje con un aplicador de gluconato de clorhexidina (consulte la Tabla de materiales).

2. Preparación de la máquina de ultrasonido y campo estéril

1. Active la sonda lineal de frecuencia más alta disponible, normalmente la sonda con la resolución espacial más alta para el tamaño del animal que se está fotografiando. Active la sonda tocando el botón correspondiente después de la pantalla de inicio.
   NOTA: Para esta aplicación con ratones, la sonda utilizada está diseñada específicamente para su uso con ratones y ratas pequeñas (consulte la Tabla de materiales).
2. Optimice la configuración de ultrasonido para imágenes e inyección siguiendo los pasos a continuación.
   1. Ajuste la profundidad del campo de visión a un tamaño apropiado para el animal objetivo ajustando los controles deslizantes orientados verticalmente en el lado derecho de la pantalla (Figura 2). El ajuste de profundidad máxima será típicamente de aproximadamente 6-8 mm para ratones jóvenes.
   2. Ajuste la ganancia de escala de grises deslizando el botón a lo largo de la barra horizontal en la parte inferior de la pantalla (Figura 2). El objetivo es comenzar con una imagen que sea ligeramente más oscura que una apariencia "gris" típica.
   3. Ajuste la zona focal (flecha azul a la derecha de la pantalla, Figura 2) al nivel anticipado del timo. Para ratones jóvenes, esto será alrededor de una profundidad de 4 mm.
   4. Si desea capturar imágenes, pruebe la funcionalidad de los botones de almacenamiento de imagen y de clip de almacenamiento para asegurarse de que las imágenes se puedan guardar adecuadamente durante todo el procedimiento. Para ello, pulse el botón Guardar clip en la parte inferior derecha de la pantalla o pulse el botón Inmovilizar y, a continuación, pulse Guardar imagen (Figura 2).
3. Aplique una pequeña cantidad (~1 ml) de gel de ultrasonido a la superficie del transductor (consulte la Tabla de materiales) mientras está en posición vertical, ya sea descansando en el soporte de la máquina de ultrasonido o en las manos de un asistente.
4. Prepare un pequeño campo estéril junto a la plataforma calentada. El posicionamiento óptimo para esto suele ser entre la plataforma y la máquina de ultrasonido.
   1. Vacíe estos artículos en el campo estéril: una cubierta de sonda estéril, una banda elástica, guantes estériles y gel de ultrasonido estéril (consulte la Tabla de materiales).
   2. Con el campo estéril configurado y los artículos en su lugar, póngase los guantes estériles.
   3. Coloque con cuidado la cubierta estéril de la sonda sobre el transductor de ultrasonido (así como sobre el gel que se colocó inicialmente en la sonda). Mantenga la esterilidad y toque solo la cubierta estéril, nada más. Deslice la banda elástica estéril sobre la cubierta estéril de la sonda para mantenerla en su lugar.
      NOTA: Los focos de aire, independientemente del tamaño, pueden interferir con las imágenes de ultrasonido. Por lo tanto, es esencial aplicar el gel de ultrasonido entre el transductor y la cubierta de la sonda estéril, y en la parte superior de la cubierta de la sonda para garantizar una interfaz libre de aire entre la sonda de ultrasonido y el animal.
   4. Coloque una cantidad moderada (2-3 ml) de gel de ultrasonido estéril en el transductor.
      NOTA: El usuario ahora está listo para crear una imagen de un mouse anestesiado.

3. Obtención de imágenes y localización del timo

1. Mientras mantiene la esterilidad, coloque la sonda de ultrasonido con tapa de gel verticalmente en la parte desinfectada de la pared torácica anterior del ratón para obtener imágenes iniciales.
   1. Tómese un momento para mirar la imagen de ultrasonido y optimizarla aún más. Vuelva al paso 2.2 y ajuste para obtener una apariencia similar a la de la Figura 3.
2. Escanee el pecho anterior del ratón en un plano transversal. Realice esto sosteniendo el transductor verticalmente y moviéndolo hacia arriba y hacia abajo desde el cuello hasta el abdomen en un movimiento similar a un pincel o "barrido".
   NOTA: El corazón será la estructura más reconocible en el pecho debido a su movimiento rápido y apariencia "calibrada". Una vez localizado el corazón, este se puede utilizar como punto de referencia para adquirir una imagen del timo.
3. Con el corazón centrado en el campo de visión, barre el transductor ligeramente hacia el cuello. Justo superior al corazón, generalmente se encuentra el timo.
4. Visualice el timo como una estructura bilobulada, piramidal, hipoecoica ("oscura" o "negra" que aparece en la pantalla) que está centrada en la línea media, anterior a la aorta y posterior al esternón (Figura 3A).
5. Tome nota de las dos estructuras negras emparejadas redondas (es decir, "hipoecoicas") a cada lado de la parte superior del pecho.
   NOTA: Estas son las venas cavas bilaterales. La aorta es una estructura hipoecoica curvilínea similar en la línea media entre las dos venas cavas. Estos son fácilmente reconocibles por su movimiento pulsátil.

4. Inyección del timo

1. Si es necesario, aplique más gel de ultrasonido estéril (2-3 ml) al transductor.
   NOTA: Una cantidad relativamente grande de gel estéril en el transductor (en comparación con el tamaño del tórax del ratón) actuará como una "almohadilla de gel" alrededor de la pared torácica del ratón. Esto reducirá el número de artefactos de ultrasonido producidos por aire dentro del campo de visión.
2. Usando la sonda de ultrasonido, localice la porción más ancha del timo, que generalmente es el sitio objetivo ideal para la inyección. Anticipe una trayectoria horizontal de la aguja en la ubicación elegida.
   1. Tenga en cuenta dónde se encuentran los vasos sanguíneos principales (SVC y aorta) en este sitio. Evite estos durante la inyección.
   2. Los vasos sanguíneos serán estructuras hipoecoicas y pulsátiles, como se describe en el paso 3.7. Si no está seguro, utilice el modo Doppler color para verificar el flujo dentro de los vasos (Figura 4A). Active el modo Doppler color tocando el botón Color en la pantalla.
   3. Si se anticipa que uno de los vasos sanguíneos principales (o el corazón) estará a lo largo de la trayectoria esperada de la aguja, elija una nueva área objetivo o encuentre un enfoque / trayectoria diferente.
3. Sostenga el transductor en una mano y una aguja de insulina de 30 G (consulte la Tabla de materiales) con 10 μL de inyección en la otra.
   NOTA: La inyección variará según el diseño experimental. El presente estudio utilizó solución salina tamponada con fosfato, azul de tripano o D-luciferina (0,1 μg/10 μL).
4. Para comenzar el proceso de inyección, mueva el transductor lateralmente para que el timo esté descentrado en el campo de visión del ultrasonido. Asegúrese de que el otro lado del campo de visión consista principalmente en gel de ultrasonido y nada más.
5. Coloque la punta de la aguja en el gel debajo del transductor y mueva lentamente la aguja hasta que se visualice adyacente a la superficie de la piel (Figura 4B).
6. Mientras toma imágenes continuamente de la aguja bajo ultrasonido, inserte la aguja en la glándula del timo con una trayectoria percutánea, lejos de los vasos sanguíneos.
   1. Use una trayectoria horizontal de "timo cruzado" para colocar la punta de la aguja en el lóbulo tímico contralateral al sitio de entrada. Esto explica la posible fuga a lo largo del tracto de la aguja (Figura 5A).
7. Una vez que la punta de la aguja esté dentro de la porción deseada del timo, inyecte rápidamente el contenido (como 10 μL de azul de tripano o D-luciferina, 0,1 μg/10 μL) de la jeringa de 30 G mientras usa la visualización ecográfica.
   1. Para estabilizar la jeringa durante la inserción e inyección de la aguja, sostenga la jeringa entre el pulgar y el tercer dedo y controle el émbolo de la jeringa con el dedo índice.
8. Retire la aguja después de que se haya depositado todo el contenido.

5. Seguimiento de los animales después de la inyección

1. Transfiera al animal a una jaula vacía y observe hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
   NOTA: Se espera que la recuperación completa de la anestesia ocurra dentro de los 2 minutos.
2. Controle al animal durante 10 minutos adicionales para detectar signos de angustia, dificultad para respirar o sangrado.
   NOTA: No se espera dolor después de la inyección, y generalmente no hay necesidad de analgesia posterior a la inyección.
3. Una vez completamente recuperado y después de un período de observación posterior a la inyección sin incidentes, devolver el animal inyectado a la compañía de otros animales.

Resultados

La implementación exitosa de esta técnica se basa en algunos pasos clave a seguir. En primer lugar, se debe garantizar una identificación fiable de la propia glándula del timo. En ratones jóvenes, esto es sencillo debido al gran tamaño de la glándula (Figura 3A). En ratones más viejos o ratones inmunodeficientes, puede ser más desafiante; sin embargo, todavía es muy factible con equipos de ultrasonido modernos (Figura 3B, C). En segund...

Discusión

Una inyección a mano alzada guiada por ultrasonido es una técnica altamente precisa para administrar materiales de estudio al timo de una manera eficiente y aséptica. Después de la esterilización inicial de la piel en el lugar de la inyección, la esterilidad se mantiene durante el procedimiento debido al uso de guantes estériles, cubiertas de sonda de ultrasonido estériles y gel de ultrasonido estéril. En contraste con el abordaje percutáneo ciego 10,17 o confiando en incisiones quirúrgicas para la visualizaci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquasonic 100 Ultrasound Gel	Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)	01-01	Sterile Ultrasound Transmission Gel
B6;CAG-luc, -GFP mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	025854	Bioluminescence cell source
BD Insulin Syringes with needle	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)	328431	Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G
C57BL/6 mouse - aged	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 6 months old; aged model
C57BL/6 mouse - young	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 4-6 weeks; young model
Chloraprep One-step 0.67 mL	CareFusion (El Paso, TX, USA)	260449	chlorhexidine gluconate applicator
Curity Cotton Tipped Applicator	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	A5000-2	Sterile, 6"
D-Luciferin	Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)	LUCK-1G
Isoflurane	Henry Schein (Melville, NY, USA)	1182097
IVIS Lumina X5	PerkinElmer (Melville, NY, USA)	n/a	In vivo bioluminescence imaging system
J:NU mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	007850	Athymic nude model
Kendall Hypoallergenic Paper Tape	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	1914C
Kimtech Surgical Nitrile Gloves	Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)	56892	Sterile Gloves
Nair Hair Remover Lotion	Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)	n/a	Depilatory agent
NOD scid gamma (NSG) mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	005557	Immunodeficient model
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x	Corning (Corning, NY, USA)	21-040-CV
Puralube Vet Ointment	Med Vet International	PH-PURALUBE-VET	Eye ointment
Sheathes	Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)	10040	Sterile Ultrasound Probe Covers
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)	EZ-17 85	Anesthesia induction chamber
Transducer MX550D	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)
Trypan Blue, 0.4% solution in PBS	MP Biomedicals (Solon, OH, USA)	91691049
Vevo 3100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Ultrasound imaging system
Vevo 3100 Lab Software	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Version 3.2.7 for imaging and analysis
Vevo Compact Dual Anesthesia System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Tabletop isoflurane-based anesthesia unit
Vevo Imaging Station	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Procedural platform