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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El presente protocolo describe un procedimiento de radiología intervencionista establecido para la inyección intratímica en ratones para evitar el riesgo de cirugía abierta y mejorar la precisión de las inyecciones percutáneas ciegas.

Resumen

La inyección intratímica en modelos de ratón es una técnica importante para estudiar la función tímica e inmune, incluidos los trastornos genéticos y adquiridos de células T. Esto requiere métodos para la deposición directa de reactivos y / o células en el timo de ratones vivos. Los métodos tradicionales de inyección intratímica incluyen cirugía torácica o inyecciones percutáneas ciegas mínimamente invasivas, las cuales tienen limitaciones significativas. Los dispositivos de imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta han hecho posibles las inyecciones percutáneas guiadas por imágenes en ratones, mejorando en gran medida la precisión de la inyección del enfoque de inyección percutánea y permitiendo la inyección de objetivos más pequeños. Sin embargo, las inyecciones guiadas por imágenes dependen de la utilización de un sistema ferroviario integrado, lo que lo convierte en un procedimiento rígido y lento. Aquí se presenta un método único, seguro y eficiente para inyecciones intratímicas percutáneas en ratones, eliminando la dependencia del sistema de rieles para las inyecciones. La técnica se basa en el uso de una unidad de micro-ultrasonido de alta resolución para obtener imágenes del timo del ratón de forma no invasiva. Usando una técnica de mano alzada, un radiólogo puede colocar una punta de aguja directamente en el timo del ratón bajo guía ecográfica. Los ratones se limpian y anestesian antes de la obtención de imágenes. Para un radiólogo experimentado experto en procedimientos guiados por ultrasonido, el período de aprendizaje para la técnica indicada es bastante corto, generalmente dentro de una sesión. El método tiene una baja tasa de morbilidad y mortalidad para los ratones y es mucho más rápido que las técnicas actuales asistidas mecánicamente para la inyección percutánea. Permite al investigador realizar de manera eficiente inyecciones percutáneas precisas y confiables de timos de cualquier tamaño (incluidos órganos muy pequeños como el timo de ratones envejecidos o inmunodeficientes) con un estrés mínimo en el animal. Este método permite la inyección de lóbulos individuales si se desea y facilita experimentos a gran escala debido a la naturaleza de ahorro de tiempo del procedimiento.

Introducción

El timo tiene un papel esencial en el desarrollo de las células T y la inmunidad. La deficiencia de células T, que puede ser causada por la involución tímica, trastornos genéticos, infecciones y tratamientos contra el cáncer, entre otros factores, conduce a una alta mortalidad y morbilidad 1,2. Los modelos de ratón son indispensables en la investigación de inmunología básica y traslacional y se han utilizado durante décadas para estudiar la biología tímica y el desarrollo de células T, así como para desarrollar tratamientos para aquellos que sufren de disfunción tímica y deficiencia de células T

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las pautas de cuidado animal en el Centro para el Descubrimiento y la Innovación (protocolo IACUC 290). Para el presente estudio, ratones C57BL/6 (hembra, 4-6 semanas de edad), ratones C57BL/6 (hembra, 6 meses de edad), ratones hembra J:NU, ratones hembra NOD scid gamma (NSG) y B6; Se utilizaron ratones CAG-luc, -GFP como modelo de ratón joven, modelo de ratón envejecido, modelo de desnudo atímico, modelo inmunodeficiente y fuente de células de bioluminiscencia, respectivamente. Los ratones se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales). Este procedimiento generalmente requerirá do....

Resultados

La implementación exitosa de esta técnica se basa en algunos pasos clave a seguir. En primer lugar, se debe garantizar una identificación fiable de la propia glándula del timo. En ratones jóvenes, esto es sencillo debido al gran tamaño de la glándula (Figura 3A). En ratones más viejos o ratones inmunodeficientes, puede ser más desafiante; sin embargo, todavía es muy factible con equipos de ultrasonido modernos (Figura 3B, C). En segund.......

Discusión

Una inyección a mano alzada guiada por ultrasonido es una técnica altamente precisa para administrar materiales de estudio al timo de una manera eficiente y aséptica. Después de la esterilización inicial de la piel en el lugar de la inyección, la esterilidad se mantiene durante el procedimiento debido al uso de guantes estériles, cubiertas de sonda de ultrasonido estériles y gel de ultrasonido estéril. En contraste con el abordaje percutáneo ciego 10,17 o confiando en incisiones quirúrgicas para la visualizaci.......

Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Raymond H. Thornton por su perspicaz y completo trabajo inicial sobre esta técnica. Este estudio fue financiado por subvenciones del Instituto Nacional del Cáncer (NCI 1R37CA250661-01A1), la Asociación de Investigación de Leucemia Infantil, la Escuela de Medicina Hackensack Meridian y la Fundación HUMC / Tackle Kids Cancer.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Aquasonic 100 Ultrasound GelParker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)01-01Sterile Ultrasound Transmission Gel
B6;CAG-luc, -GFP mouseThe Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)025854Bioluminescence cell source
BD Insulin Syringes with needleBecton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)328431Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G
C57BL/6 mouse - agedThe Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)000664age 6 months old; aged model
C57BL/6 mouse - youngThe Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)000664age 4-6 weeks; young model
Chloraprep One-step 0.67 mLCareFusion (El Paso, TX, USA)260449chlorhexidine gluconate applicator
Curity Cotton Tipped ApplicatorCardinal Health (Dublin, OH, USA)A5000-2Sterile, 6"
D-LuciferinGold Biotechnology (St Louis, MO, USA)LUCK-1G
IsofluraneHenry Schein (Melville, NY, USA)1182097
IVIS Lumina X5PerkinElmer (Melville, NY, USA)n/aIn vivo bioluminescence imaging system
J:NU mouseThe Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)007850Athymic nude model
Kendall Hypoallergenic Paper TapeCardinal Health (Dublin, OH, USA)1914C
Kimtech Surgical Nitrile GlovesKimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)56892Sterile Gloves
Nair Hair Remover LotionChurch and Dwight (Trenton, NJ, USA)n/aDepilatory agent
NOD scid gamma (NSG) mouseThe Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)005557Immunodeficient model
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1xCorning (Corning, NY, USA)21-040-CV
Puralube Vet OintmentMed Vet InternationalPH-PURALUBE-VETEye ointment
SheathesSheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)10040Sterile Ultrasound Probe Covers
Sure-Seal Induction ChamberBraintree Scientific (Braintree, MA, USA)EZ-17 85Anesthesia induction chamber
Transducer MX550DFUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)n/aVevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)
Trypan Blue, 0.4% solution in PBSMP Biomedicals (Solon, OH, USA)91691049
Vevo 3100 Imaging SystemFUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)n/aUltrasound imaging system
Vevo 3100 Lab SoftwareFUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)n/aVersion 3.2.7 for imaging and analysis
Vevo Compact Dual Anesthesia SystemFUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)n/aTabletop isoflurane-based anesthesia unit
Vevo Imaging StationFUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)n/aProcedural platform

Referencias

  1. Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
  2. Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy.

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