Uma técnica minimamente invasiva, precisa e eficiente para injeção intratímica em camundongos

Resumo

O presente protocolo descreve um procedimento de radiologia intervencionista estabelecido para injeção intratímica em camundongos para evitar o risco de cirurgia aberta e melhorar a precisão das injeções percutâneas cegas.

Resumo

A injeção intratímica em modelos de camundongos é uma técnica importante para o estudo da função tímica e imunológica, incluindo distúrbios genéticos e de células T adquiridas. Isso requer métodos para a deposição direta de reagentes e/ou células no timo de camundongos vivos. Os métodos tradicionais de injeção intratímica incluem cirurgia torácica ou injeções cegas percutâneas minimamente invasivas, ambas com limitações significativas. Os dispositivos de imagem de ultra-alta frequência tornaram possíveis injeções percutâneas guiadas por imagem em camundongos, melhorando muito a precisão da injeção da abordagem de injeção percutânea e permitindo a injeção de alvos menores. No entanto, as injeções guiadas por imagem dependem da utilização de um sistema ferroviário integrado, tornando este um procedimento rígido e demorado. Um método único, seguro e eficiente para injeções intratímicas percutâneas em camundongos é apresentado aqui, eliminando a dependência do sistema ferroviário para injeções. A técnica baseia-se no uso de uma unidade de micro-ultra-som de alta resolução para visualizar o timo do rato de forma não invasiva. Usando uma técnica de mão livre, um radiologista pode colocar uma ponta de agulha diretamente no timo do rato sob orientação ultrassonográfica. Os ratos são limpos e anestesiados antes da imagem. Para um radiologista experiente adepto de procedimentos guiados por ultrassom, o período de aprendizado para a técnica declarada é bastante curto, normalmente dentro de uma sessão. O método tem uma baixa taxa de morbidade e mortalidade para os camundongos e é muito mais rápido do que as técnicas atuais de injeção percutânea assistida mecanicamente. Ele permite que o investigador realize eficientemente injeções percutâneas precisas e confiáveis de timos de qualquer tamanho (incluindo órgãos muito pequenos, como o timo de camundongos idosos ou imunodeficientes) com o mínimo de estresse sobre o animal. Este método permite a injeção de lobos individuais, se desejado, e facilita experimentos em larga escala devido à natureza de economia de tempo do procedimento.

Introdução

O timo tem um papel essencial no desenvolvimento e imunidade das células T. A deficiência de células T, que pode ser causada por involução tímica, distúrbios genéticos, infecções e tratamentos contra o câncer, entre outros fatores, leva a alta mortalidade e morbidade ^1,2. Os modelos de camundongos são indispensáveis tanto na pesquisa em imunologia básica quanto translacional e têm sido utilizados há décadas para estudar a biologia tímica e o desenvolvimento de células T, bem como para desenvolver tratamentos para aqueles que sofrem de disfunção tímica e deficiência de células T ^3,4,5.

Uma parte central das investigações tímicas tem sido a injeção intratímica de materiais biológicos, como células, genes ou proteínas, em modelos de camundongos 6,7,8,9,10,11,12. Os métodos convencionais de injeção intratímica usam toracotomia seguida de injeção intratímica sob visualização direta ou por injeção percutânea "cega" no mediastino. A abordagem cirúrgica aumenta significativamente o risco de pneumotórax, entre outros. Além disso, o estresse elevado durante essa cirurgia resulta em imunossupressão, comprometendo potencialmente os dados imunológicos¹³. Pesquisadores experientes, após alguma prática, podem realizar a técnica de injeção cega, mas essa abordagem é menos precisa e, portanto, limita os sujeitos experimentais a camundongos jovens com um grande timo.

A utilização da orientação ultrassonográfica tem sido introduzida como uma alternativa precisa e minimamente invasiva às abordagens tradicionais de injeção intratímica¹⁴. No entanto, este procedimento é muito demorado ao usar o sistema ferroviário integrado em vez da técnica de mão livre. A realização de injeções com o suporte de injeção requer otimização de imagem cuidadosa e posicionamento do transdutor com a ajuda dos vários acessórios, como o suporte e a montagem do transdutor, o sistema de posicionamento X, Y e Z, bem como a operação proficiente dos controles de micromanipulação e extensões do sistema ferroviário. Uma técnica alternativa simples, a injeção tímica guiada por ultrassom, é apresentada aqui por um radiologista usando uma abordagem à mão livre¹⁵, que é uma alternativa minimamente invasiva rápida e precisa aos métodos descritos acima. É importante ressaltar que a abordagem atual pode ser realizada com qualquer sistema de imagem de ultrassom de alta resolução sem a necessidade de um suporte de injeção e um sistema de trilho integrado. É especialmente útil para estudos que requerem a injeção de um grande número de camundongos¹¹, para experimentos envolvendo a injeção de ambos os lobos tímicos, ou para a injeção precisa de pequenos timos em camundongos idosos, irradiados ou imunocomprometidos¹².

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes de cuidados com os animais no Center for Discovery and Innovation (protocolo IACUC 290). Para o presente estudo, camundongos C57BL/6 (fêmea, 4-6 semanas de idade), C57BL/6 camundongos (fêmea, 6 meses de idade), camundongos fêmeas J:NU, camundongos fêmeas NOD scid gamma (NSG) e B6; Camundongos CAG-luc, -GFP foram usados como modelo de camundongo jovem, modelo de camundongo envelhecido, modelo de nudez atímica, modelo imunodeficiente e fonte de células de bioluminescência, respectivamente. Os camundongos foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Este procedimento normalmente exigirá duas pessoas (uma para permanecer estéril durante a realização das injeções e outra para lidar com os ratos).

1. Preparação animal

1. Induzir anestesia nos ratos usando gás isoflurano a 3% a 4% e manter a anestesia usando gás isoflurano a 1% a 3% administrado por meio de um cone nasal e vaporizador calibrado com precisão (ver Tabela de Materiais).
2. Confirme a profundidade/inconsciência anestésica apropriada por falta de resposta ao aperto da pata traseira.
3. Remova a pele da área anterior do tórax dos ratos aplicando uma fina camada de creme depilatório por menos de 1 min. Use uma toalha de papel molhada para remover o creme completamente junto com a pele solta.
   NOTA: A aplicação de muito creme resultará na inflamação da pele da área do peito.
4. Colocar um rato de cada vez, em decúbito dorsal, na plataforma aquecida da estação de ultrassom de pequenos animais (ver Tabela de Materiais) com o cone nasal no lugar (Figura 1).
5. Prenda o mouse ao palco com fita adesiva médica nos membros posteriores e anteriores (Figura 1).
6. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar a secagem da córnea.
7. Desinfete a pele do tórax superior sem pelos usando um aplicador de gluconato de clorexidina (ver Tabela de Materiais).

2. Preparação da máquina de ultrassom e campo estéril

1. Ative a sonda linear de maior frequência disponível, normalmente a sonda com a maior resolução espacial para o tamanho do animal que está sendo fotografado. Ative a sonda tocando no botão correspondente após a tela de inicialização.
   NOTA: Para esta aplicação com camundongos, a sonda usada é projetada especificamente para uso com camundongos e ratos pequenos (consulte Tabela de Materiais).
2. Otimize as configurações de ultrassom para imagem e injeção seguindo as etapas abaixo.
   1. Ajuste a profundidade do campo de visão para um tamanho apropriado para o animal alvo ajustando os controles deslizantes orientados verticalmente no lado direito da tela (Figura 2). A configuração de profundidade máxima normalmente será de cerca de 6-8 mm para ratos jovens.
   2. Ajuste o ganho em escala de cinza deslizando o botão ao longo da barra horizontal na parte inferior da tela (Figura 2). O objetivo é começar com uma imagem que é apenas um pouco mais escura do que uma aparência "cinza" típica.
   3. Ajuste a zona focal (seta azul à direita da tela, Figura 2) ao nível previsto do timo. Para ratos jovens, isso será em torno de uma profundidade de 4 mm.
   4. Se a captura de imagem for desejada, teste a funcionalidade da imagem de armazenamento e os botões de clipe de armazenamento para garantir que as imagens possam ser salvas adequadamente durante todo o procedimento. Execute isso tocando no botão Save Clip no canto inferior direito da tela ou tocando no botão Freeze e, em seguida, tocando em Save Image (Figura 2).
3. Aplique uma pequena quantidade (~1 mL) de gel de ultrassom na superfície do transdutor (consulte Tabela de Materiais) enquanto estiver na vertical, descansando no suporte da máquina de ultrassom ou nas mãos de um assistente.
4. Prepare um pequeno campo estéril ao lado da plataforma aquecida. O posicionamento ideal para isso é geralmente entre a plataforma e a máquina de ultrassom.
   1. Esvazie esses itens no campo estéril: uma tampa de sonda estéril, elástico, luvas estéreis e gel de ultrassom estéril (consulte Tabela de materiais).
   2. Com o campo estéril configurado e os itens no lugar, coloque as luvas estéreis.
   3. Coloque cuidadosamente a tampa da sonda estéril sobre o transdutor de ultrassom (bem como sobre o gel que foi inicialmente colocado na sonda). Mantenha a esterilidade e toque apenas na tampa estéril, nada mais. Deslize o elástico estéril sobre a tampa da sonda estéril para mantê-lo no lugar.
      NOTA: Os focos aéreos, independentemente do tamanho, podem interferir na ultrassonografia. Por isso, é essencial aplicar o gel de ultrassom entre o transdutor e a tampa da sonda estéril e, em cima da tampa da sonda, para garantir uma interface livre de ar entre a sonda de ultrassom e o animal.
   4. Coloque uma quantidade moderada (2-3 mL) de gel de ultrassom estéril no transdutor.
      Observação : O usuário agora está pronto para criar a imagem de um mouse anestesiado.

3. Obtenção de imagens e localização do timo

1. Mantendo a esterilidade, coloque a sonda com tampo de gel de ultrassom verticalmente na porção desinfetada da parede torácica anterior do camundongo para a imagem inicial.
   1. Reserve um momento para olhar para a imagem de ultrassom e otimizá-la ainda mais. Volte para a etapa 2.2 e ajuste para obter uma aparência semelhante à da Figura 3.
2. Escaneie o tórax anterior do rato num plano transversal. Execute isso segurando o transdutor verticalmente e movendo-o para cima e para baixo do pescoço até o abdômen em um movimento semelhante a um pincel ou "varrendo".
   NOTA: O coração será a estrutura mais reconhecível no peito devido ao seu movimento rápido e aparência "com câmara". Uma vez que o coração está localizado, isso pode ser usado como um ponto de referência para adquirir uma imagem do timo.
3. Com o coração centrado no campo de visão, varra o transdutor ligeiramente em direção ao pescoço. Apenas superior ao coração, o timo é geralmente encontrado.
4. Visualize o timo como uma estrutura bilobada, piramidal, hipoecóica ("escura" ou "preta" aparecendo na tela) centrada na linha média, anterior à aorta e posterior ao esterno (Figura 3A).
5. Anote as duas estruturas pretas emparelhadas redondas (ou seja, "hipoecóicas") em ambos os lados da parte superior do tórax.
   NOTA: Estas são as veias cavas bilaterais. A aorta é uma estrutura hipoecóica curvilínea semelhante na linha média entre as duas veias cavas. Estes são facilmente reconhecíveis pelo seu movimento pulsátil.

4. Injeção do timo

1. Se necessário, aplique mais (2-3 mL) de gel de ultrassom estéril no transdutor.
   NOTA: Uma quantidade relativamente grande de gel estéril no transdutor (em comparação com o tamanho do tórax do rato) atuará como uma "almofada de gel" em torno da parede torácica do rato. Isso reduzirá o número de artefatos de ultrassom feitos pelo ar dentro do campo de visão.
2. Usando a sonda de ultrassom, localize a porção mais larga do timo, que geralmente é o local alvo ideal para a injeção. Antecipe uma trajetória horizontal da agulha no local escolhido.
   1. Observe onde os principais vasos sanguíneos (SVCs e aorta) estão localizados neste local. Evite-os durante a injeção.
   2. Os vasos sanguíneos serão hipoecóicos, estruturas pulsáteis, conforme descrito na etapa 3.7. Se não tiver certeza, use o modo Doppler colorido para verificar o fluxo dentro dos recipientes (Figura 4A). Ative o modo Doppler colorido tocando no botão Cor na tela.
   3. Se um dos principais vasos sanguíneos (ou o coração) for antecipado para estar ao longo da trajetória esperada da agulha, escolha uma nova área-alvo ou encontre uma abordagem / trajetória diferente.
3. Segure o transdutor com uma mão e uma agulha de insulina 30 G (ver Tabela de Materiais) com 10 μL de injeção na outra.
   NOTA: O injectado irá variar com base no desenho experimental. O presente estudo utilizou solução salina tamponada com fosfato, azul de tripano ou D-luciferina (0,1 μg/10 μL).
4. Para iniciar o processo de injeção, mova o transdutor lateralmente para que o timo fique fora do centro no campo de visão do ultrassom. Certifique-se de que o outro lado do campo de visão consiste principalmente em gel de ultrassom e nada mais.
5. Coloque a ponta da agulha no gel sob o transdutor e mova lentamente a agulha até que ela seja visualizada adjacente à superfície da pele (Figura 4B).
6. Ao fotografar continuamente a agulha sob ultrassom, insira a agulha na glândula timo com uma trajetória percutânea, longe dos vasos sanguíneos.
   1. Use uma trajetória horizontal "timo cruzado" para colocar a ponta da agulha no lobo tímico contralateral ao local de entrada. Isso explica o potencial vazamento ao longo do trato da agulha (Figura 5A).
7. Uma vez que a ponta da agulha esteja dentro da porção desejada do timo, injete rapidamente o conteúdo (como 10 μL de azul de tripano ou D-luciferina, 0,1 μg/10 μL) da seringa de 30 G enquanto usa a visualização ultrassonográfica.
   1. Para estabilizar a seringa durante a inserção e injeção da agulha, segure a seringa entre o polegar e o terceiro dedo e controle o êmbolo da seringa com o dedo indicador.
8. Remova a agulha depois de todo o conteúdo ter sido depositado.

5. Monitorização pós-injecção dos animais

1. Transfira o animal para uma gaiola vazia e observe até que ele recupere a consciência suficiente para manter a retração esternal.
   NOTA: Espera-se que a recuperação completa da anestesia ocorra dentro de 2 minutos.
2. Monitore o animal por mais 10 minutos em busca de sinais de angústia, respiração difícil ou sangramento.
   NOTA: A dor pós-injeção não é esperada, e normalmente não há necessidade de analgesia pós-injeção.
3. Uma vez totalmente recuperado e após um período de observação pós-injeção sem intercorrências, devolva o animal injetado à companhia de outros animais.

Resultados

A implementação bem-sucedida dessa técnica depende de algumas etapas importantes a serem seguidas. Primeiro, a identificação confiável da própria glândula timo deve ser assegurada. Em camundongos jovens, isso é simples devido ao grande tamanho da glândula (Figura 3A). Em ratos mais velhos ou imunodeficientes, pode ser mais desafiador; no entanto, ainda é muito viável com equipamentos de ultrassom modernos (Figura 3B,C). Em segundo lu...

Discussão

Uma injeção à mão livre guiada por ultrassom é uma técnica altamente precisa para fornecer materiais de estudo ao timo de forma eficiente e asséptica. Após a esterilização inicial da pele no local da injeção, a esterilidade é mantida durante o procedimento devido ao uso de luvas estéreis, tampas estéreis de sonda de ultrassom e gel de ultrassom estéril. Em contraste com a abordagem percutânea cega^10,17 ou contando com incisões cirúrgicas para visualização direta do timo

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquasonic 100 Ultrasound Gel	Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)	01-01	Sterile Ultrasound Transmission Gel
B6;CAG-luc, -GFP mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	025854	Bioluminescence cell source
BD Insulin Syringes with needle	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)	328431	Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G
C57BL/6 mouse - aged	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 6 months old; aged model
C57BL/6 mouse - young	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 4-6 weeks; young model
Chloraprep One-step 0.67 mL	CareFusion (El Paso, TX, USA)	260449	chlorhexidine gluconate applicator
Curity Cotton Tipped Applicator	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	A5000-2	Sterile, 6"
D-Luciferin	Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)	LUCK-1G
Isoflurane	Henry Schein (Melville, NY, USA)	1182097
IVIS Lumina X5	PerkinElmer (Melville, NY, USA)	n/a	In vivo bioluminescence imaging system
J:NU mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	007850	Athymic nude model
Kendall Hypoallergenic Paper Tape	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	1914C
Kimtech Surgical Nitrile Gloves	Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)	56892	Sterile Gloves
Nair Hair Remover Lotion	Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)	n/a	Depilatory agent
NOD scid gamma (NSG) mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	005557	Immunodeficient model
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x	Corning (Corning, NY, USA)	21-040-CV
Puralube Vet Ointment	Med Vet International	PH-PURALUBE-VET	Eye ointment
Sheathes	Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)	10040	Sterile Ultrasound Probe Covers
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)	EZ-17 85	Anesthesia induction chamber
Transducer MX550D	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)
Trypan Blue, 0.4% solution in PBS	MP Biomedicals (Solon, OH, USA)	91691049
Vevo 3100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Ultrasound imaging system
Vevo 3100 Lab Software	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Version 3.2.7 for imaging and analysis
Vevo Compact Dual Anesthesia System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Tabletop isoflurane-based anesthesia unit
Vevo Imaging Station	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Procedural platform