Une technique mini-invasive, précise et efficace pour l’injection intrathymique chez la souris

Résumé

Le présent protocole décrit une procédure de radiologie interventionnelle établie pour l’injection intrathymique chez la souris afin d’éviter le risque de chirurgie ouverte et d’améliorer la précision des injections percutanées à l’aveugle.

Résumé

L’injection intrathymique dans des modèles murins est une technique importante pour étudier la fonction thymique et immunitaire, y compris les troubles génétiques et les troubles des lymphocytes T acquis. Cela nécessite des méthodes pour le dépôt direct de réactifs et / ou de cellules dans le thymus de souris vivantes. Les méthodes traditionnelles d’injection intrathymique comprennent la chirurgie thoracique ou les injections percutanées à l’aveugle mini-invasives, qui ont toutes deux des limites importantes. Les appareils d’imagerie par ultrasons à ultra-haute fréquence ont rendu possibles les injections percutanées guidées par l’image chez la souris, améliorant considérablement la précision d’injection de l’approche d’injection percutanée et permettant l’injection de cibles plus petites. Cependant, les injections guidées par l’image reposent sur l’utilisation d’un système ferroviaire intégré, ce qui en fait une procédure rigide et longue. Une méthode unique, sûre et efficace pour les injections intrathymiques percutanées chez la souris est présentée ici, éliminant ainsi la dépendance au système de rail pour les injections. La technique repose sur l’utilisation d’une unité de micro-échographie à haute résolution pour imager le thymus de la souris de manière non invasive. En utilisant une technique à main levée, un radiologue peut placer une pointe d’aiguille directement dans le thymus de la souris sous guidage échographique. Les souris sont nettoyées et anesthésiées avant l’imagerie. Pour un radiologue expérimenté adepte des procédures guidées par ultrasons, la période d’apprentissage de la technique énoncée est assez courte, généralement en une séance. La méthode a un faible taux de morbidité et de mortalité pour les souris et est beaucoup plus rapide que les techniques assistées mécaniques actuelles pour l’injection percutanée. Il permet à l’investigateur d’effectuer efficacement des injections percutanées précises et fiables de thymus de toute taille (y compris de très petits organes tels que le thymus de souris âgées ou immunodéficientes) avec un stress minimal sur l’animal. Cette méthode permet l’injection de lobes individuels si désiré et facilite les expériences à grande échelle en raison de la nature rapide de la procédure.

Introduction

Le thymus joue un rôle essentiel dans le développement et l’immunité des lymphocytes T. La carence en lymphocytes T, qui peut être causée par l’involution thymique, les troubles génétiques, les infections et les traitements contre le cancer, entre autres facteurs, entraîne une mortalité et une morbidité élevées ^1,2. Les modèles murins sont indispensables dans la recherche en immunologie fondamentale et translationnelle et sont utilisés depuis des décennies pour étudier la biologie thymique et le développement des lymphocytes T, ainsi que pour développer des traitements pour les personnes souffrant de dysfonction thymique et de déficit en lymphocytes T ^3,4,5.

Une partie centrale des recherches thymiques a été l’injection intrathymique de matériel biologique tel que des cellules, des gènes ou des protéines dans les modèles murins 6,7,8,9,10,11,12. Les méthodes conventionnelles d’injection intrathymique utilisent la thoracotomie suivie d’une injection intrathymique sous visualisation directe ou d’une injection percutanée « aveugle » dans le médiastin. L’approche chirurgicale augmente considérablement le risque de pneumothorax, entre autres. De plus, le stress élevé pendant cette chirurgie entraîne une immunosuppression, compromettant ainsi potentiellement les données immunologiques¹³. Des chercheurs expérimentés, après un peu de pratique, peuvent effectuer la technique d’injection à l’aveugle, mais cette approche est moins précise et limite donc les sujets expérimentaux aux jeunes souris avec un gros thymus.

L’utilisation du guidage échographique a été introduite comme une alternative précise et peu invasive aux approches traditionnelles d’injection intrathymique¹⁴. Cependant, cette procédure prend beaucoup de temps lors de l’utilisation du système ferroviaire intégré au lieu de la technique à main levée. L’exécution d’injections avec le support d’injection nécessite une optimisation minutieuse de l’imagerie et le positionnement du transducteur à l’aide des différents accessoires tels que le support et le support du transducteur, le système de positionnement X, Y et Z, ainsi qu’un fonctionnement efficace des commandes de micro-manipulation et des extensions du système de rail. Une technique alternative simple, l’injection thymique guidée par ultrasons, est présentée ici par un radiologue utilisant une approche à main levée¹⁵, qui est à la fois une alternative mini-invasive rapide et précise aux méthodes décrites ci-dessus. Il est important de noter que l’approche actuelle peut être réalisée avec n’importe quel système d’imagerie par ultrasons haute résolution sans avoir besoin d’un support d’injection et d’un système de rail intégré. Il est particulièrement utile pour les études nécessitant l’injection d’un grand nombre de souris¹¹, pour les expériences impliquant l’injection des deux lobes thymiques ou pour l’injection précise de petits thymus chez des souris âgées, irradiées ou immunodéprimées¹².

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives de soins aux animaux du Center for Discovery and Innovation (protocole IACUC 290). Pour la présente étude, souris C57BL/6 (femelles, 4-6 semaines), souris C57BL/6 (femelles, 6 mois), souris femelles J:NU, souris femelles NOD scid gamma (NSG) et B6; Les souris CAG-luc, -GFP ont été utilisées comme modèle de jeune souris, modèle de souris âgée, modèle nu athymique, modèle immunodéficient et source cellulaire de bioluminescence, respectivement. Les souris ont été obtenues d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Cette procédure nécessitera généralement deux personnes (une pour rester stérile pendant les injections et une autre pour manipuler les souris).

1. Préparation des animaux

1. Induire l’anesthésie chez les souris en utilisant 3% -4% de gaz isoflurane et maintenir l’anesthésie en utilisant 1% -3% de gaz isoflurane administré via un cône nasal et un vaporisateur étalonné avec précision (voir le tableau des matériaux).
2. Confirmer la profondeur anesthésique appropriée / l’inconscience en ne répondant pas au pincement de la patte postérieure.
3. Retirez la fourrure de la poitrine antérieure des souris en appliquant une fine couche de crème dépilatoire pendant moins de 1 min. Utilisez une serviette en papier humide pour enlever complètement la crème avec la fourrure lâche.
   REMARQUE: L’application d’une trop grande quantité de crème entraînera une inflammation de la peau de la poitrine.
4. Placer une souris à la fois, couchée sur le dos, sur la plate-forme chauffée de la station d’imagerie par ultrasons pour petits animaux (voir le tableau des matériaux) avec le cône nasal en place (figure 1).
5. Fixez la souris à la scène à l’aide d’un ruban adhésif médical au niveau de l’arrière et des membres antérieurs (Figure 1).
6. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir le dessèchement de la cornée.
7. Désinfecter la peau supérieure du thorax sans fourrure à l’aide d’un applicateur de gluconate de chlorhexidine (voir le tableau des matières).

2. Préparation de l’appareil à ultrasons et du champ stérile

1. Activez la sonde linéaire la plus haute fréquence disponible, généralement la sonde avec la résolution spatiale la plus élevée pour la taille de l’animal photographié. Activez la sonde en appuyant sur le bouton correspondant après l’écran de démarrage.
   REMARQUE: Pour cette application avec des souris, la sonde utilisée est conçue spécifiquement pour être utilisée avec des souris et de petits rats (voir le tableau des matériaux).
2. Optimisez les paramètres d’échographie pour l’imagerie et l’injection en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Ajustez la profondeur du champ de vision à une taille appropriée pour l’animal cible en ajustant les curseurs orientés verticalement sur le côté droit de l’écran (Figure 2). La profondeur maximale sera généralement d’environ 6 à 8 mm pour les jeunes souris.
   2. Réglez le gain en niveaux de gris en faisant glisser le bouton le long de la barre horizontale en bas de l’écran (Figure 2). L’objectif est de commencer avec une image légèrement plus sombre qu’une apparence « grise » typique.
   3. Ajustez la zone focale (flèche bleue à droite de l’écran, Figure 2) au niveau prévu du thymus. Pour les jeunes souris, ce sera autour d’une profondeur de 4 mm.
   4. Si vous souhaitez capturer une image, testez la fonctionnalité de l’image de magasin et des boutons de clip de stockage pour vous assurer que les images peuvent être enregistrées de manière appropriée tout au long de la procédure. Pour ce faire, appuyez sur le bouton Enregistrer le clip en bas à droite de l’écran ou sur le bouton Figer , puis sur Enregistrer l’image (Figure 2).
3. Appliquez une petite quantité (~ 1 mL) de gel à ultrasons sur la surface du transducteur (voir le tableau des matériaux) pendant qu’il est debout, soit dans le support de l’appareil à ultrasons, soit dans les mains d’un assistant.
4. Préparez un petit champ stérile à côté de la plate-forme chauffée. Le positionnement optimal pour cela est généralement entre la plate-forme et l’appareil à ultrasons.
   1. Videz ces articles sur le champ stérile : un couvercle de sonde stérile, un élastique, des gants stériles et un gel à ultrasons stérile (voir le tableau des matériaux).
   2. Une fois le champ stérile installé et les articles en place, mettez les gants stériles.
   3. Placez soigneusement le couvercle de la sonde stérile sur le transducteur à ultrasons (ainsi que sur le gel initialement placé sur la sonde). Maintenez la stérilité et ne touchez que la couverture stérile, rien d’autre. Faites glisser l’élastique stérile sur le couvercle de la sonde stérile pour le maintenir en place.
      REMARQUE: Les foyers d’air, quelle que soit leur taille, peuvent interférer avec l’imagerie par ultrasons. Par conséquent, il est essentiel d’appliquer le gel à ultrasons entre le transducteur et le couvercle de la sonde stérile, et sur le dessus du couvercle de la sonde pour assurer une interface sans air entre la sonde à ultrasons et l’animal.
   4. Placer une quantité modérée (2-3 mL) de gel à ultrasons stérile sur le transducteur.
      REMARQUE: L’utilisateur est maintenant prêt à imager une souris anesthésiée.

3. Imagerie et localisation du thymus

1. Tout en maintenant la stérilité, placez la sonde à ultrasons surmontée d’un gel verticalement sur la partie désinfectée de la paroi thoracique antérieure de la souris pour l’imagerie initiale.
   1. Prenez un moment pour regarder l’image échographique et optimisez-la davantage. Revenez à l’étape 2.2 et ajustez pour obtenir une apparence similaire à celle de la figure 3.
2. Scannez la poitrine antérieure de la souris dans un plan transversal. Pour ce faire, tenez le transducteur verticalement et déplacez-le de haut en bas du cou vers l’abdomen dans un mouvement semblable à un pinceau ou « balayage ».
   REMARQUE: Le cœur sera la structure la plus reconnaissable dans la poitrine en raison de son mouvement rapide et de son apparence « chambrée ». Une fois le cœur localisé, il peut être utilisé comme point de référence pour acquérir une image du thymus.
3. Avec le cœur centré dans le champ de vision, balayez légèrement le transducteur vers le cou. Juste supérieur au cœur, le thymus est généralement rencontré.
4. Visualisez le thymus comme une structure bilobée, pyramidale, hypoéchogène (« sombre » ou « noire » apparaissant à l’écran) centrée dans la ligne médiane, antérieure à l’aorte et postérieure au sternum (figure 3A).
5. Notez les deux structures noires rondes appariées (c.-à-d. « hypoéchoïques ») de chaque côté du haut de la poitrine.
   NOTE: Ce sont les veines caves bilatérales. L’aorte est une structure hypoéchogène curviligne similaire dans la ligne médiane entre les deux veines caves. Ceux-ci sont facilement reconnaissables par leur mouvement pulsatile.

4. Injection du thymus

1. Si nécessaire, appliquez plus (2-3 ml) de gel à ultrasons stérile sur le transducteur.
   REMARQUE: Une quantité relativement importante de gel stérile sur le transducteur (par rapport à la taille du thorax de la souris) agira comme un « tampon de gel » autour de la paroi thoracique de la souris. Cela réduira le nombre d’artefacts échographiques fabriqués par l’air dans le champ de vision.
2. À l’aide de la sonde à ultrasons, localisez la partie la plus large du thymus, qui est généralement le site cible idéal pour l’injection. Anticipez une trajectoire horizontale de l’aiguille à l’endroit choisi.
   1. Notez où se trouvent les principaux vaisseaux sanguins (SVC et aorte) sur ce site. Évitez-les pendant l’injection.
   2. Les vaisseaux sanguins seront des structures hypoéchogènes et pulsatiles, comme décrit à l’étape 3.7. En cas de doute, utilisez le mode Doppler couleur pour vérifier l’écoulement dans les vaisseaux (Figure 4A). Activez le mode Doppler couleur en appuyant sur le bouton Couleur à l’écran.
   3. Si l’on prévoit que l’un des principaux vaisseaux sanguins (ou le cœur) se trouve le long de la trajectoire prévue de l’aiguille, choisissez une nouvelle zone cible ou trouvez une approche ou une trajectoire différente.
3. Tenez le transducteur dans une main et une aiguille à insuline de 30 G (voir le tableau des matériaux) avec 10 μL d’injecter dans l’autre.
   REMARQUE : L’injection varie en fonction de la conception expérimentale. La présente étude a utilisé une solution saline tamponnée au phosphate, du bleu de trypan ou de la D-luciférine (0,1 μg/10 μL).
4. Pour commencer le processus d’injection, déplacez le transducteur latéralement de sorte que le thymus soit décentré dans le champ de vision de l’échographie. Assurez-vous que l’autre côté du champ de vision se compose principalement de gel à ultrasons et de rien d’autre.
5. Placez l’extrémité de l’aiguille dans le gel sous le transducteur et déplacez lentement l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit visualisée à côté de la surface de la peau (Figure 4B).
6. Tout en visualisant continuellement l’aiguille sous échographie, insérez l’aiguille dans le thymus avec une trajectoire percutanée, loin des vaisseaux sanguins.
   1. Utilisez une trajectoire horizontale « thymus croisé » pour placer l’extrémité de l’aiguille dans le lobe thymique controlatéral au site d’entrée. Cela explique les fuites potentielles le long du tractus de l’aiguille (figure 5A).
7. Une fois que l’extrémité de l’aiguille est à l’intérieur de la partie souhaitée du thymus, injectez rapidement le contenu (comme 10 μL de bleu de trypan ou de D-luciférine, 0,1 μg/10 μL) de la seringue de 30 G tout en utilisant la visualisation échographique.
   1. Pour stabiliser la seringue pendant l’insertion et l’injection de l’aiguille, tenez la seringue entre le pouce et le troisième doigt et contrôlez le piston de la seringue avec l’index.
8. Retirez l’aiguille une fois que tout le contenu a été déposé.

5. Surveillance post-injection des animaux

1. Transférez l’animal dans une cage vide et observez-le jusqu’à ce qu’il retrouve suffisamment de conscience pour maintenir une position couchée sternale.
   REMARQUE: Le rétablissement complet de l’anesthésie devrait se produire dans les 2 minutes.
2. Surveillez l’animal pendant 10 minutes supplémentaires pour détecter tout signe de détresse, de respiration laborieuse ou de saignement.
   REMARQUE: La douleur post-injection n’est pas attendue et il n’est généralement pas nécessaire d’analgésie post-injection.
3. Une fois complètement rétabli et après une période d’observation post-injection sans incident, remettre l’animal injecté en compagnie d’autres animaux.

Résultats

La mise en œuvre réussie de cette technique repose sur quelques étapes clés à suivre. Tout d’abord, une identification fiable du thymus lui-même doit être assurée. Chez les jeunes souris, cela est simple en raison de la grande taille de la glande (Figure 3A). Chez les souris plus âgées ou immunodéficientes, cela peut être plus difficile; cependant, il est encore très faisable avec un équipement à ultrasons moderne (figure 3B, C)...

Discussion

Une injection à main levée guidée par ultrasons est une technique très précise pour administrer du matériel d’étude au thymus de manière efficace et aseptique. Après la stérilisation initiale de la peau au site d’injection, la stérilité est maintenue pendant la procédure grâce à l’utilisation de gants stériles, de couvercles de sonde à ultrasons stériles et de gel à ultrasons stérile. Contrairement à l’approche percutanée aveugle 10,17 ou au recours à des incisions chirurgicales pour la vis...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquasonic 100 Ultrasound Gel	Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)	01-01	Sterile Ultrasound Transmission Gel
B6;CAG-luc, -GFP mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	025854	Bioluminescence cell source
BD Insulin Syringes with needle	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)	328431	Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G
C57BL/6 mouse - aged	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 6 months old; aged model
C57BL/6 mouse - young	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 4-6 weeks; young model
Chloraprep One-step 0.67 mL	CareFusion (El Paso, TX, USA)	260449	chlorhexidine gluconate applicator
Curity Cotton Tipped Applicator	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	A5000-2	Sterile, 6"
D-Luciferin	Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)	LUCK-1G
Isoflurane	Henry Schein (Melville, NY, USA)	1182097
IVIS Lumina X5	PerkinElmer (Melville, NY, USA)	n/a	In vivo bioluminescence imaging system
J:NU mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	007850	Athymic nude model
Kendall Hypoallergenic Paper Tape	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	1914C
Kimtech Surgical Nitrile Gloves	Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)	56892	Sterile Gloves
Nair Hair Remover Lotion	Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)	n/a	Depilatory agent
NOD scid gamma (NSG) mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	005557	Immunodeficient model
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x	Corning (Corning, NY, USA)	21-040-CV
Puralube Vet Ointment	Med Vet International	PH-PURALUBE-VET	Eye ointment
Sheathes	Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)	10040	Sterile Ultrasound Probe Covers
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)	EZ-17 85	Anesthesia induction chamber
Transducer MX550D	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)
Trypan Blue, 0.4% solution in PBS	MP Biomedicals (Solon, OH, USA)	91691049
Vevo 3100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Ultrasound imaging system
Vevo 3100 Lab Software	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Version 3.2.7 for imaging and analysis
Vevo Compact Dual Anesthesia System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Tabletop isoflurane-based anesthesia unit
Vevo Imaging Station	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Procedural platform