마우스에서 흉강내 주사를 위한 최소 침습적이고 정확하며 효율적인 기술

요약

본 프로토콜은 개복 수술의 위험을 피하고 맹검 경피 주사의 정확도를 향상시키기 위해 마우스에서 흉선 내 주사를 위해 확립 된 중재 적 방사선 절차를 설명합니다.

초록

마우스 모델에서 흉선내 주사는 유전 및 후천성 T 세포 장애를 포함한 흉선 및 면역 기능을 연구하는 중요한 기술입니다. 이를 위해서는 시약 및/또는 세포를 살아있는 마우스의 흉선에 직접 침착시키는 방법이 필요합니다. 흉강 내 주사의 전통적인 방법에는 흉부 수술 또는 최소 침습 경피적 맹검 주사가 포함되며 둘 다 상당한 한계가 있습니다. 초고주파 초음파 영상 장치는 마우스에서 이미지 유도 경피 주사를 가능하게 하여 경피적 주사 접근 방식의 주입 정확도를 크게 향상시키고 더 작은 표적의 주입을 가능하게 합니다. 그러나 이미지 유도 주입은 통합 레일 시스템의 활용에 의존하므로 엄격하고 시간이 많이 소요되는 절차입니다. 마우스에서 경피적 흉선 내 주사를 위한 독특하고 안전하며 효율적인 방법이 여기에 제시되어 주사를 위한 레일 시스템에 대한 의존도를 제거합니다. 이 기술은 고해상도 마이크로 초음파 장치를 사용하여 마우스 흉선을 비 침습적으로 이미지화하는 데 의존합니다. 자유형 기술을 사용하여 방사선 전문의는 초음파 안내에 따라 바늘 끝을 마우스 흉선에 직접 놓을 수 있습니다. 마우스는 이미징 전에 세척되고 마취됩니다. 초음파 유도 절차에 능숙한 숙련된 방사선 전문의의 경우 명시된 기술에 대한 학습 기간은 일반적으로 한 세션 내에서 매우 짧습니다. 이 방법은 마우스에 대한 이환율과 사망률이 낮고 경피 주사를위한 현재의 기계적 보조 기술보다 훨씬 빠릅니다. 이를 통해 조사자는 동물에 대한 스트레스를 최소화하면서 모든 크기의 흉선 (노화 또는 면역 결핍 마우스의 흉선과 같은 매우 작은 기관 포함)의 정확하고 신뢰할 수있는 경피 주사를 효율적으로 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 원하는 경우 개별 로브를 주입할 수 있으며 절차의 시간 절약 특성으로 인해 대규모 실험을 용이하게 합니다.

서문

흉선은 T 세포 발달과 면역에 필수적인 역할을합니다. 흉선 침범, 유전 질환, 감염 및 암 치료로 인해 발생할 수 있는 T 세포 결핍은 높은 사망률과 이환율을 유발합니다^1,2. 마우스 모델은 기초 및 중개 면역학 연구 모두에서 없어서는 안될 필수 요소이며 흉선 생물학 및 T 세포 발달을 연구하고 흉선 기능 장애 및 T 세포 결핍으로 고통받는 사람들을위한 치료법을 개발하는 데 수십 년 동안 사용되어 왔습니다 ^3,4,5.

흉선 조사 의 중심 부분은 마우스 모델 6,7,8,9,10,11,12 에서 세포^, 유전자 또는 단백질과 같은 생물학적 물질의 흉선 내 주입이었습니다. 기존의 흉강 내 주사 방법은 개흉술 후 직접 시각화 또는 종격동으로의 "맹검" 경피 주사를 사용하는 흉강내 주사를 사용합니다. 외과적 접근은 무엇보다도 기흉 위험을 크게 증가시킵니다. 더욱이, 이 수술 중 상승된 스트레스는 면역억제를 초래하여 잠재적으로 면역학적 데이터를 손상시킬 수 있다¹³. 숙련 된 연구자들은 약간의 연습을 한 후에 블라인드 주사 기술을 수행 할 수 있지만이 접근법은 정확도가 떨어지므로 실험 대상을 큰 흉선을 가진 어린 마우스로 제한합니다.

초음파 유도의 활용은 전통적인 흉강 내 주사 접근법¹⁴에 대한 정확하고 최소 침습적 대안으로 도입되었습니다. 그러나이 절차는 자유형 기술 대신 통합 레일 시스템을 사용할 때 매우 시간이 많이 걸립니다. 주입 마운트로 주입을 수행하려면 변환기 스탠드 및 마운트, X, Y 및 Z 위치 지정 시스템과 같은 다양한 부착물을 사용하여 변환기를 신중하게 이미징하고 위치를 지정해야 하며 미세 조작 제어 장치 및 레일 시스템 확장의 능숙한 작동이 필요합니다. 간단한 대체 기술인 초음파 유도 흉선 주사가 자유형 접근법(¹⁵)을 사용하여 방사선 전문의에 의해 수행되며, 이는 상술한 방법에 대한 신속하고 정확한 최소 침습적 대안이다. 중요한 것은 현재의 접근 방식은 주입 마운트 및 통합 레일 시스템 없이 모든 고해상도 초음파 이미징 시스템으로 수행할 수 있다는 것입니다. 이는 많은 수의 마우스(¹¹)의 주사를 필요로 하는 연구, 양쪽 흉선엽의 주사를 포함하는 실험, 또는 노화, 방사선 조사 또는 면역이 저하된 마우스(¹²)에서 작은 흉선의 정확한 주사에 특히 유용하다.

프로토콜

모든 절차는 발견 및 혁신 센터 (IACUC 프로토콜 290)의 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 본 연구를 위해, C57BL/6 마우스 (암컷, 4-6주령), C57BL/6 마우스 (암컷, 6개월령), J:NU 암컷 마우스, NOD scid 감마 (NSG) 암컷 마우스, 및 B6; CAG-luc, -GFP 마우스를 각각 젊은 마우스 모델, 노화된 마우스 모델, 무흉선 누드 모델, 면역결핍 모델, 및 생물발광 세포 공급원으로서 사용하였다. 마우스는 상업적 공급원으로부터 수득하였다( 재료 표 참조). 이 절차에는 일반적으로 두 사람이 필요합니다 (한 명은 주사를 수행하는 동안 멸균 상태를 유지하고 다른 한 명은 마우스를 취급해야합니다).

1. 동물 준비

1. 3%-4% 이소플루란 가스를 사용하여 마우스에서 마취를 유도하고 노즈 콘과 정밀 보정된 기화기를 통해 투여된 1%-3% 이소플루란 가스를 사용하여 마취를 유지합니다(재료 표 참조).
2. 뒷발 꼬집음에 반응하지 않음으로써 적절한 마취 깊이 / 무의식을 확인하십시오.
3. 1 분 미만 동안 탈모 크림을 얇게 바르면 생쥐의 가슴 앞쪽 부위에서 털을 제거하십시오. 젖은 종이 타월을 사용하여 느슨한 모피와 함께 크림을 완전히 제거하십시오.
   알림: 크림을 너무 많이 바르면 가슴 부위 피부에 염증이 생깁니다.
4. 한 번에 한 마리의 마우스를 작은 동물 초음파 이미징 스테이션( 재료 표 참조)의 가열된 플랫폼에 놓고 노즈 콘을 제자리에 놓습니다(그림 1).
5. 뒷다리와 앞다리에 의료용 접착 테이프를 사용하여 마우스를 스테이지에 고정합니다(그림 1).
6. 각막 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오.
7. 클로르헥시딘 글루코 네이트 애플리케이터를 사용하여 털이없는 상부 흉부 피부를 소독하십시오 ( 재료 표 참조).

2. 초음파 기계 및 멸균 분야의 준비

1. 사용 가능한 가장 높은 주파수 선형 프로브, 일반적으로 이미징되는 동물의 크기에 대해 가장 높은 공간 해상도를 가진 프로브를 활성화합니다. 시작 화면 뒤에 있는 해당 버튼을 눌러 프로브를 활성화합니다.
   참고: 마우스를 사용한 이 응용 프로그램의 경우 사용된 프로브는 마우스 및 작은 쥐와 함께 사용하도록 특별히 설계되었습니다( 재료 표 참조).
2. 아래 단계에 따라 이미징 및 주입을 위한 초음파 설정을 최적화하십시오.
   1. 화면 오른쪽에 있는 수직 방향 슬라이더를 조정하여 시야의 깊이를 대상 동물에 적합한 크기로 조정합니다(그림 2). 최대 깊이 설정은 일반적으로 어린 마우스의 경우 약 6-8mm입니다.
   2. 화면 아래쪽의 가로 막대를 따라 단추를 밀어 회색조 게인을 조정합니다(그림 2). 목표는 일반적인 "회색" 모양보다 약간 어두운 이미지로 시작하는 것입니다.
   3. 초점 영역(화면 오른쪽의 파란색 화살표, 그림 2)을 흉선의 예상 수준으로 조정합니다. 어린 생쥐의 경우 깊이는 약 4mm입니다.
   4. 이미지 캡처가 필요한 경우 이미지 저장 및 클립 저장 단추의 기능을 테스트하여 절차 전체에서 이미지를 적절하게 저장할 수 있는지 확인합니다. 화면 오른쪽 아래에 있는 Save Clip 단추를 누르거나 Freeze 단추를 누른 다음 이미지 저장을 눌러 이 작업을 수행합니다(그림 2).
3. 트랜스듀서 표면에 소량(~1mL)의 초음파 젤을 바르십시오( 재료 표 참조) 똑바로 서 있는 동안 초음파 기계 홀더 또는 보조자의 손에 올려 놓습니다.
4. 가열 된 플랫폼 옆에 작은 멸균 필드를 준비하십시오. 이를 위한 최적의 위치는 일반적으로 플랫폼과 초음파 기계 사이입니다.
   1. 멸균 프로브 커버, 고무 밴드, 멸균 장갑 및 멸균 초음파 젤과 같은 항목을 멸균 필드에 비우십시오( 재료 표 참조).
   2. 멸균 필드를 설치하고 품목을 제자리에 놓은 상태에서 멸균 장갑을 착용하십시오.
   3. 멸균 프로브 덮개를 초음파 변환기 위(및 처음에 프로브에 놓인 젤 위)에 조심스럽게 놓습니다. 무균 상태를 유지하고 멸균 덮개 만 만지십시오. 멸균 고무 밴드를 멸균 프로브 커버 위로 밀어 제자리에 고정합니다.
      알림: 공기 초점은 크기에 관계없이 초음파 영상을 방해할 수 있습니다. 따라서 트랜스듀서와 멸균 프로브 커버 사이, 그리고 프로브 커버 상단에 초음파 젤을 적용하여 초음파 프로브와 동물 사이의 공기가 없는 인터페이스를 보장하는 것이 필수적입니다.
   4. 적당량(2-3mL)의 멸균 초음파 젤을 변환기에 놓습니다.
      참고: 이제 사용자가 마취된 마우스를 이미지화할 준비가 되었습니다.

3. 흉선 이미징 및 위치 파악

1. 무균 상태를 유지하면서 초기 이미징을 위해 초음파 젤로 덮인 프로브를 마우스 전방 흉벽의 소독 된 부분에 수직으로 놓습니다.
   1. 잠시 시간을내어 초음파 이미지를보고 더 최적화하십시오. 2.2단계로 돌아가서 그림 3과 비슷한 모양을 얻도록 조정합니다.
2. 횡단면에서 마우스의 앞쪽 가슴을 스캔하십시오. 변환기를 수직으로 잡고 붓과 같은 또는 "쓸어넘기" 동작으로 목에서 복부까지 위아래로 움직여 이를 수행합니다.
   알림: 심장은 빠른 움직임과 "챔버가 있는" 모양으로 인해 가슴에서 가장 눈에 띄는 구조가 될 것입니다. 심장이 국소화되면 흉선의 이미지를 얻기위한 기준점으로 사용할 수 있습니다.
3. 심장이 시야 중앙에 오도록 하여 변환기를 목 쪽으로 약간 쓸어넘깁니다. 심장보다 우월한 흉선은 일반적으로 발생합니다.
4. 흉선을 중중선의 중심, 대동맥 앞쪽, 흉골 뒤쪽에있는 이중 형, 피라미드 형, 저 에코 ( "어두운"또는 "검은 색"이 화면에 나타남) 구조로 시각화하십시오 (그림 3A).
5. 가슴 위쪽의 양쪽에 있는 두 개의 둥근 쌍을 이루는 검은색(즉, "저에코") 구조를 기록해 둡니다.
   참고: 이들은 양측 정맥입니다. 대동맥은 두 대정맥 사이의 정중선에서 유사한 곡선 저 에코 구조입니다. 이들은 박동성 운동으로 쉽게 알아볼 수 있습니다.

4. 흉선 주사

1. 필요한 경우 트랜스듀서에 더 많은(2-3mL) 멸균 초음파 젤을 바르십시오.
   참고: 변환기에 있는 비교적 많은 양의 멸균 젤(마우스 흉부의 크기에 비해)은 마우스 흉벽 주변에서 "겔 패드" 역할을 합니다. 이것은 시야 내에서 공기에 의해 만들어진 초음파 인공물의 수를 줄입니다.
2. 초음파 프로브를 사용하여 일반적으로 주사에 이상적인 표적 부위 인 흉선의 가장 넓은 부분을 찾습니다. 선택한 위치에서 수평 바늘 궤적을 예상합니다.
   1. 이 부위의 주요 혈관(SVC 및 대동맥)이 어디에 있는지 확인하십시오. 주사하는 동안 이것을 피하십시오.
   2. 혈관은 단계 3.7에 설명 된대로 저 에코, 박동성 구조입니다. 확실하지 않은 경우 컬러 도플러 모드를 사용하여 용기 내부의 흐름을 확인하십시오(그림 4A). 컬러 도플러 모드는 화면에서 컬러 버튼을 눌러 활성화합니다.
   3. 주요 혈관 (또는 심장) 중 하나가 예상 바늘 궤적을 따라있을 것으로 예상되는 경우 새로운 목표 영역을 선택하거나 다른 접근 방식 / 궤적을 찾으십시오.
3. 한 손에는 변환기를 잡고 다른 한 손에는 10μL의 주사액이 있는 30G 인슐린 바늘( 재료 표 참조)을 잡습니다.
   알림: 주입 물은 실험 설계에 따라 다릅니다. 본 연구에서는 인산염 완충 식염수, 트리판 블루 또는 D-루시페린(0.1μg/10μL)을 사용했습니다.
4. 주입 과정을 시작하려면 흉선이 초음파 시야에서 중심에서 벗어나도록 변환기를 옆으로 움직입니다. 시야의 다른 쪽이 대부분 초음파 젤로 구성되어 있는지 확인하십시오.
5. 변환기 아래의 젤에 바늘 끝을 놓고 바늘이 피부 표면에 인접하여 시각화될 때까지 바늘을 천천히 움직입니다(그림 4B).
6. 초음파 하에서 바늘을 지속적으로 이미징하면서 혈관에서 떨어진 경피적 궤적으로 흉선에 바늘을 삽입하십시오.
   1. "교차 흉선"수평 궤적을 사용하여 바늘 끝을 진입 부위의 반대쪽 흉선 엽에 배치하십시오. 이것은 바늘 관을 따라 잠재적 인 누출을 설명합니다 (그림 5A).
7. 바늘 끝이 흉선의 원하는 부분 안에 있으면 초음파 시각화를 사용하면서 30G 주사기에서 내용물(예: 트리판 블루 또는 D-루시페린 10μL 10μL, 0.1μg/10μL)을 빠르게 주입합니다.
   1. 바늘 삽입 및 주입 중에 주사기를 안정화하려면 엄지와 세 번째 손가락 사이에 주사기를 잡고 집게 손가락으로 주사기 플런저를 제어합니다.
8. 모든 내용물이 입금 된 후 바늘을 제거하십시오.

5. 동물의 주사 후 모니터링

1. 동물을 빈 케이지로 옮기고 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 관찰하십시오.
   알림: 마취에서 완전히 회복되는 것은 2분 이내에 발생할 것으로 예상됩니다.
2. 동물을 추가로 10 분 동안 모니터링하여 고통, 호흡 곤란 또는 출혈의 징후가 있는지 확인하십시오.
   참고: 주사 후 통증은 예상되지 않으며 일반적으로 주사 후 진통이 필요하지 않습니다.
3. 완전히 회복되고 사건이없는 주사 후 관찰 기간을 거친 후 주사 된 동물을 다른 동물의 회사로 되돌립니다.

결과

이 기술을 성공적으로 구현하려면 따라야 할 몇 가지 주요 단계가 필요합니다. 첫째, 흉선 자체의 확실한 식별이 보장되어야합니다. 어린 생쥐의 경우 샘의 크기가 크기 때문에 간단합니다 (그림 3A). 나이가 많은 마우스나 면역 결핍 마우스에서는 더 어려울 수 있습니다. 그러나 최신 초음파 장비로는 여전히 매우 실현 가능합니다 (그림 3B, C

토론

초음파 유도 자유 손 주사는 효율적이고 무균 방식으로 흉선에 연구 자료를 전달하는 매우 정확한 기술입니다. 주사 부위에서 피부의 초기 멸균 후, 멸균 장갑, 멸균 초음파 프로브 커버 및 멸균 초음파 젤의 사용으로 인해 절차 중에 멸균이 유지됩니다. 맹검 경피적 접근법 10,17 또는 마우스의 흉선 내 주사에 일반적으로 사용되는 방법 인 흉선^18,19의 직접 시각화를위한 외과 적 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquasonic 100 Ultrasound Gel	Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)	01-01	Sterile Ultrasound Transmission Gel
B6;CAG-luc, -GFP mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	025854	Bioluminescence cell source
BD Insulin Syringes with needle	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)	328431	Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G
C57BL/6 mouse - aged	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 6 months old; aged model
C57BL/6 mouse - young	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 4-6 weeks; young model
Chloraprep One-step 0.67 mL	CareFusion (El Paso, TX, USA)	260449	chlorhexidine gluconate applicator
Curity Cotton Tipped Applicator	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	A5000-2	Sterile, 6"
D-Luciferin	Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)	LUCK-1G
Isoflurane	Henry Schein (Melville, NY, USA)	1182097
IVIS Lumina X5	PerkinElmer (Melville, NY, USA)	n/a	In vivo bioluminescence imaging system
J:NU mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	007850	Athymic nude model
Kendall Hypoallergenic Paper Tape	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	1914C
Kimtech Surgical Nitrile Gloves	Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)	56892	Sterile Gloves
Nair Hair Remover Lotion	Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)	n/a	Depilatory agent
NOD scid gamma (NSG) mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	005557	Immunodeficient model
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x	Corning (Corning, NY, USA)	21-040-CV
Puralube Vet Ointment	Med Vet International	PH-PURALUBE-VET	Eye ointment
Sheathes	Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)	10040	Sterile Ultrasound Probe Covers
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)	EZ-17 85	Anesthesia induction chamber
Transducer MX550D	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)
Trypan Blue, 0.4% solution in PBS	MP Biomedicals (Solon, OH, USA)	91691049
Vevo 3100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Ultrasound imaging system
Vevo 3100 Lab Software	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Version 3.2.7 for imaging and analysis
Vevo Compact Dual Anesthesia System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Tabletop isoflurane-based anesthesia unit
Vevo Imaging Station	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Procedural platform