Investigación del transporte a larga distancia de ácidos perfluoroalquilo en trigo a través de una técnica de exposición de raíz dividida

Resumen

El presente protocolo describe un método simple y eficiente para el transporte a larga distancia de ácidos perfluoroalquilo en el trigo.

Resumen

Grandes cantidades de ácidos perfluoroalquilo (PFAA) se han introducido en el suelo y las plantas las han acumulado, lo que plantea riesgos potenciales para la salud humana. Es imperativo investigar la acumulación y translocación de PFAA dentro de las plantas. El transporte a larga distancia es una vía importante para los PFAA transferidos de las hojas de la planta a los tejidos comestibles a través del floema. Sin embargo, anteriormente era difícil evaluar el potencial de translocación de la contaminación orgánica en un período de exposición a corto plazo. El experimento de raíz dividida proporciona una solución para descubrir eficazmente la translocación a larga distancia de PFAA utilizando un experimento hidropónico, que, en este estudio, se llevó a cabo en dos tubos de centrífuga de 50 ml (A y B), de los cuales el tubo de centrífuga A tenía 50 ml de solución nutritiva estéril Hoagland de un cuarto de fuerza, mientras que el tubo de centrífuga B tenía la misma cantidad de concentración de nutrientes. y los PFAA objetivo (ácido perfluorooctano sulfónico, PFOS, y ácido perfluorooctano, PFOA) añadidos a una concentración dada. Una raíz de trigo integral se separó manualmente en dos partes y se insertó cuidadosamente en los tubos A y B. La concentración de PFAAs en las raíces, brotes de trigo y soluciones en los tubos A y B se evaluaron utilizando LC-MS/MS, respectivamente, después de ser cultivados en una incubadora durante 7 días y cosechados. Los resultados sugirieron que el PFOA y el PFOS experimentan un proceso similar de transporte a larga distancia a través del floema desde el brote hasta la raíz y podrían liberarse en el ambiente ambiente. Por lo tanto, la técnica de raíz dividida se puede utilizar para evaluar el transporte a larga distancia de diferentes productos químicos.

Introducción

Los ácidos perfluoroalquilo (PFAA) son ampliamente utilizados en diversos productos comerciales e industriales debido a sus excelentes propiedades fisicoquímicas, incluida la actividad superficial y la estabilidad térmica y química ^1,2,3. El ácido perfluorooctano sulfónico (PFOS) y el ácido perfluorooctano (PFOA) son los dos PFAA más importantes utilizados en todo el mundo ^4,5,6, aunque estos compuestos se enumeraron en el Convenio internacional de Estocolmo en 2009 y 2019^7,8, respectivamente. Debido a su persistencia y uso generalizado, el PFOS y el PFOA se han detectado ampliamente en diversas matrices ambientales. Las concentraciones de PFOA y PFOS en las aguas superficiales de diferentes ríos y lagos del mundo son de 0,15 a 52,8 ng/L y de 0,09 a 29,7 ng/L,^{respectivamente9.} Debido al uso de aguas subterráneas o regeneradas para riego y también al uso de biosólidos como fertilizantes, el PFOA y el PFOS están ampliamente presentes en el suelo, oscilando entre 0,01-123 μg/kg y 0,003-162 μg/kg, respectivamente¹⁰, lo que podría introducir una gran cantidad de PFAA en las plantas y plantear riesgos potenciales para la salud humana. Las concentraciones de PFAA (C4-C8) en suelos agrícolas y granos (trigo y maíz) muestran una correlación lineal positiva¹¹. Por lo tanto, es imperativo investigar la acumulación y translocación de PFAA dentro de las plantas.

La translocación de PFAAs en plantas ocurre primero desde las raíces a los tejidos aéreos, y la translocación de PFAAs desde las raíces a los tejidos comestibles se considera transporte a larga distancia^12,13. Estudios previos han detectado bisfenol A, nonilfenol y estrógenos naturales en verduras y frutas¹⁴, lo que implica que estos productos químicos podrían migrar a través del floema. Por lo tanto, descubrir la translocación de PFAA en las plantas es importante para evaluar su riesgo potencial. Sin embargo, la acumulación y translocación de PFAA se ven afectadas por su biodisponibilidad en el suelo, por lo que no es fácil evaluar la capacidad de translocación de los PFAA objetivo en las plantas. Además, los experimentos hidropónicos generalmente están limitados por varios factores, lo que dificulta la adquisición de los tejidos comestibles de las plantas. Típicamente, el floema fue recolectado directamente de las plantas para observar la translocación de compuestos orgánicos a través de largas distancias en las plantas, mientras que es difícil adquirir floemas de las plántulas de las plantas¹⁵. Por lo tanto, se introdujo un método simple y efectivo, la técnica de raíz dividida, para estudiar la translocación de PFAA en plantas durante una exposición relativamente a corto plazo. En cuanto a la investigación de raíz dividida, las raíces en una plántula de planta se separan en dos partes; una parte se coloca en la solución nutritiva que contiene PFAA objetivo (tubo A), y la otra se coloca en la solución nutritiva en ausencia de PFAA (tubo B). Después de la exposición durante varios días, los PFAA en el tubo B se miden mediante LC-MS/MS. La concentración de PFAAs en el tubo B revela el potencial de translocación de PFAAs a través del floema dentro de las plantas^16,17,18.

El experimento de raíz dividida se ha reportado para estudiar la translocación a larga distancia de muchos compuestos en plantas, como las nanopartículas de CuO¹⁷, los estrógenos esteroides 18 y los ésteres organofosforados¹⁶. Estos estudios proporcionaron evidencia de que estos compuestos podrían transferirse a través del floema a las partes comestibles de las plantas. Sin embargo, es necesario explorar más a fondo si los PFAA podrían ayudar en la translocación en las plantas y el impacto de las propiedades de los compuestos. Sobre la base de estos informes, el experimento de raíz dividida se llevó a cabo en el presente estudio para revelar el transporte a larga distancia de PFAA en el trigo.

Protocolo

Las semillas de trigo, Triticum aestivum L., fueron adquiridas (ver Tabla de Materiales) y utilizadas para el presente estudio.

1. Germinación de plántulas de trigo y cultivo hidropónico

1. Seleccione semillas de trigo de tamaño similar y desinfúntelas durante 15 minutos con una solución de peróxido de hidrógeno al 8% (p/p).
2. Enjuague bien las semillas desinfectadas con agua desionizada y luego colóquelas en papel de filtro húmedo en la oscuridad a temperatura ambiente para germinar durante 5 días.
3. Seleccione aproximadamente nueve plántulas germinadas de tamaño uniforme y transfiéralas a vasos de plástico con 250 ml de solución nutritiva (1/4 de fuerza de la solución de Hoagland; su composición química se muestra en la Tabla 1).
   NOTA: De las nueve semillas, tres fueron seleccionadas para blanco, PFOA y PFOS, respectivamente.
4. Cultivar las plántulas en cámaras de crecimiento durante 7 días antes de la exposición con un ciclo de 14 h a 22 °C y 10 h a 27 °C.

2. El experimento de división de raíces

1. Realizar el cultivo de plántulas en dos tubos centrífugos de 50 mL (A y B).
   NOTA: En el tubo de centrífuga A, había 50 ml de solución estéril de Hoagland de 1/4 de fuerza, y la misma cantidad de solución nutritiva estaba presente en el tubo de centrífuga B.
   1. Disuelva el PFOA y el PFOS comerciales (consulte la Tabla de materiales) en metanol y dilúyalos con la solución nutritiva estéril como solución madre. Luego, agregue la solución madre al tubo B a una concentración de PFOA/PFOS de 100 μg/L.
   2. Realizar los tratamientos por triplicado con un control en blanco para monitorizar la contaminación de fondo. En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático de los experimentos de exposición de raíz dividida.
2. Separe las raíces enteras de la plántula de trigo con pinzas en dos partes iguales para que las raíces aún estén enganchadas al mismo brote e insértelas cuidadosamente en los tubos A y B, respectivamente.
3. Selle los dos tubos con papel de aluminio y críquelos en una incubadora durante 7 días. Mantener las mismas condiciones de incubación indicadas en el paso 1.4.
4. Recoja las plántulas de trigo después de 7 días de cultivo y separe el trigo en tres partes: brotes y raíces cultivadas en la solución con púas de PFAA y solución sin púas, respectivamente, utilizando tijeras esterilizadas.
5. Liofilizar las muestras de plantas en un liofilizador a −55 °C durante 48 h.
6. Homogeneizar y pesar las muestras de raíz y brote. Recoja las muestras de solución con y sin púas.

3. Extracción de PFOA y PFOS de tejidos vegetales

1. Agregue 2 ml de tampón de carbonato de sodio (0.25 mol/L), 1 mL de sulfato de hidrógeno de tetrabutilamonio (0.5 mol/L) y 5 ml de metil terc-butil éter (consulte la Tabla de materiales) a un tubo de polipropileno de 15 ml, incluida la raíz o brote homogeneizado.
2. Agitar el tubo a 250 rpm durante 20 min y centrifugar a 2.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente para obtener la fase orgánica sobrenadante. Realice el proceso de extracción dos veces.
3. Mezclar los extractos recolectados, vaporizar hasta que se sequen en una suave corriente de nitrógeno (_N2), y luego reconstituir con 5 mL de metanol y vorártelos, manteniendo la misma velocidad durante aproximadamente 30 s.
4. Acondicione el cartucho de pesticarb (consulte la Tabla de materiales) con 5 ml de NH₄OH al 0,1% en metanol, 5 ml de agua y 5 ml de metanol.
5. Agregue los 5 ml de solución de metanol de extracción a través del cartucho de pesticarb (500 mg/6 ml) para eliminar el pigmento, eluya el cartucho con 5 ml de metanol y recoja en los mismos tubos.
6. Evaporar los 10 ml de solución de metanol recogidos hasta casi sequedad y reconstituir con 200 μL de metanol, seguido de vórtice y centrifugación a 10.000 x g durante 20 min a temperatura ambiente.

4. Preparación de la muestra de la solución nutritiva

1. Acondicione con 5 ml de metanol y 5 ml de agua para activar el cartucho de extracción de polímero mejorado polar (PEP) (60 mg/g, 3 ml) (consulte la Tabla de materiales).
2. Añadir 1 ml de la solución enriquecida o 50 ml de las muestras de solución sin pinchos (paso 2.6) a través del cartucho, respectivamente.
3. Eluya los PFAA objetivo con 10 ml de metanol, evapore el extracto con N₂ suave y luego reconstituya con 200 μL de metanol para su análisis.

5. Análisis instrumental

1. Utilice una cromatografía líquida UPLC de ultra rendimiento junto con espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS) para la cuantificación de los PFAA objetivo en modo de reacción múltiple (MRM) e ionización por electrospray negativo (ESI-) (consulte la Tabla de materiales).
2. Inyecte 10 μL de muestras y separe los PFAA objetivo utilizando una columna cromatográfica líquida C18 (1,7 μm, 2,1 mm x 50 mm, consulte la Tabla de materiales), y utilice acetato de amonio de 2 mM en agua (fase A) y metanol (fase B) como fase móvil para UPLC, con un caudal de 0,3 ml / min. Mantener la temperatura de la columna a 50 °C.
   NOTA: Las transiciones iónicas de PFOA y PFOS son 413 a 369 y 499 a 80, respectivamente. El programa de elución de gradiente y los parámetros instrumentales LC-MS/MS para la cuantificación de los PFAA objetivo se enumeran en la Tabla 2.
3. Procese los datos con el software de análisis de datos (consulte la Tabla de materiales).

Resultados

El experimento de raíz dividida investigó el transporte a larga distancia de PFAA en el trigo. Como se muestra en la figura 2A,C, tanto el PFOA como el PFOS podrían ser absorbidos por la raíz de trigo y transferidos al brote. No se detectaron PFOS ni PFOA en la raíz de trigo y la solución en el tubo A del control en blanco. Se encontró que se detectaron PFOS y PFOA en las raíces de trigo cultivadas en la solución sin pinchos, con una concentración de 0,26 ng/g ± 0...

Discusión

Para garantizar la precisión de este método, se debe realizar una operación cuidadosa para garantizar que la solución con púas en el tubo B no contamine la solución sin pinchos en el tubo A. La concentración dada de PFAA objetivo en el presente estudio fue relativamente más alta que su concentración en el entorno real, lo que garantiza monitorear los PFAA objetivo en trigo y solución sin púas utilizando LC-MS / MS.

Existen limitaciones para este método. Dado que solo se utilizó u...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACQUITY UPLC BEH C18 column	Waters, Milford, MA		Liquid chromatographic column
Cleanert PEP cartridge	Bonna- Angel Technologies, China		Solid phase extraction column
Clearnert Pesticarb cartridge	Bonna- Angel Technologies, China		Solid phase extraction column
LC-MS/MS(Waters Acquity UPLC i-Class Coupled to Xevo TQ-S)	Waters, Milford, MA		Liquid chromatography and mass spectrometry
Lyophilizer	Boyikang Instrument Ltd., Beijing, China	FD-1A50	Freeze-dried sample
Masslynx	Waters, Milford, MA		data analysis software
Methyl tert-butyl ether	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)		use for extracting target compounds from plant tissues
MPFAC-MXA	Wellington Laboratories (Ontario, Canada)	PFACMXA0518	the internal standards
PFAC-MXB	Wellington Laboratories (Ontario, Canada)	PFACMXB0219	mixture of PFAA calibration standards
PFOA	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)	335-67-1	a represent PFAAs
PFOS	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)	2795-39-3	a represent PFAAs
Sodium carbonate buffer	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)		use for extracting target compounds from plant tissues
Tetrabutylammonium hydrogen sulfate	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)		use for extracting target compounds from plant tissues
Wheat seeds	Chinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing,China)		Triticum aestivum L.