АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает простой и эффективный метод переноса перфторалкильных кислот в пшенице на большие расстояния.

Аннотация

Большое количество перфторалкильных кислот (PFAA) было введено в почву и накоплено растениями, создавая потенциальные риски для здоровья человека. Крайне важно исследовать накопление и транслокацию PFAA внутри растений. Транспортировка на большие расстояния является важным путем для PFAA, переносимых из листьев растений в съедобные ткани через флоэму. Однако ранее было трудно оценить транслокационный потенциал органического загрязнения в краткосрочном периоде воздействия. Эксперимент с расщепленным корнем обеспечивает решение для эффективного раскрытия дальней транслокации PFAA с использованием гидропонного эксперимента, который в этом исследовании проводился в двух 50 мл центрифужных трубок (A и B), из которых центрифужная трубка A имела 50 мл стерильного питательного раствора Hoagland в одну четверть, в то время как центрифужная трубка B имела такое же количество концентрации питательных веществ, и целевые ПФАА (перфтороктановая сульфоновая кислота, ПФОС и перфтороктановая кислота, ПФОК), добавленные в данной концентрации. Цельный пшеничный корень вручную разделяли на две части и аккуратно вставляли в трубки А и В. Концентрацию PFAA в корнях, побегах пшеницы и растворах в трубках A и B оценивали с использованием LC-MS/MS, соответственно, после культивирования в инкубаторе в течение 7 дней и сбора урожая. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ПФОК и ПФОС подвергаются аналогичному процессу переноса на большие расстояния через флоэму от побега к корню и могут высвобождаться в окружающую среду. Таким образом, метод расщепления корней может быть использован для оценки переноса различных химических веществ на большие расстояния.

Введение

Перфторалкиловые кислоты (PFAA) широко используются в различных коммерческих и промышленных продуктах благодаря их превосходным физико-химическим свойствам, включая поверхностную активность и термическую и химическую стабильность 1,2,3. Перфтороктановая сульфоновая кислота (ПФОС) и перфтороктановая кислота (ПФОК) являются двумя наиболее важными PFAA, используемыми во всем мире 4,5,6, хотя эти соединения были перечислены в международной Стокгольмской конвенции в 2009 и 2019 годах 7,8 соответственно. Благодаря своей стойкости и широкому применению ПФОС и ПФОК широко обнаруживаются в различных экологических матрицах. Концентрации ПФОК и ПФОС в поверхностных водах различных мировых рек и озер составляют соответственно 0,15-52,8 нг/л и 0,09-29,7 нг/л9. В связи с использованием грунтовых вод или регенерированной воды для орошения, а также использованием биотвердых веществ в качестве удобрений в почве широко присутствуют ПФОК и ПФОС в диапазоне от 0,01 до 123 мкг/кг до 0,003-162 мкг/кг, соответственно10, что может привести к образованию большого количества ПФЖК и создать потенциальную опасность для здоровья человека. Концентрации PFAA (C4-C8) в сельскохозяйственных почвах и зерновых (пшеница и кукуруза) показывают положительную линейную корреляцию11. Поэтому крайне важно исследовать накопление и транслокацию PFAA внутри растений.

Транслокация PFAA в растениях в первую очередь происходит от корней к надземным тканям, а транслокация PFAA от корней к съедобным тканям рассматривается как транспортировка на большие расстояния 12,13. Предыдущие исследования обнаружили бисфенол А, нонилфенол и природные эстрогены в овощах и фруктах14, что означает, что эти химические вещества могут мигрировать через флоэму. Следовательно, выявление транслокации PFAA в растениях важно для оценки их потенциального риска. Однако на накопление и транслокацию PFAA влияет их биодоступность в почве, поэтому нелегко оценить транслокационную способность целевых PFAA в растениях. Кроме того, гидропонные эксперименты, как правило, ограничены несколькими факторами, что затрудняет приобретение съедобных тканей растений. Как правило, флоэму собирали непосредственно с растений для наблюдения за транслокацией органических соединений на большие расстояния в растениях, тогда как из саженцев растений трудно приобрести флоэмы15. Следовательно, был введен простой и эффективный метод, метод расщепления корней, для изучения транслокации PFAA в растениях во время относительно краткосрочного воздействия. Что касается расщепленного корневого исследования, то корни в одном саженце растения разделены на две части; одну часть помещают в питательный раствор, содержащий целевые PFAA (трубка A), а другую помещают в питательный раствор в отсутствие PFAA (трубка B). После воздействия в течение нескольких дней PFAA в пробирке B измеряются с помощью LC-MS/MS. Концентрация PFAA в трубке B раскрывает транслокационный потенциал PFAA через флоэму внутри растений 16,17,18.

Сообщалось об эксперименте с расщепленным корнем для изучения транслокации на большие расстояния многих соединений в растениях, таких как наночастицы CuO17, стероидные эстрогены18 и сложные эфиры фосфорорганических соединений16. Эти исследования предоставили доказательства того, что эти соединения могут передаваться через флоэму в съедобные части растений. Однако необходимо дополнительно изучить вопрос о том, могут ли PFAA способствовать транслокации растений и влиянию свойств соединений. Основываясь на этих отчетах, в настоящем исследовании был проведен эксперимент с расщепленным корнем, чтобы выявить перенос PFAA в пшенице на большие расстояния.

протокол

Семена пшеницы, Triticum aestivum L., были закуплены (см. Таблицу материалов) и использованы для настоящего исследования.

1. Прорастание рассады пшеницы и гидропонная культура

  1. Выберите семена пшеницы аналогичного размера и продезинфицируйте их в течение 15 мин 8% (мас./мас.) раствором перекиси водорода.
  2. Тщательно промойте продезинфицированные семена деионизированной водой, а затем поместите их на влажную фильтровальную бумагу в темноте комнатной температуры, чтобы они проросли в течение 5 дней.
  3. Отбирают примерно девять проросших саженцев одинакового размера и переносят их в пластиковые стаканы с 250 мл питательного раствора (1/4 прочности раствора Хоугланда; его химический состав показан в таблице 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из девяти семян три были отобраны для заготовки, ПФОК и ПФОС, соответственно.
  4. Культивируют рассаду в камеры роста в течение 7 дней перед воздействием с циклом 14 ч при 22 °C и 10 ч при 27 °C.

2. Эксперимент по расщеплению корней

  1. Проводят выращивание рассады в двух центрифужных трубках по 50 мл (А и В).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В центрифужной трубке А присутствовало 50 мл стерильного раствора Хоагланда силой 1/4, и такое же количество питательного раствора присутствовало в центрифужной трубке В.
    1. Растворить коммерческие ПФОК и ПФОС (см. Таблицу материалов) в метаноле и разбавить их стерильным питательным раствором в качестве исходного раствора. Затем добавить исходный раствор в пробирку В при концентрации ПФОК/ПФОС 100 мкг/л.
    2. Выполняйте обработку в трех экземплярах с помощью пустого контроля для мониторинга фонового загрязнения. Принципиальная схема экспериментов с разделенным корнем экспозиции показана на рисунке 1.
  2. Разделите целые корни саженца пшеницы пинцетом на две равные части так, чтобы корни все равно были привязаны к тому же побегу и аккуратно вставьте их в трубки А и В соответственно.
  3. Запечатайте две трубки алюминиевой фольгой и культивируйте их в инкубаторе в течение 7 дней. Поддерживать те же условия инкубации, которые указаны на этапе 1.4.
  4. Соберите рассаду пшеницы после 7 дней посева и разделите пшеницу на три части: побеги и корни, культивируемые в шипованном растворе PFAA и невыжатом растворе соответственно, используя стерилизованные ножницы.
  5. Сублимационная сушка образцов растений в лиофилизаторе при −55 °C в течение 48 ч.
  6. Гомогенизируйте и взвесьте образцы корней и побегов. Соберите образцы шипованного и несыпанного раствора.

3. Извлечение ПФОК и ПФОС из растительных тканей

  1. Добавьте 2 мл буфера карбоната натрия (0,25 моль/л), 1 мл сероводорода тетрабутиламмония (0,5 моль/л) и 5 мл метил-трет-бутилового эфира (см. Таблицу материалов) в полипропиленовую трубку объемом 15 мл, включая гомогенизированный корень или побег.
  2. Встряхните трубку при 250 об/мин в течение 20 мин и центрифугу при 2000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре для получения надосадочной органической фазы. Выполните процесс извлечения дважды.
  3. Смешайте собранные экстракты, испарите до сухости в мягком потоке азота (N2), а затем восстановите 5 мл метанола и вращайте их, поддерживая ту же скорость в течение примерно 30 с.
  4. Кондиционируйте картридж с пестицидом (см. Таблицу материалов) 5 мл 0,1% NH4OH в метаноле, 5 мл воды и 5 мл метанола.
  5. Добавьте 5 мл экстрагированного раствора метанола через картридж пестикарба (500 мг/6 мл) для удаления пигмента, элюируйте картридж 5 мл метанола и соберите в те же пробирки.
  6. Испаряют собранные 10 мл раствора метанола почти до сухости и восстанавливают с 200 мкл метанола с последующим вихрем и центрифугированием при 10 000 х г в течение 20 мин при комнатной температуре.

4. Пробоподготовка из питательного раствора

  1. Состояние с 5 мл метанола и 5 мл воды для активации картриджа экстракции полярно-усиленного полимера (PEP) (60 мг/г, 3 мл) (см. Таблицу материалов).
  2. Добавьте 1 мл шипованного раствора или 50 мл образцов несыпанного раствора (этап 2.6) через картридж, соответственно.
  3. Элюируют целевые PFAA 10 мл метанола, выпаривают экстракт с мягкимN2, а затем восстанавливают 200 мкл метанола для анализа.

5. Инструментальный анализ

  1. Использовать сверхэффективную жидкостную хроматографию UPLC в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) для количественной оценки целевых PFAA в многореакционном режиме (MRM) и отрицательной электрораспылительной ионизации (ESI-) (см. Таблицу материалов).
  2. Впрыскивайте 10 мкл образцов и отделяйте целевые PFAA с помощью жидкой хроматографической колонки C18 (1,7 мкм, 2,1 мм x 50 мм, см. Таблицу материалов) и используйте 2 мМ ацетата аммония в воде (фаза A) и метанол (фаза B) в качестве подвижной фазы для UPLC со скоростью потока 0,3 мл / мин. Поддерживайте температуру колонны на уровне 50 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ионные переходы ПФОК и ПФОС составляют соответственно 413-369 и 499-80. Программа градиентного элюирования и инструментальные параметры LC-MS/MS для количественной оценки целевых PFAA перечислены в таблице 2.
  3. Обработка данных с помощью программного обеспечения для анализа данных (см. Таблицу материалов).

Результаты

Эксперимент с расщепленным корнем исследовал перенос PFAA в пшенице на большие расстояния. Как показано на рисунке 2А,С, как ПФОК, так и ПФОС могут быть поглощены корнем пшеницы и перенесены в побег. ПФОС и ПФОК не были обнаружены в корне пшеницы и растворе в пробир...

Обсуждение

Чтобы обеспечить точность этого метода, необходимо провести тщательную операцию, чтобы убедиться, что шипованный раствор в трубке В не загрязняет невыжатый раствор в трубке А. Данная концентрация целевых PFAA в настоящем исследовании была относительно выше, чем их концентрация в реальн?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы с благодарностью выражаем финансовую поддержку со стороны Фонда естественных наук Китая (NSFC 21737003), Научного фонда китайских университетов (No 2452021103) и Китайского научного фонда постдокторантуры (No 2021M692651, 2021M702680).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ACQUITY UPLC BEH C18 columnWaters, Milford, MALiquid chromatographic column
Cleanert PEP cartridgeBonna- Angel Technologies, ChinaSolid phase extraction column
Clearnert Pesticarb cartridgeBonna- Angel Technologies, ChinaSolid phase extraction column
LC-MS/MS(Waters Acquity UPLC i-Class Coupled to Xevo TQ-S)Waters, Milford, MALiquid chromatography and mass spectrometry
Lyophilizer Boyikang Instrument Ltd., Beijing, ChinaFD-1A50Freeze-dried sample
MasslynxWaters, Milford, MAdata analysis software
Methyl tert-butyl etherSigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)use for extracting target compounds from plant tissues
MPFAC-MXAWellington Laboratories (Ontario, Canada)PFACMXA0518the internal standards
PFAC-MXBWellington Laboratories (Ontario, Canada)PFACMXB0219mixture of PFAA calibration standards
PFOASigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)335-67-1a represent PFAAs
PFOSSigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)2795-39-3a represent PFAAs
Sodium carbonate bufferSigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)use for extracting target compounds from plant tissues
Tetrabutylammonium hydrogen sulfateSigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)use for extracting target compounds from plant tissues
Wheat seedsChinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing,China) Triticum aestivum L.

Ссылки

  1. Lindstrom, A. B., Strynar, M. J., Libelo, E. L. Polyfluorinated compounds: Past, present, and future. Environmental Science & Technology. 45 (19), 7954-7961 (2011).
  2. Kannan, K. Perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substances: Current and future perspectives. Environmental Chemistry. 8 (4), 333-338 (2011).
  3. Cui, Q., et al. Occurrence and tissue distribution of novel perfluoroether carboxylic and sulfonic acids and legacy per/polyfluoroalkyl substances in black-spotted frog (Pelophylax nigromaculatus). Environmental Science & Technology. 52 (3), 982-990 (2018).
  4. Negri, E., et al. Exposure to PFOA and PFOS and fetal growth: a critical merging of toxicological and epidemiological data. Critical Reviews in Toxicology. 47 (6), 489-515 (2017).
  5. Chi, Q., Li, Z., Huang, J., Ma, J., Wang, X. Interactions of perfluorooctanoic acid and perfluorooctanesulfonic acid with serum albumins by native mass spectrometry, fluorescence and molecular docking. Chemosphere. 198, 442-449 (2018).
  6. Zhang, X., Chen, L., Fei, X. C., Ma, Y. S., Gao, H. W. Binding of PFOS to serum albumin and DNA: insight into the molecular toxicity of perfluorochemicals. Bmc Molecular Biology. 10, 16 (2009).
  7. Pan, Y. T., et al. Worldwide distribution of novel perfluoroether carboxylic and sulfonic acids in surface water. Environmental Science & Technology. 52 (14), 7621-7629 (2018).
  8. Knight, E. R., et al. An investigation into the long-term binding and uptake of PFOS, PFOA and PFHxS in soil - plant systems. Journal of Hazardous Materials. 404, 124065 (2021).
  9. Liu, Z. Y., et al. Crop bioaccumulation and human exposure of perfluoroalkyl acids through multi-media transport from a mega fluorochemical industrial park, China. Environment International. 106, 37-47 (2017).
  10. Mei, W. P., et al. Per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) in the soil-plant system: Sorption, root uptake, and translocation. Environment International. 156, 106642 (2021).
  11. Wang, W., Rhodes, G., Ge, J., Yu, X., Li, H. Uptake and accumulation of per- and polyfluoroalkyl substances in plants. Chemosphere. 261, 127584 (2020).
  12. Lu, J., Wu, J., Stoffella, P. J., Wilson, P. C. Analysis of bisphenol A, nonylphenol, and natural estrogens in vegetables and fruits using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (1), 84-89 (2013).
  13. Herschbach, C., Gessler, A., Rennenberg, H., Luttge, U., Beyschlag, W., Budel, B., Francis, D. Long Distance Transport and Plant Internal Cycling of N- and S-Compounds. Progress in Botany 73. , 161-188 (2012).
  14. Liu, Q., et al. Uptake kinetics, accumulation, and long-distance transport of organophosphate esters in plants: Impacts of chemical and plant properties. Environmental Science & Technology. 53 (9), 4940-4947 (2019).
  15. Wang, Z. Y., et al. Xylem- and phloem-based transport of CuO nanoparticles in maize (Zea mays L.). Environmental Science & Technology. 46 (8), 4434-4441 (2012).
  16. Chen, X., et al. Uptake, accumulation, and translocation mechanisms of steroid estrogens in plants. Science of the Total Environment. 753, 141979 (2021).
  17. Felizeter, S., McLachlan, M. S., de Voogt, P. Uptake of perfluorinated alkyl acids by hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa). Environmental Science & Technology. 46 (21), 11735-11743 (2012).
  18. Zhou, J., et al. Insights into uptake, translocation, and transformation mechanisms of perfluorophosphinates and perfluorophosphonates in wheat (Triticum aestivum L.). Environmental Science & Technology. 54 (1), 276-285 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены