Studio del trasporto a lunga distanza di acidi perfluoroalchilici nel grano mediante una tecnica di esposizione a radice divisa

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un metodo semplice ed efficace per il trasporto a lunga distanza degli acidi perfluoroalchilici nel grano.

Abstract

Grandi quantità di acidi perfluoroalchilici (PFAA) sono stati introdotti nel suolo e accumulati dalle piante, ponendo potenziali rischi per la salute umana. È imperativo studiare l'accumulo e la traslocazione di PFAA all'interno delle piante. Il trasporto a lunga distanza è un percorso importante per i PFAA trasferiti dalle foglie della pianta ai tessuti commestibili attraverso il floema. Tuttavia, in precedenza era difficile valutare il potenziale di traslocazione della contaminazione organica in un periodo di esposizione a breve termine. L'esperimento a radice divisa fornisce una soluzione per scoprire efficacemente la traslocazione a lunga distanza di PFAA utilizzando un esperimento idroponico, che, in questo studio, è stato condotto in due provette da centrifuga da 50 ml (A e B), di cui la provetta A della centrifuga aveva 50 ml di soluzione nutritiva sterile Hoagland a un quarto di resistenza, mentre la provetta della centrifuga B aveva la stessa quantità di concentrazione di nutrienti, e i PFAA bersaglio (acido perfluorottano solfonico, PFOS e acido perfluorottano, PFOA) aggiunti a una data concentrazione. Una radice di grano integrale è stata separata manualmente in due parti e inserita con cura nei tubi A e B. La concentrazione di PFAA nelle radici, nei germogli di grano e nelle soluzioni nei tubi A e B sono stati valutati utilizzando rispettivamente LC-MS / MS, dopo essere stati coltivati in un'incubatrice per 7 giorni e raccolti. I risultati hanno suggerito che PFOA e PFOS sperimentano un simile processo di trasporto a lunga distanza attraverso il floema dal germoglio alla radice e potrebbero essere rilasciati nell'ambiente ambientale. Pertanto, la tecnica split-root può essere utilizzata per valutare il trasporto a lunga distanza di diverse sostanze chimiche.

Introduzione

Gli acidi perfluoroalchilici (PFAA) sono ampiamente utilizzati in vari prodotti commerciali e industriali grazie alle loro eccellenti proprietà fisico-chimiche, tra cui l'attività superficiale e la stabilità termica e chimica ^1,2,3. L'acido perfluorottano solfonico (PFOS) e l'acido perfluorottano (PFOA) sono i due PFAA più importanti utilizzati in tutto il mondo ^4,5,6, sebbene questi composti siano stati elencati nella Convenzione internazionale di Stoccolma rispettivamente ^7,8 nel 2009 e nel 2019. A causa della loro persistenza e dell'uso diffuso, PFOS e PFOA sono stati ampiamente rilevati in varie matrici ambientali. Le concentrazioni di PFOA e PFOS nelle acque superficiali di diversi fiumi e laghi mondiali sono rispettivamente 0,15-52,8 ng / L e 0,09-29,7 ng / L,⁹. A causa dell'uso di acque sotterranee o di acque depurate per l'irrigazione e anche utilizzando biosolidi come fertilizzanti, PFOA e PFOS sono ampiamente presenti nel terreno, compresi tra 0,01-123 μg / kg e 0,003-162 μg / kg, rispettivamente¹⁰, che potrebbero introdurre una grande quantità di PFAA nelle piante e comportare potenziali rischi per la salute umana. Le concentrazioni di PFAA (C4-C8) nel suolo agricolo e nei cereali (grano e mais) mostrano una correlazione lineare positiva¹¹. Pertanto, è imperativo studiare l'accumulo e la traslocazione di PFAA all'interno delle piante.

La traslocazione dei PFAA nelle piante avviene in primo luogo dalle radici ai tessuti fuori terra, e la traslocazione dei PFAA dalle radici ai tessuti commestibili è considerata come trasporto a lunga distanza^12,13. Studi precedenti hanno rilevato bisfenolo A, nonilfenolo ed estrogeni naturali in frutta e verdura¹⁴, il che implica che queste sostanze chimiche potrebbero migrare attraverso il floema. Pertanto, scoprire la traslocazione di PFAA nelle piante è importante per valutare il loro potenziale rischio. Tuttavia, l'accumulo e la traslocazione dei PFAA sono influenzati dalla loro biodisponibilità nel suolo, quindi non è facile valutare la capacità di traslocazione dei PFAA bersaglio nelle piante. Inoltre, gli esperimenti idroponici sono generalmente limitati da diversi fattori, rendendo più difficile acquisire i tessuti commestibili delle piante. Tipicamente, il floema è stato raccolto direttamente dalle piante per osservare la traslocazione di composti organici attraverso lunghe distanze nelle piante, mentre è difficile acquisire floemi da piantine di piante¹⁵. Quindi, è stato introdotto un metodo semplice ed efficace, la tecnica della radice divisa, per studiare la traslocazione di PFAA nelle piante durante un'esposizione relativamente a breve termine. Per quanto riguarda l'indagine a radice divisa, le radici in una piantina di piante sono separate in due parti; una parte viene inserita nella soluzione nutritiva contenente PFAA bersaglio (tubo A) e l'altra viene posta nella soluzione nutritiva in assenza di PFAA (tubo B). Dopo esposizione per diversi giorni, i PFAA nel tubo B vengono misurati mediante LC-MS/MS. La concentrazione di PFAA nel tubo B rivela il potenziale di traslocazione dei PFAA attraverso il floema all'interno delle piante^16,17,18.

L'esperimento split-root è stato riportato per studiare la traslocazione a lunga distanza di molti composti nelle piante, come le nanoparticelle CuO¹⁷, gli estrogeni steroidei 18 e gli esteri organofosfati¹⁶. Questi studi hanno fornito la prova che questi composti potrebbero trasferirsi attraverso il floema alle parti commestibili delle piante. Tuttavia, è necessario esplorare ulteriormente se i PFAA possano aiutare nella traslocazione nelle piante e l'impatto delle proprietà dei composti. Sulla base di questi rapporti, l'esperimento split-root è stato condotto nel presente studio per rivelare il trasporto a lunga distanza di PFAA nel grano.

Protocollo

I semi di grano, Triticum aestivum L., sono stati acquistati (vedi tabella dei materiali) e utilizzati per il presente studio.

1. Germinazione della piantina di grano e coltura idroponica

1. Selezionare semi di grano di dimensioni simili e disinfettarli per 15 minuti con una soluzione di perossido di idrogeno all'8% (p/p).
2. Risciacquare accuratamente i semi disinfettati con acqua deionizzata, quindi metterli su carta da filtro umida al buio a temperatura ambiente per germinare per 5 giorni.
3. Selezionare circa nove piantine germinate di dimensioni uniformi e trasferirle in bicchieri di plastica con 250 ml di soluzione nutritiva (1/4 di forza della soluzione di Hoagland; la sua composizione chimica è mostrata nella Tabella 1).
   NOTA: Dei nove semi, tre ciascuno è stato selezionato rispettivamente per il bianco, PFOA e PFOS.
4. Coltivare le piantine in camere di crescita per 7 giorni prima dell'esposizione con un ciclo di 14 h a 22 °C e 10 h a 27 °C.

2. L'esperimento di scissione delle radici

1. Effettuare la coltivazione della piantina in due provette da centrifuga da 50 ml (A e B).
   NOTA: Nel tubo della centrifuga A, erano presenti 50 ml di soluzione sterile di Hoagland a dosaggio 1/4 e la stessa quantità di soluzione nutritiva era presente nella provetta B della centrifuga.
   1. Sciogliere il PFOA e il PFOS commerciali (vedi Tabella dei materiali) in metanolo e diluirli con la soluzione nutritiva sterile come soluzione madre. Quindi, aggiungere la soluzione madre al tubo B ad una concentrazione di PFOA/PFOS di 100 μg/L.
   2. Eseguire i trattamenti in triplice copia con un controllo in bianco per monitorare la contaminazione di fondo. Un diagramma schematico degli esperimenti di esposizione a radice divisa è mostrato nella Figura 1.
2. Separare le radici intere della piantina di grano usando una pinzetta in due parti uguali in modo che le radici siano ancora agganciate allo stesso germoglio e inserirle con cura nei tubi A e B, rispettivamente.
3. Sigillare i due tubi con un foglio di alluminio e coltivarli in un'incubatrice per 7 giorni. Mantenere le stesse condizioni di incubazione indicate al punto 1.4.
4. Raccogliere le piantine di grano dopo 7 giorni di coltura e separare il grano in tre parti: germogli e radici coltivati nella soluzione a spillo di PFAA e soluzione senza punte, rispettivamente, usando forbici sterilizzate.
5. Liofilizzare i campioni di piante in un liofilizzatore a -55 °C per 48 ore.
6. Omogeneizzare e pesare la radice e sparare campioni. Raccogliere i campioni di soluzione con e senza spiked.

3. Estrazione di PFOA e PFOS da tessuti vegetali

1. Aggiungere 2 mL di tampone carbonato di sodio (0,25 mol/L), 1 mL di idrogeno solfato di tetrabutilammonio (0,5 mol/L) e 5 mL di metil terz-butil etere (vedi Tabella dei materiali) in un tubo di polipropilene da 15 ml, compresa la radice omogeneizzata o il germoglio.
2. Agitare il tubo a 250 giri / min per 20 minuti e centrifugare a 2.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente per ottenere la fase organica surnatante . Eseguire il processo di estrazione due volte.
3. Mescolare gli estratti raccolti, vaporizzare fino all'essiccazione in un delicato flusso di azoto (N₂), quindi ricostituirli con 5 ml di metanolo e vorticciarli, mantenendo la stessa velocità per circa 30 s.
4. Condizionare la cartuccia pesticarb (vedere Tabella dei materiali) con 5 mL di NH₄OH allo 0,1% in metanolo, 5 mL di acqua e 5 mL di metanolo.
5. Aggiungere i 5 mL di soluzione di metanolo estratto attraverso la cartuccia pesticarb (500 mg/6 mL) per rimuovere il pigmento, eluire la cartuccia con 5 mL di metanolo e raccogliere nelle stesse provette.
6. Evaporare i 10 ml di soluzione di metanolo raccolti fino quasi all'essiccazione e ricostituire con 200 μL di metanolo, seguiti da vortice e centrifugazione a 10.000 x g per 20 minuti a temperatura ambiente.

4. Preparazione del campione dalla soluzione nutritiva

1. Condizionare con 5 mL di metanolo e 5 mL di acqua per attivare la cartuccia di estrazione del polimero potenziato polare (PEP) (60 mg/g, 3 ml) (vedere Tabella dei materiali).
2. Aggiungere 1 mL della soluzione a spillo o 50 mL dei campioni di soluzione senza spiked (punto 2.6) attraverso la cartuccia, rispettivamente.
3. Eluire i PFAA bersaglio con 10 ml di metanolo, far evaporare l'estratto con N₂ delicato e quindi ricostituire con 200 μL di metanolo per l'analisi.

5. Analisi strumentale

1. Utilizzare una cromatografia liquida ad alte prestazioni UPLC accoppiata con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per la quantificazione dei PFAA target in modalità multi-reazione (MRM) e ionizzazione elettrospray negativa (ESI-) (vedi Tabella dei materiali).
2. Iniettare 10 μL di campioni e separare i PFAA target utilizzando una colonna cromatografica liquida C18 (1,7 μm, 2,1 mm x 50 mm, vedere Tabella dei materiali) e utilizzare 2 mM di acetato di ammonio in acqua (fase A) e metanolo (fase B) come fase mobile per UPLC, con una portata di 0,3 mL/min. Mantenere la temperatura della colonna a 50 °C.
   NOTA: Le transizioni ioniche di PFOA e PFOS sono rispettivamente da 413 a 369 e da 499 a 80. Il programma di eluizione del gradiente e i parametri strumentali LC-MS/MS per la quantificazione dei PFAA target sono elencati nella Tabella 2.
3. Elaborare i dati con il software di analisi dei dati (vedi Tabella dei materiali).

Risultati

L'esperimento split-root ha studiato il trasporto a lunga distanza di PFAA nel grano. Come mostrato nella figura 2A,C, sia il PFOA che il PFOS potrebbero essere assorbiti dalla radice di grano e trasferiti al germoglio. PFOS e PFOA non sono stati rilevati nella radice di grano e nella soluzione nel tubo A del controllo in bianco. È stato riscontrato che PFOS e PFOA sono stati rilevati nelle radici di grano coltivate nella soluzione senza punte, con una concentrazione di 0,2...

Discussione

Per garantire l'accuratezza di questo metodo, è necessario operare con attenzione per garantire che la soluzione a spillo nel tubo B non contamini la soluzione non chiodata nel tubo A. La concentrazione data di PFAA target nel presente studio era relativamente superiore alla loro concentrazione nell'ambiente reale, garantendo di monitorare i PFAA target nel grano e nella soluzione senza punte utilizzando LC-MS/MS.

Ci sono limitazioni a questo metodo. Poiché in ciascun gruppo di trattamento ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACQUITY UPLC BEH C18 column	Waters, Milford, MA		Liquid chromatographic column
Cleanert PEP cartridge	Bonna- Angel Technologies, China		Solid phase extraction column
Clearnert Pesticarb cartridge	Bonna- Angel Technologies, China		Solid phase extraction column
LC-MS/MS(Waters Acquity UPLC i-Class Coupled to Xevo TQ-S)	Waters, Milford, MA		Liquid chromatography and mass spectrometry
Lyophilizer	Boyikang Instrument Ltd., Beijing, China	FD-1A50	Freeze-dried sample
Masslynx	Waters, Milford, MA		data analysis software
Methyl tert-butyl ether	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)		use for extracting target compounds from plant tissues
MPFAC-MXA	Wellington Laboratories (Ontario, Canada)	PFACMXA0518	the internal standards
PFAC-MXB	Wellington Laboratories (Ontario, Canada)	PFACMXB0219	mixture of PFAA calibration standards
PFOA	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)	335-67-1	a represent PFAAs
PFOS	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)	2795-39-3	a represent PFAAs
Sodium carbonate buffer	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)		use for extracting target compounds from plant tissues
Tetrabutylammonium hydrogen sulfate	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)		use for extracting target compounds from plant tissues
Wheat seeds	Chinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing,China)		Triticum aestivum L.