분할 뿌리 노출 기술을 통한 밀에서 과불화알킬산의 장거리 운송 조사

요약

본 프로토콜은 밀에서 퍼플루오로알킬산의 장거리 수송을 위한 간단하고 효율적인 방법을 기술한다.

초록

다량의 과불화알킬산(PFAA)이 토양에 유입되어 식물에 축적되어 인체 건강에 잠재적인 위험을 초래합니다. 식물 내에서 PFAA의 축적과 전좌를 조사하는 것이 필수적입니다. 장거리 수송은 체관부를 통해 식물 잎에서 식용 조직으로 전달되는 PFAA의 중요한 경로입니다. 그러나 이전에는 단기 노출 기간에 유기 오염의 전좌 가능성을 평가하기가 어려웠습니다. 분할 루트 실험은 수경 실험을 사용하여 PFAA의 장거리 전좌를 효과적으로 밝혀내는 솔루션을 제공하며, 이 연구에서는 두 개의 50mL 원심분리 튜브(A 및 B)에서 수행되었으며, 그 중 원심분리 튜브 A는 50mL의 1/4 강도의 Hoagland 멸균 영양 용액을 갖는 반면 원심분리기 튜브 B는 동일한 양의 영양소 농도를 가졌습니다. 및 표적 PFAA (퍼플루오로옥탄 술폰산, PFOS, 및 퍼플루오로옥탄산, PFOA)를 주어진 농도로 첨가하였다. 통밀 뿌리를 수동으로 두 부분으로 분리하고 튜브 A와 B에 조심스럽게 삽입했습니다. 뿌리, 밀의 싹 및 튜브 A와 B의 용액에 있는 PFAA의 농도는 각각 LC-MS/MS를 사용하여 7일 동안 배양하고 수확한 후 평가되었습니다. 결과는 PFOA와 PFOS가 체관부를 통해 싹에서 뿌리까지 유사한 장거리 수송 과정을 경험하고 주변 환경으로 방출될 수 있음을 시사했습니다. 따라서 분할 루트 기술을 사용하여 다양한 화학 물질의 장거리 운송을 평가할 수 있습니다.

서문

퍼플루오로알킬산(PFAA)은 표면 활성과 열적 및 화학적 안정성 ^1,2,3을 포함한 우수한 물리화학적 특성으로 인해 다양한 상업 및 산업 제품에 널리 사용됩니다. 퍼플루오로옥탄 설폰산(PFOS)과 퍼플루오로옥탄산(PFOA)은 전 세계적으로 사용되는 가장 중요한 두 가지 PFAA ^4,5,6이지만 이러한 화합물은 각각 2009년과 2019년 국제 스톡홀름 협약 ^7,8에 등재되었습니다. PFOS와 PFOA는 지속성과 광범위한 사용으로 인해 다양한 환경 매트릭스에서 널리 검출되었습니다. 전 세계적으로 다른 강과 호수의 지표수에서 PFOA 및 PFOS의 농도는 각각 0.15-52.8 ng / L 및 0.09-29.7 ng / L입니다⁹. 관개를 위해 지하수 또는 재생 수를 사용하고 바이오 솔리드를 비료로 사용하기 때문에 PFOA 및 PFOS는 각각 0.01-123 μg / kg 및 0.003-162 μg / kg 범위의 토양에 널리 존재합니다¹⁰, 식물에 많은 양의 PFAA를 도입하고 인체 건강에 잠재적 인 위험을 초래할 수 있습니다. 농업 토양과 곡물 (밀과 옥수수)의 PFAA (C4-C8) 농도는 양의 선형 상관 관계를 보여줍니다¹¹. 따라서 식물 내에서 PFAA의 축적 및 전좌를 조사하는 것이 필수적입니다.

식물에서 PFAA의 전좌는 먼저 뿌리에서 지상 조직으로 발생하며, 뿌리에서 식용 조직으로의 PFAA의 전좌는 장거리 수송으로 간주됩니다^12,13. 이전 연구에서는 야채와 과일에서 비스페놀 A, 노닐페놀 및 천연 에스트로겐을 검출했습니다.¹⁴, 이는 이러한 화학 물질이 체관부를 통해 이동할 수 있음을 의미합니다. 따라서 식물에서 PFAA의 전좌를 밝히는 것은 잠재적 위험을 평가하는 데 중요합니다. 그러나 PFAA의 축적 및 전좌는 토양에서의 생체 이용률에 영향을 받기 때문에 식물에서 표적 PFAA의 전좌 능력을 평가하는 것은 쉽지 않습니다. 또한 수경 실험은 일반적으로 여러 요인에 의해 제한되므로 식물의 식용 조직을 얻기가 더 어렵습니다. 전형적으로, 체관부는 식물에서 장거리를 통한 유기 화합물의 전좌를 관찰하기 위해 식물로부터 직접 수집되었지만, 식물 묘목¹⁵에서 체관부를 획득하는 것은 어렵다. 따라서 비교적 단기간에 노출되는 동안 식물에서 PFAA의 전좌를 연구하기 위해 간단하고 효과적인 방법인 분할 루트 기술이 도입되었습니다. 분할 뿌리 조사에 관해서는, 한 식물 묘목의 뿌리는 두 부분으로 분리됩니다. 한 부분은 표적 PFAA가 들어있는 영양 용액 (튜브 A)에 넣고 다른 부분은 PFAA가없는 영양 용액 (튜브 B)에 넣습니다. 며칠 동안 노출 된 후 튜브 B의 PFAA는 LC-MS / MS로 측정됩니다. 튜브 B 내의 PFAA의 농도는 식물^16,17,18 내의 체관부를 통한 PFAA의 전좌 전위를 개시한다.

분할 뿌리 실험은 CuO 나노 입자¹⁷, 스테로이드 에스트로겐¹⁸ 및 유기 인산 에스테르¹⁶과 같은 식물에서 많은 화합물의 장거리 전좌를 연구하기 위해보고되었습니다. 이 연구는 이러한 화합물이 체관부를 통해 식물의 식용 부분으로 이동할 수 있다는 증거를 제공했습니다. 그러나 PFAA가 식물의 전좌에 도움이 될 수 있는지 여부와 화합물 특성의 영향에 대해 더 자세히 조사해야 합니다. 이러한 보고를 바탕으로 본 연구에서는 밀에서 PFAA의 장거리 수송을 공개하기 위해 뿌리 분할 실험을 수행했습니다.

프로토콜

밀 종자 인 Triticum aestivum L.을 조달하여 ( 재료 표 참조) 본 연구에 사용했습니다.

1. 밀 묘목 발아 및 수경 재배

1. 비슷한 크기의 밀 씨앗을 선택하고 15 % (w / w) 과산화수소 용액으로 8 분 동안 소독하십시오.
2. 소독 된 씨앗을 탈 이온수로 철저히 헹구고 실온의 어두운 곳에서 습한 여과지에 올려 5 일 동안 발아시킵니다.
3. 균일 한 크기의 발아 된 약 9 개의 묘목을 선택하고 250mL의 영양 용액 (Hoagland 용액의 1/4 강도, 화학 성분은 표 1에 표시됨)이있는 플라스틱 비커로 옮깁니다.
   참고: 9개의 시드 중 각각 3개의 시드가 블랭크, PFOA 및 PFOS에 대해 선택되었습니다.
4. 노출 전 7 일 동안 성장 챔버에서 묘목을 22 ° C에서 14 시간, 27 ° C에서 10 시간 주기로 재배합니다.

2. 루트 분할 실험

1. 두 개의 50mL 원심 분리 튜브 (A 및 B)에서 묘목 재배를 수행합니다.
   참고: 원심분리 튜브 A에는 50mL의 멸균 1/4 강도 Hoagland 용액이 존재했으며 원심분리 튜브 B에는 동일한 양의 영양 용액이 존재했습니다.
   1. 상업용 PFOA와 PFOS( 재료 표 참조)를 메탄올에 녹이고 멸균 영양 용액을 원액으로 희석합니다. 그런 다음 원액을 100μg/L의 PFOA/PFOS 농도로 튜브 B에 추가합니다.
   2. 배경 오염을 모니터링하기 위해 빈 컨트롤로 삼중 처리를 수행하십시오. 분할 루트 노출 실험의 개략도가 그림 1에 나와 있습니다.
2. 핀셋을 사용하여 밀 묘목의 전체 뿌리를 두 개의 동일한 부분으로 분리하여 뿌리가 여전히 같은 싹에 연결되도록하고 조심스럽게 튜브 A와 B에 각각 삽입하십시오.
3. 두 개의 튜브를 알루미늄 호일로 밀봉하고 인큐베이터에서 7 일 동안 배양하십시오. 단계 1.4에 명시된 것과 동일한 배양 조건을 유지하십시오.
4. 배양 7 일 후에 밀 묘목을 수집하고 멸균 된 가위를 사용하여 PFAA의 스파이크 용액과 스파이크되지 않은 용액에서 각각 배양 된 싹과 뿌리의 세 부분으로 밀을 분리합니다.
5. 식물 샘플을 동결건조기에서 -55°C에서 48시간 동안 동결건조합니다.
6. 균질화하고 뿌리를 측정하고 샘플을 쏘십시오. 스파이크된 용액 샘플과 스파이크되지 않은 용액 샘플을 수집합니다.

3. 식물 조직에서 PFOA 및 PFOS 추출

1. 2mL의 탄산나트륨 완충액(0.25mol/L), 1mL의 테트라부틸암모늄 황산수소염(0.5mol/L) 및 5mL의 메틸 tert-부틸 에테르( 재료 표 참조)를 균질화된 뿌리 또는 싹을 포함하여 15mL 폴리프로필렌 튜브에 추가합니다.
2. 튜브를 250rpm으로 20분 동안 흔들고 실온에서 10분 동안 2,000 x g 로 원심분리하여 상청액 유기상을 얻습니다. 추출 과정을 두 번 수행하십시오.
3. 수집 된 추출물을 혼합하고 부드러운 질소 (N₂) 스트림에서 건조하도록 기화 한 다음 5mL의 메탄올로 재구성하고 약 30 초 동안 동일한 속도를 유지하면서 와동시킵니다.
4. 페스티카브 카트리지( 재료 표 참조)를 메탄올 중 0.1% NH_4OH5mL, 물 5mL, 메탄올 5mL로 컨디셔닝합니다.
5. 페스티카브 카트리지(500mg/6mL)를 통해 추출 메탄올 용액 5mL를 추가하여 안료를 제거하고 5mL의 메탄올로 카트리지를 용리한 다음 동일한 튜브에 수집합니다.
6. 수집된 메탄올 용액 10mL를 증발시켜 거의 건조시키고 메탄올 200μL로 재구성한 후 실온에서 20분 동안 10,000 x g 에서 볼텍싱 및 원심분리합니다.

4. 영양 용액에서 샘플 준비

1. 극성 강화 폴리머(PEP) 추출 카트리지(60mg/g, 3mL)를 활성화하기 위해 메탄올 5mL와 물 5mL로 조건화합니다( 재료 표 참조).
2. 각각 1mL의 스파이크 용액 또는 50mL의 스파이크되지 않은 용액 샘플 (2.6 단계)을 카트리지를 통해 추가합니다.
3. 표적 PFAA를 메탄올 10mL로 용리하고 부드러운_N2로 추출물을 증발시킨 다음 분석을 위해 메탄올 200μL로 재구성합니다.

5. 기기 분석

1. 다중 반응 모드(MRM) 및 음성 전기 분무 이온화(ESI-)에서 표적 PFAA를 정량화하기 위해 탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피 UPLC를 사용합니다( 재료 표 참조).
2. 10μL의 시료를 주입하고 C18 액체 크로마토그래피 컬럼(1.7μm, 2.1mm x 50mm, 재료 표 참조)을 사용하여 표적 PFAA를 분리하고 유속이 0.3mL/min인 UPLC의 이동상으로 물(상 A) 및 메탄올(상 B)에 2mM 암모늄 아세테이트를 사용합니다. 컬럼 온도를 50°C로 유지한다.
   참고: PFOA와 PFOS의 이온 전이는 각각 413에서 369 및 499에서 80입니다. 표적 PFAA의 정량화를 위한 그래디언트 용리 프로그램 및 LC-MS/MS 기기 파라미터는 표 2에 나열되어 있습니다.
3. 데이터 분석 소프트웨어로 데이터를 처리합니다( 재료 표 참조).

결과

분할 뿌리 실험은 밀에서 PFAA의 장거리 수송을 조사했습니다. 그림 2A, C에서 볼 수 있듯이 PFOA와 PFOS는 모두 밀 뿌리에 흡수되어 싹으로 옮겨질 수 있습니다. PFOS 및 PFOA는 블랭크 대조군의 튜브 A에서 밀 뿌리 및 용액에서 검출되지 않았다. PFOS와 PFOA는 스파이크되지 않은 용액에서 배양 된 밀 뿌리에서 검출되었으며, 농도는 각각 0.26 ng / g ± 0.02 ng / g 및 0.64 ng / g ±...

토론

이 방법의 정확성을 보장하려면 튜브 B의 스파이크 용액이 튜브 A의 스파이크되지 않은 용액을 오염시키지 않도록 조심스럽게 작업해야합니다. 본 연구에서 주어진 표적 PFAA 농도는 실제 환경에서의 농도보다 상대적으로 높았으며, LC-MS/MS를 사용하여 밀 및 스파이크되지 않은 용액에서 표적 PFAA를 모니터링할 수 있었습니다.

이 방법에는 제한이 있습니다. 각 처리군에 하나의...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACQUITY UPLC BEH C18 column	Waters, Milford, MA		Liquid chromatographic column
Cleanert PEP cartridge	Bonna- Angel Technologies, China		Solid phase extraction column
Clearnert Pesticarb cartridge	Bonna- Angel Technologies, China		Solid phase extraction column
LC-MS/MS(Waters Acquity UPLC i-Class Coupled to Xevo TQ-S)	Waters, Milford, MA		Liquid chromatography and mass spectrometry
Lyophilizer	Boyikang Instrument Ltd., Beijing, China	FD-1A50	Freeze-dried sample
Masslynx	Waters, Milford, MA		data analysis software
Methyl tert-butyl ether	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)		use for extracting target compounds from plant tissues
MPFAC-MXA	Wellington Laboratories (Ontario, Canada)	PFACMXA0518	the internal standards
PFAC-MXB	Wellington Laboratories (Ontario, Canada)	PFACMXB0219	mixture of PFAA calibration standards
PFOA	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)	335-67-1	a represent PFAAs
PFOS	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)	2795-39-3	a represent PFAAs
Sodium carbonate buffer	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)		use for extracting target compounds from plant tissues
Tetrabutylammonium hydrogen sulfate	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)		use for extracting target compounds from plant tissues
Wheat seeds	Chinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing,China)		Triticum aestivum L.