Untersuchung des Langstreckentransports von Perfluoralkylsäuren in Weizen mittels Split-Root-Expositionstechnik

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einfaches und effizientes Verfahren für den Langstreckentransport von Perfluoralkylsäuren in Weizen.

Zusammenfassung

Große Mengen an Perfluoralkylsäuren (PFAAs) wurden in den Boden eingebracht und von Pflanzen angesammelt, was potenzielle Risiken für die menschliche Gesundheit darstellt. Es ist unerlässlich, die Akkumulation und Translokation von PFAAs innerhalb von Pflanzen zu untersuchen. Der Langstreckentransport ist ein wichtiger Weg für PFAAs, die von den Pflanzenblättern durch das Phloem in das essbare Gewebe übertragen werden. Bisher war es jedoch schwierig, das Translokationspotenzial organischer Kontamination in einer kurzfristigen Expositionszeit abzuschätzen. Das Split-Root-Experiment bietet eine Lösung, um die Translokation von PFAAs über große Entfernungen mit einem hydroponischen Experiment effektiv aufzudecken, das in dieser Studie in zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen (A und B) durchgeführt wurde, von denen Zentrifugenröhrchen A 50 ml sterile Hoagland-Nährlösung mit einer Viertelstärke aufwiesen, während Zentrifugenröhrchen B die gleiche Menge an Nährstoffkonzentration aufwiesen. und die Ziel-PFAAs (Perfluoroctansulfonsäure, PFOS und Perfluoroctansäure, PFOA), die in einer bestimmten Konzentration hinzugefügt wurden. Eine ganze Weizenwurzel wurde manuell in zwei Teile getrennt und vorsichtig in die Röhrchen A und B eingeführt. Die Konzentration von PFAAs in den Wurzeln, Weizentrieben und Lösungen in den Röhrchen A und B wurde mit LC-MS/MS bewertet, nachdem sie 7 Tage lang in einem Inkubator kultiviert und geerntet wurden. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass PFOA und PFOS einen ähnlichen Langstreckentransportprozess durch das Phloem vom Spross bis zur Wurzel erfahren und in die Umgebung freigesetzt werden könnten. So kann die Split-Root-Technik verwendet werden, um den Langstreckentransport verschiedener Chemikalien zu bewerten.

Einleitung

Perfluoralkylsäuren (PFAAs) werden aufgrund ihrer hervorragenden physikalisch-chemischen Eigenschaften, einschließlich Oberflächenaktivität und thermischer und chemischer^{Stabilität 1,2,3,} in verschiedenen kommerziellen und industriellen Produkten häufig verwendet. Perfluoroctansulfonsäure (PFOS) und Perfluoroctansäure (PFOA) sind die beiden wichtigsten weltweit verwendeten PFAAs ^4,5,6, obwohl diese Verbindungen 2009 bzw. 2019 in der internationalen Stockholmer Konvention ^7,8 aufgeführt wurden. Aufgrund ihrer Persistenz und weit verbreiteten Verwendung wurden PFOS und PFOA in verschiedenen Umweltmatrices nachgewiesen. Die Konzentrationen von PFOA und PFOS im Oberflächenwasser verschiedener Flüsse und Seen weltweit betragen 0,15-52,8 ng/L bzw. 0,09-29,7 ng/L⁹. Aufgrund der Verwendung von Grundwasser oder aufbereitetem Wasser für die Bewässerung und auch der Verwendung von Biofeststoffen als Dünger sind PFOA und PFOS im Boden weit verbreitet und liegen zwischen 0,01-123 μg/kg bzw. 0,003-162 μg/kg bzw.¹⁰, was eine große Menge an PFAAs in Pflanzen einbringen und potenzielle Risiken für die menschliche Gesundheit darstellen könnte. Die PFAA-Konzentrationen (C4-C8) in landwirtschaftlichen Böden und Getreide (Weizen und Mais) zeigen eine positive lineare Korrelation¹¹. Daher ist es unerlässlich, die Akkumulation und Translokation von PFAAs innerhalb von Pflanzen zu untersuchen.

Die Translokation von PFAAs in Pflanzen erfolgt zunächst von den Wurzeln zu den oberirdischen Geweben, und die Translokation von PFAAs von den Wurzeln zu den essbaren Geweben wird als Ferntransport angesehen^12,13. Frühere Studien haben Bisphenol A, Nonylphenol und natürliche Östrogene in Gemüse und Obst nachgewiesen¹⁴, was bedeutet, dass diese Chemikalien über das Phloem wandern könnten. Daher ist es wichtig, die Translokation von PFAAs in Pflanzen aufzudecken, um ihr potenzielles Risiko abzuschätzen. Die Akkumulation und Translokation von PFAAs wird jedoch durch ihre Bioverfügbarkeit im Boden beeinflusst, so dass es nicht einfach ist, die Translokationsfähigkeit von Ziel-PFAAs in Pflanzen zu bewerten. Darüber hinaus sind hydroponische Experimente im Allgemeinen durch mehrere Faktoren begrenzt, was es schwieriger macht, das essbare Gewebe von Pflanzen zu erwerben. Typischerweise wurde das Phloem direkt von Pflanzen gesammelt, um die Translokation organischer Verbindungen über große Entfernungen in Pflanzen zu beobachten, während es schwierig ist, Phloems aus Pflanzensämlingen zu gewinnen¹⁵. Daher wurde eine einfache und effektive Methode, die Split-Root-Technik, eingeführt, um die Translokation von PFAAs in Pflanzen während einer relativ kurzfristigen Exposition zu untersuchen. Was die Split-Root-Untersuchung betrifft, so werden die Wurzeln in einem Pflanzensämling in zwei Teile getrennt; Ein Teil wird in die Nährlösung gegeben, die Ziel-PFAAs enthält (Röhrchen A), und der andere Teil wird in Abwesenheit von PFAAs in die Nährlösung gegeben (Röhrchen B). Nach mehrtägiger Exposition werden die PFAAs in Röhre B mittels LC-MS/MS gemessen. Die Konzentration von PFAAs in Röhre B offenbart das Translokationspotential von PFAAs durch das Phloem innerhalb der Pflanzen^16,17,18.

Das Split-Root-Experiment wurde für die Untersuchung der Ferntranslokation vieler Verbindungen in Pflanzen berichtet, wie CuO-Nanopartikel¹⁷, Steroidöstrogene 18 und Organophosphatester¹⁶. Diese Studien lieferten den Nachweis, dass diese Verbindungen über das Phloem auf die essbaren Teile von Pflanzen übertragen werden können. Ob PFAAs jedoch bei der Translokation in Pflanzen helfen könnten, und die Auswirkungen von Verbindungseigenschaften müssen weiter untersucht werden. Basierend auf diesen Berichten wurde das Split-Root-Experiment in der vorliegenden Studie durchgeführt, um den Langstreckentransport von PFAAs in Weizen aufzudecken.

Protokoll

Weizensamen, Triticum aestivum L., wurden beschafft (siehe Materialtabelle) und für die vorliegende Studie verwendet.

1. Keimung von Weizenkeimlingen und Hydrokultur

1. Wählen Sie Weizensamen ähnlicher Größe und desinfizieren Sie sie für 15 min mit 8% (w/w) Wasserstoffperoxidlösung.
2. Spülen Sie die desinfizierten Samen gründlich mit entionisiertem Wasser ab und legen Sie sie dann im Dunkeln bei Raumtemperatur auf feuchtes Filterpapier, um 5 Tage lang zu keimen.
3. Wählen Sie ungefähr neun gekeimte Sämlinge einheitlicher Größe aus und geben Sie sie in Kunststoffbecher mit 250 ml Nährlösung (1/4 Stärke der Hoagland-Lösung; ihre chemische Zusammensetzung ist in Tabelle 1 dargestellt).
   HINWEIS: Von den neun Samen wurden jeweils drei für Blank, PFOA bzw. PFOS ausgewählt.
4. Die Sämlinge vor der Exposition 7 Tage lang in Wachstumskammern mit einem Zyklus von 14 h bei 22 °C und 10 h bei 27 °C kultivieren.

2. Das Wurzelspaltungsexperiment

1. Führen Sie die Sämlingskultivierung in zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen (A und B) durch.
   HINWEIS: In Zentrifugenröhrchen A waren 50 ml sterile 1/4 Hoagland-Lösung vorhanden, und die gleiche Menge an Nährlösung war in Zentrifugenröhrchen B vorhanden.
   1. Das handelsübliche PFOA und PFOS (siehe Materialtabelle) wird in Methanol gelöst und mit der sterilen Nährlösung als Stammlösung verdünnt. Dann wird die Stammlösung in Röhrchen B mit einer PFOA/PFOS-Konzentration von 100 μg/L gegeben.
   2. Führen Sie die Behandlungen in dreifacher Ausführung mit einer Blankokontrolle durch, um die Hintergrundkontamination zu überwachen. Ein schematisches Diagramm der Split-Root-Expositionsexperimente ist in Abbildung 1 dargestellt.
2. Trennen Sie die gesamten Wurzeln des Weizenkeimlings mit einer Pinzette in zwei gleiche Teile, so dass die Wurzeln immer noch am selben Trieb befestigt sind, und führen Sie sie vorsichtig in die Röhrchen A bzw. B ein.
3. Verschließen Sie die beiden Röhrchen mit Aluminiumfolie und kultivieren Sie sie 7 Tage lang in einem Inkubator. Behalten Sie die gleichen Inkubationsbedingungen wie in Schritt 1.4 beschrieben bei.
4. Sammeln Sie die Weizensämlinge nach 7 Tagen Kultur und trennen Sie den Weizen in drei Teile: Triebe und Wurzeln, die in der Stachellösung von PFAAs bzw. undotierter Lösung mit sterilisierter Schere kultiviert werden.
5. Die Pflanzenproben werden in einem Gefriertrockner bei −55 °C für 48 h gefriergetrocknet.
6. Homogenisieren und wiegen Sie die Wurzel- und Sprossenproben. Sammeln Sie die Proben der aufgespießten und nicht dotierten Lösung.

3. Extraktion von PFOA und PFOS aus Pflanzengeweben

1. Fügen Sie 2 ml Natriumcarbonatpuffer (0,25 mol/L), 1 ml Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (0,5 mol/L) und 5 ml Methyl-tert-Butylether (siehe Materialtabelle) zu einem 15-ml-Polypropylenrohr hinzu, einschließlich der homogenisierten Wurzel oder des homogenisierten Sprosses.
2. Schütteln Sie das Röhrchen bei 250 U/min für 20 min und zentrifugieren Sie es bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur, um die überstehende organische Phase zu erhalten. Führen Sie den Extraktionsvorgang zweimal durch.
3. Mischen Sie die gesammelten Extrakte, verdampfen Sie sie in einem sanften Stickstoffstrom (_N2) zur Trockne und rekonstituieren Sie sie dann mit 5 ml Methanol und wirbeln Sie sie, wobei die gleiche Geschwindigkeit für etwa 30 s beibehalten wird.
4. Die Pesticarb-Kartusche (siehe Materialtabelle) wird mit 5 ml 0,1 % NH₄OH in Methanol, 5 ml Wasser und 5 ml Methanol konditioniert.
5. Fügen Sie die 5 ml extrahierende Methanollösung durch die Pesticarb-Patrone (500 mg / 6 ml) hinzu, um das Pigment zu entfernen, eluieren Sie die Patrone mit 5 ml Methanol und sammeln Sie in den gleichen Röhrchen.
6. Die gesammelten 10 mL Methanollösung werden nahezu trocken eingedampft und mit 200 μL Methanol rekonstituiert, gefolgt von Wirbeln und Zentrifugieren bei 10.000 x g für 20 min bei Raumtemperatur.

4. Probenvorbereitung aus der Nährlösung

1. Zustand mit 5 mL Methanol und 5 ml Wasser zur Aktivierung der PEP-Extraktionskartusche (60 mg/g, 3 ml) (siehe Materialtabelle).
2. Geben Sie 1 ml der Stachellösung oder 50 ml der nicht dotierten Lösungsproben (Schritt 2.6) durch die Patrone.
3. Eluieren Sie die Ziel-PFAAs mit 10 ml Methanol, verdampfen Sie den Extrakt mit sanftem_N2 und rekonstituieren Sie dann mit 200 μL Methanol für die Analyse.

5. Instrumentelle Analyse

1. Verwenden Sie eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-UPLC in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) zur Quantifizierung der Ziel-PFAAs im Multireaktionsmodus (MRM) und negativer Elektrospray-Ionisation (ESI-) (siehe Materialtabelle).
2. Injizieren Sie 10 μL Proben und trennen Sie die Ziel-PFAAs mit einer C18-Flüssigkeitschromatosäule (1,7 μm, 2,1 mm x 50 mm, siehe Materialtabelle) und verwenden Sie 2 mM Ammoniumacetat in Wasser (Phase A) und Methanol (Phase B) als mobile Phase für UPLC mit einer Durchflussrate von 0,3 ml / min. Halten Sie die Säulentemperatur bei 50 °C.
   HINWEIS: Die Ionenübergänge von PFOA und PFOS betragen 413 bis 369 bzw. 499 bis 80. Das Gradientenelutionsprogramm und die instrumentellen Parameter LC-MS/MS zur Quantifizierung der Ziel-PFAAs sind in Tabelle 2 aufgeführt.
3. Verarbeiten Sie die Daten mit der Datenanalysesoftware (siehe Materialtabelle).

Ergebnisse

Das Split-Root-Experiment untersuchte den Langstreckentransport von PFAAs in Weizen. Wie in Abbildung 2A,C gezeigt, konnten sowohl PFOA als auch PFOS von der Weizenwurzel aufgenommen und auf den Spross übertragen werden. PFOS und PFOA wurden in der Weizenwurzel und -lösung im Röhrchen A der Blindkontrolle nicht nachgewiesen. Es wurde festgestellt, dass PFOS und PFOA in den Weizenwurzeln nachgewiesen wurden, die in der undotierten Lösung kultiviert wurden, mit einer Konze...

Diskussion

Um die Genauigkeit dieses Verfahrens zu gewährleisten, muss sorgfältig vorgegangen werden, um sicherzustellen, dass die Stachellösung in Röhrchen B die nicht versetzte Lösung in Röhrchen A nicht verunreinigt. Die gegebene Konzentration von Ziel-PFAAs in der vorliegenden Studie war relativ höher als ihre Konzentration in der realen Umgebung, was sicherstellt, dass Ziel-PFAAs in Weizen und ungespießten Lösungen mit LC-MS/MS überwacht werden konnten.

Es gibt Einschränkungen für diese...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACQUITY UPLC BEH C18 column	Waters, Milford, MA		Liquid chromatographic column
Cleanert PEP cartridge	Bonna- Angel Technologies, China		Solid phase extraction column
Clearnert Pesticarb cartridge	Bonna- Angel Technologies, China		Solid phase extraction column
LC-MS/MS(Waters Acquity UPLC i-Class Coupled to Xevo TQ-S)	Waters, Milford, MA		Liquid chromatography and mass spectrometry
Lyophilizer	Boyikang Instrument Ltd., Beijing, China	FD-1A50	Freeze-dried sample
Masslynx	Waters, Milford, MA		data analysis software
Methyl tert-butyl ether	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)		use for extracting target compounds from plant tissues
MPFAC-MXA	Wellington Laboratories (Ontario, Canada)	PFACMXA0518	the internal standards
PFAC-MXB	Wellington Laboratories (Ontario, Canada)	PFACMXB0219	mixture of PFAA calibration standards
PFOA	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)	335-67-1	a represent PFAAs
PFOS	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)	2795-39-3	a represent PFAAs
Sodium carbonate buffer	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)		use for extracting target compounds from plant tissues
Tetrabutylammonium hydrogen sulfate	Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US)		use for extracting target compounds from plant tissues
Wheat seeds	Chinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing,China)		Triticum aestivum L.