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  • Resumen
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  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El patógeno fúngico humano Cryptococcus neoformans produce una variedad de factores de virulencia (por ejemplo, peptidasas) para promover su supervivencia dentro del huésped. Los nichos ambientales representan una fuente prometedora de nuevos inhibidores naturales de la peptidasa. Este protocolo describe la preparación de extractos de moluscos y la evaluación de su efecto sobre la producción de factores de virulencia fúngica.

Resumen

Cryptococcus neoformans es un patógeno fúngico humano encapsulado con una distribución global que infecta principalmente a individuos inmunocomprometidos. El uso generalizado de antifúngicos en entornos clínicos, su uso en la agricultura y la hibridación de cepas han llevado a una mayor evolución de la resistencia. Esta creciente tasa de resistencia contra los antifúngicos es una preocupación creciente entre los médicos y científicos de todo el mundo, y existe una mayor urgencia para desarrollar nuevas terapias antimicóticas. Por ejemplo, C. neoformans produce varios factores de virulencia, incluyendo enzimas intra y extracelulares (por ejemplo, peptidasas) con roles en la degradación de tejidos, regulación celular y adquisición de nutrientes. La interrupción de dicha actividad peptidasa por inhibidores perturba el crecimiento y la proliferación de hongos, lo que sugiere que esta puede ser una estrategia importante para combatir el patógeno. Es importante destacar que los invertebrados como los moluscos producen inhibidores de la peptidasa con aplicaciones biomédicas y actividad antimicrobiana, pero están poco explorados en términos de su uso contra patógenos fúngicos. En este protocolo, se realizó una extracción global de moluscos para aislar posibles inhibidores de peptidasa en extractos crudos y clarificados, y se evaluaron sus efectos contra los factores clásicos de virulencia criptocócica. Este método apoya la priorización de moluscos con propiedades antifúngicas y brinda oportunidades para el descubrimiento de agentes antivirulentes al aprovechar los inhibidores naturales que se encuentran en los moluscos.

Introducción

Cryptococcus neoformans es un patógeno fúngico humano que produce enfermedad grave en huéspedes inmunocomprometidos, como las personas que viven con VIH / SIDA1, y conduce a aproximadamente el 19% de las muertes relacionadas con el SIDA2. El hongo es susceptible a varias clases de antifúngicos, incluyendo azoles, polienos y flucitosina, que ejercen actividad fungicida y fungistática utilizando mecanismos distintos 3,4. Sin embargo, el uso extensivo de antifúngicos en entornos clínicos y agrícolas combinado con la hibridación de cepas ha amplificado la evolución de la resistencia en múltiples especies de hongos, incluyendo C. neoformans5.

Para superar los desafíos de la resistencia a los antifúngicos y reducir la prevalencia de infecciones fúngicas a escala global, un enfoque prometedor es utilizar los factores de virulencia de Cryptococcus spp. (por ejemplo, adaptabilidad a la temperatura, cápsula de polisacáridos, melanina y enzimas extracelulares) como posibles objetivos terapéuticos 4,6 . Este enfoque tiene varias ventajas, ya que estos factores de virulencia están bien caracterizados en la literatura, y dirigirse a estos factores podría reducir potencialmente las tasas de resistencia a los antifúngicos al imponer una presión selectiva más débil al perjudicar la virulencia en lugar de apuntar al crecimiento celular6. En este contexto, numerosos estudios han evaluado la posibilidad de dirigirse a enzimas extracelulares (por ejemplo, proteasas, peptidasas) para reducir o inhibir la virulencia de Cryptococcus spp.7,8,9.

Los organismos como los invertebrados y las plantas no poseen un sistema inmune adaptativo para protegerse de los patógenos. Sin embargo, dependen de un fuerte sistema inmune innato con una inmensa variedad de compuestos químicos para hacer frente a microorganismos y depredadores10. Estas moléculas incluyen inhibidores de peptidasa, que juegan un papel importante en muchos sistemas biológicos, incluyendo los procesos celulares de inmunidad de invertebrados, como la coagulación de la hemolinfa, la síntesis de citoquinas y péptidos antimicrobianos, y la protección de los huéspedes mediante la inactivación directa de las proteasas de los patógenos11. Por lo tanto, los inhibidores de peptidasa de invertebrados como los moluscos poseen aplicaciones biomédicas potenciales, pero muchos permanecen sin caracterizar10,12,13. En este contexto, hay aproximadamente 34 especies de moluscos terrestres en Ontario y 180 moluscos de agua dulce en Canadá14. Sin embargo, su perfil y caracterización en profundidad aún son limitados15. Estos organismos presentan una oportunidad para la identificación de nuevos compuestos con potencial actividad antifúngica10.

En este protocolo, se describen métodos para aislar y aclarar extractos de invertebrados (por ejemplo, moluscos) (Figura 1) seguidos de medir la supuesta actividad inhibidora de la peptidasa. Las propiedades antifúngicas de estos extractos se evalúan midiendo su impacto en la producción del factor de virulencia de C. neoformans utilizando ensayos fenotípicos (Figura 2). Es importante tener en cuenta que las diferencias en las propiedades antifúngicas entre los extractos crudos y clarificados pueden ser indicativas de factores microbianos (por ejemplo, metabolitos secundarios o toxinas producidas por el microbioma huésped) del molusco, que pueden influir en las observaciones experimentales. Tales hallazgos respaldan la necesidad de que este protocolo evalúe extractos crudos y aclarados de forma independiente para desentrañar los modos de acción. Además, el proceso de extracción es imparcial y puede permitir la detección de propiedades antimicrobianas contra una gran cantidad de patógenos fúngicos y bacterianos. Por lo tanto, este protocolo proporciona un punto de partida para la priorización de especies de moluscos con propiedades antifúngicas contra C. neoformans y una oportunidad para evaluar las conexiones entre la actividad enzimática y la producción de factores de virulencia a través de supuestos mecanismos inhibitorios.

Protocolo

1. Extracción de proteínas de moluscos

  1. Recolectar moluscos de un área natural designada y aprobada (por ejemplo, Speed River, Guelph, Ontario). Para este estudio, se seleccionaron especies nativas e invasoras para evaluar una amplia gama de posibles efectos antifúngicos.
  2. Rompa suavemente la cáscara de los moluscos (por ejemplo, Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi y Cipangopaludina chinensis) con un mortero, y retire las piezas sólidas con un par de pinzas. Generalmente, 10 moluscos se agrupan para su uso en todo el protocolo.
  3. Recoger y pesar los órganos. Aproximadamente 15-20 g de muestra es óptimo. Use tijeras para cortar los órganos en trozos pequeños de aproximadamente 0.5-1 cm de tamaño.
  4. Congele rápidamente las muestras de órganos diseccionadas y cortadas con nitrógeno líquido. Luego, muele las muestras de órganos en un polvo fino usando un mortero.
  5. Añadir el polvo de la muestra de órgano (aproximadamente 15 g) en 30 ml de agua destilada fría (4 °C) para lograr una proporción de 1:2 (p/v).
  6. Vierta 2 ml de la muestra en tubos de 2 ml de alto impacto. Añadir una cucharada de perlas de acero inoxidable de 3 mm (aproximadamente 500 μg) a cada tubo, y homogeneizar con una batidora (véase la tabla de materiales) durante 3 min a 1.200 rpm y 4 °C.
  7. Centrifugar a 12.000 × g durante 20 min a 4 °C. Recoger todos los sobrenadantes con una pipeta en un tubo fresco de 50 ml, desechando el pellet.
  8. Filtrar-esterilizar el sobrenadante utilizando una membrana de 0,22 μm. Almacene las muestras en hielo y proceda al protocolo de aclaración (sección 2), según corresponda.
    NOTA: Las muestras pueden congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y almacenarse a -20 °C para ser utilizadas como extractos crudos.

2. Aclaración del extracto de molusco

  1. Colocar la muestra sobrenadante del paso 1.8 en un baño térmico a 60 °C durante 30 min. Luego, enfríe las muestras rápidamente transfiriéndolas a un cubo con hielo durante 20 minutos.
  2. Centrifugar las muestras a 15.000 × g durante 45 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco de 50 ml y deseche el pellet. Esterilice con filtro las muestras con un filtro de membrana de 0,22 μm y luego guárdelas en hielo.
  3. Determinar la concentración de proteína en las muestras a partir del paso 1.8 (es decir, el extracto crudo) y el paso 2.2 (es decir, el extracto clarificado) utilizando un ensayo de cuantificación (por ejemplo, ensayo de ácido bicinchonínico17). El rango óptimo de concentración de proteínas es de 4-8 mg/ml.
  4. Almacene las muestras en hielo durante un máximo de 1 h o congele rápidamente en nitrógeno líquido, y guárdelas a -20 °C hasta que sea necesario.

3. Ensayo de actividad inhibitoria

  1. Medir la actividad inhibitoria de los extractos crudos y clarificados utilizando ensayos enzimáticos en triplicado técnico.
    NOTA: Cada ensayo enzimático consiste en una enzima (por ejemplo, subtilisina A, que está involucrada en la virulencia fúngica 16,17,18; generalmente alrededor de 1 x 10-9 mol / L para ensayos basados en cromogenia), un tampón y un sustrato. La reacción comienza cuando el sustrato se encuentra con la enzima. La actividad enzimática es proporcional a la tasa de conversión del sustrato en el producto.
  2. Evaluar el efecto de la concentración enzimática (CE) sobre la actividad enzimática (EA) hasta obtener una dependencia lineal entre ambos parámetros. Para los siguientes pasos, utilice una concentración de enzimas dentro del rango lineal medido.
    NOTA: El ensayo enzimático para la peptidasa subtilisina A se detalla en los siguientes pasos.
  3. Incubar los extractos de proteína de moluscos crudos (paso 1.11) o clarificados (paso 2.5) (por ejemplo, 10 μL que contengan 4 mg/ml de proteína) con 10 μL de subtilisina A (concentración determinada a partir de la etapa 3.2) y 220 μL de Tris-HCl de 100 mM a pH 8,6 (para el control, añadir 230 μL de tampón Tris sin añadir el extracto) durante 10 min a 25 °C en una placa de fondo plano de 96 pocillos.
  4. Añadir 10 μL de N-Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida, el sustrato de la subtilisina A, a una concentración final de 1 K m (constante de Michaelis-Menten; 0,2mM para este sustrato con subtilisina A) para un volumen de reacción final de 250 μL.
  5. Mida la actividad enzimática monitoreando la apariencia del producto a lo largo del tiempo leyendo la densidad óptica (OD) a 405 nm cada 15 s durante 3 min.
  6. Determinar la actividad enzimática residual calculando la relación entre la actividad enzimática en presencia del extracto de molusco y la actividad en ausencia del extracto.
  7. Si se observa actividad inhibitoria (es decir, actividad residual por debajo de 1), medir el valor de concentración inhibitoria 50 (IC50) utilizando un rango de concentraciones de los extractos (por ejemplo, una serie de dilución doble de 200 μg/ml a 1 μg/ml) siguiendo los métodos estándar19.

4. Efecto de los extractos de moluscos en el crecimiento de C. neoformans

  1. Utilizar una punta de pipeta de 10 μL para introducir una sola colonia de C. neoformans var. grubii H99 de tipo salvaje (WT) en 5 ml de extracto de levadura-peptona-dextrosa (YPD) medio (10 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de peptona y 20 g/L de dextrosa, pH 6,5), e incubar durante 16-18 h a 30 °C y 200 rpm. Realizar el experimento en triplicado biológico y duplicado técnico.
  2. Recolectar 500 μL del cultivo en una cubeta y medir el crecimiento leyendo el OD a 600 nm. Diluir el cultivo con levadura base de nitrógeno (YNB) medio a un ODfinal 600 de 0,02.
  3. Cocultivo de células de C. neoformans con diferentes concentraciones (por ejemplo, una serie de dilución triple de 440 μg/ml a 15 μg/ml de proteína) de los extractos (es decir, crudos y clarificados). Para ello, mezclar 10 μL de los extractos con 190 μL del cultivo diluido de C. neoformans (paso 4.2) en una placa de 96 pocillos.
  4. Mida el crecimiento leyendo el OD 600 utilizando un lector de placas cada 15 min a 1 h durante 72 h a200 rpm y 37 °C.

5. Efecto de los extractos de moluscos en la producción de melanina de C. neoformans

  1. Preparar placas de L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA).
    1. Autoclave 230 mL de agar 14 g/L, y dejar enfriar hasta que alcance los 50-60 °C.
    2. Agregue 3.25 mL de 1 M de glicina, 7.35 mL de 1 M KH 2 PO 4, 2.5 mL de 1 M MgSO4.7H 2 O, 0.6 mL de 40% de glucosa, 70 μL de 10 mM de tiamina y2.5mL de 100 mM L-DOPA (esterilizada por filtro) al agar líquido.
    3. Vierta 15 ml de la mezcla en placas de Petri, déjelas secar durante aproximadamente 1 h en la oscuridad y guárdelas a 2-4 °C durante un máximo de 1 semana. Asegúrese de que las tapas estén parcialmente levantadas para que el agar se seque correctamente.
  2. Inocular 5 mL de medio YNB con 50 μL de cultivo de C. neoformans a partir del paso 4.1. Incubar durante 16-18 h a 30 °C y 200 rpm.
  3. Girar las células a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C. Lave las células 2 veces con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a pH 7.4.
  4. Contar las células con un hemocitómetro. Resuspender las células en 1 mL de PBS para alcanzar una concentración final de 106 células/mL.
  5. Prepare una serie de dilución (por ejemplo, doble) de los extractos de moluscos crudos y clarificados. Del mismo modo, prepare una serie de dilución de 10 veces de células de C. neoformans (paso 5.4) de 1 x 106 células/ml a 1 x 101 células/ml utilizando PBS estéril en placas de 96 pocillos.
  6. Extienda 200 μL de los extractos sobre placas de Petri que contengan agar L-DOPA con un hisopo y déjelos secar durante 15 minutos.
  7. Coloque 5 μL de cultivo de cada pocillo en la placa L-DOPA, dejando 1 cm entre gotas. Dejar secar en la oscuridad durante 15 min.
  8. Incubar las placas a 30 °C y 37 °C en una incubadora estática durante 3-5 días, capturando imágenes cada 24 h con una cámara o generador de imágenes de placas (por ejemplo, escáner).
    NOTA: Aquí se utilizan dos condiciones de temperatura para explorar la influencia de la temperatura en los efectos inhibidores del crecimiento de los extractos de moluscos, con 30 °C representando temperaturas ambientales y 37 °C representando temperaturas fisiológicas humanas.

6. Efecto de los extractos de moluscos en la producción de cápsulas polisacáridas de C. neoformans

  1. Prepare un medio bajo en hierro (LIM) como se describe a continuación.
    1. Disuelva 5 g de resina quelante (consulte la Tabla de materiales) en 60 ml de agua ultrapura y empaquétela en una columna de vidrio (2 cm de diámetro x 25 cm de largo). Lave la columna con 100 ml de agua y deseche el agua recolectada.
    2. Prepare agua baja en hierro (LI-water) pasando 2 L de agua ultrapura estéril a través de la columna quelante. Conservar el LI-water a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
    3. Disuelva 5 g de glucosa en 100 ml de LI-agua. Disuelva 5 g de L-asparagina en 200 ml de LI-agua en un vaso de precipitados separado.
    4. Agregue lo siguiente a 500 ml de LI-agua en orden: 4.78 g de HEPES, 0.4 g de K 2 HPO 4,0.08 g de MgSO4.7H 2 O, 1.85 g de NaHCO3 y 0.25 g de CaCl 2.2H 2 O.
    5. Combine las soluciones del paso 6.1.3 y del paso 6.1.4. Añadir 1 ml de sal sódica (BPS) de ácido batofenofenontrolina disulfónico a una concentración final de 100 μM.
    6. Ajuste el pH a 7,2 con 1 M LI-MOPS. Agregue LI-agua a un volumen final de 1 L, y filtre y esterilice el medio pasándolo a través de una membrana de 0,22 μm. Añadir 100 μL de tiamina estéril (4 mg/ml) al medio.
  2. Inocular 5 mL de medio YNB con 50 μL del cultivo de C. neoformans a partir de la etapa 4.1. Incubar durante 16-18 h a 30 °C y 200 rpm. Utilice este cultivo para inocular 5 ml de LIM a una concentración final de 105 células/ml.
  3. Añadir volúmenes apropiados de los extractos de moluscos (por ejemplo, una dilución doble o el volumen determinado a partir de ensayos de virulencia anteriores) para alcanzar las concentraciones deseadas. Incubar durante 72 h a 37 °C y 200 rpm con tapas aflojadas. Después de la incubación, recoger 1 ml de células, y lavar 2x con PBS estéril, pH 7,4, a 1.500 × g durante 2 min a 4 °C.
  4. Resuspenda suavemente las células en 1 ml de PBS. Mezcle las celdas con tinta china en una proporción de 1:1 (por ejemplo, 4 μL de tinta china con 4 μL de suspensión celular) sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio. Coloque un cubreobjetos en la parte superior de la diapositiva.
  5. Visualice las muestras utilizando un microscopio de contraste de interferencia diferencial (DIC) con un objetivo de aceite de 63x (consulte la Tabla de materiales). Ajuste el contraste a automático y enfoque manualmente con el dial del microscopio. Seleccione todas las imágenes y expórtelas en formato TIFF. No es necesario aplicar filtros.
  6. Usando la herramienta de regla en ImageJ20, cuantifique la relación entre el tamaño total de la célula (incluida la cápsula) y el tamaño del cuerpo de la célula.

7. Efecto de los extractos de moluscos en la producción de biofilm de C. neoformans

  1. Inocular 5 mL de medio YNB con 50 μL de cultivo de C. neoformans a partir del paso 4.1. Incubar durante 16-18 h a 30 °C y 200 rpm.
  2. Recolectar células del cultivo de 5 ml. Lavar las celdas con PBS estéril, pH 7,4, a 1.500 × g durante 2 min a 4 °C.
  3. Contar las células con un hemocitómetro. Resuspender las células en 3 ml del medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco a una concentración final de 107 células/ml.
  4. Transfiera 300 μL de la suspensión celular a los pocillos individuales de una placa estéril, de poliestireno, de fondo plano de 24 pocillos. Utilice pozos con medios sólo como control.
  5. Añadir volúmenes apropiados de los extractos de moluscos (por ejemplo, una dilución doble o el volumen determinado a partir de ensayos de virulencia anteriores) para alcanzar una concentración final de 10-20 μg/ml de proteína. Asegúrese de que el volumen del extracto no sea superior al 10% del volumen total.
  6. Envolver las placas con papel de aluminio (para evitar la evaporación del medio) e incubar durante 48 h utilizando una incubadora estática a 30 °C y 37 °C.
  7. Usando una botella o dispensador, lave los pocillos 2 veces con agua estéril y déjelos secar al aire durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue 100 μL de solución de cristal violeta al 0,3% a cada pocillo (incluidos los pocillos de control de solo medio) e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.
  8. Lave bien los pozos 3 veces con agua estéril (las biopelículas no se interrumpirán durante el lavado). Añadir 200 μL de etanol al 100% e incubar durante 10 min a RT.
  9. Transfiera 75 μL a una nueva placa de fondo plano de 96 pocillos y lea el OD550. Cuantificar la formación de biofilm como (OD 550nm de muestra - OD550nm de blanco).

Resultados

El flujo de trabajo descrito en este documento permite el aislamiento de proteínas y péptidos de moluscos con posibles propiedades antivirulencia contra C. neoformans. Del mismo modo, la evaluación de diferentes formas de extractos (es decir, crudos y clarificados) permite la semipurificación de los compuestos activos potenciales y apoya la evaluación posterior (por ejemplo, proteómica basada en espectrometría de masas). Típicamente, el flujo de trabajo de extracción de proteínas produce soluciones hom...

Discusión

El protocolo de extracción descrito aquí describe el aislamiento de compuestos de moluscos recolectados en Ontario, Canadá, y demuestra una investigación novedosa del uso de extractos de moluscos contra el patógeno fúngico humano, C. neoformans. Este protocolo se suma a un creciente cuerpo de investigación que investiga la actividad de los inhibidores de peptidasa de los invertebrados13. Durante la extracción, algunas muestras de extracto fueron difíciles de filtrar-esterilizar, ...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los miembros del Laboratorio Geddes-McAlister por su valioso apoyo a lo largo de esta investigación y sus comentarios sobre el manuscrito. Los autores reconocen el apoyo financiero de la Ontario Graduate Scholarship and International Graduate Research Award - University of Guelph a D. G.-G y de la Fundación Canadiense de Innovación (JELF 38798) y Ontario Ministry of Colleges and Universities - Early Researcher Award para J. G.-M.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm FiltersVWR28145-477 (North America)
1.5 mL Tubes (Safe-Lock)Eppendorf0030120086
2 mL Tubes (Safe-Lock)Eppendorf0030120094
3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA)Sigma-AldrichD9628-5GCAS #: 59-92-7
96-well platesCostar (Corning)3370
Bullet Blender Storm 24NEXT ADVANCEBBY24M
Centrifuge 5430REppendorf5428000010
Chelex 100 ResinBioRad142-1253
CO2 Incubator (Static)SANYONot available
Cryptococcus neoformans H99ATCC208821
DIC MicroscopeOlympus
DIC Microscope softwareZeiss
DMEMCorning10-013-CV
Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade)BioShopGLU501CAS #: 50-99-7
GlycineFisher ChemicalG46-1CAS #: 56-40-6
GraphPad Prism 9Dotmatics
HemocytometerVWR15170-208
HEPESSigma AldrichH3375
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O)HoneywellM1880-500GCAS #: 10034-99-8 
PeptoneBioShopPEP403
Phosohate buffer salt pH 7.4BioShopPBS408SKU: PBS408.500
Plate reader (Synergy-H1)BioTek (Agilent)Not available
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Fisher ChemicalP285-500CAS #: 7778-77-0
Subtilisin ASigma-AldrichP4860CAS #: 9014-01-01
Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilideSigma-Aldrich573462CAS #: 70967-97-4
Thermal bathVWR76308-834
Thiamine HydrochlorideFisher-BioreagentsBP892-100CAS #: 67-03-8
Yeast extractBioShopYEX401CAS #: 8013-01-2
Yeast nitrogen base (with Amino Acids)Sigma-AldrichY1250-250GYNB 

Referencias

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