Évaluation des propriétés anticryptococciques présumées des extraits bruts et clarifiés de mollusques

Résumé

L’agent pathogène fongique humain Cryptococcus neoformans produit une variété de facteurs de virulence (p. ex. peptidases) pour favoriser sa survie au sein de l’hôte. Les niches environnementales représentent une source prometteuse de nouveaux inhibiteurs naturels de la peptidase. Ce protocole décrit la préparation d’extraits de mollusques et l’évaluation de leur effet sur la production de facteurs de virulence fongiques.

Résumé

Cryptococcus neoformans est un pathogène fongique humain encapsulé avec une distribution mondiale qui infecte principalement les personnes immunodéprimées. L’utilisation généralisée des antifongiques en milieu clinique, leur utilisation en agriculture et l’hybridation des souches ont entraîné une évolution accrue de la résistance. Ce taux croissant de résistance aux antifongiques est une préoccupation croissante parmi les cliniciens et les scientifiques du monde entier, et il est de plus en plus urgent de développer de nouvelles thérapies antifongiques. Par exemple, C. neoformans produit plusieurs facteurs de virulence, y compris des enzymes intracellulaires et extracellulaires (par exemple, les peptidases) qui jouent un rôle dans la dégradation des tissus, la régulation cellulaire et l’acquisition des nutriments. La perturbation de cette activité peptidase par des inhibiteurs perturbe la croissance fongique et la prolifération, ce qui suggère que cela pourrait être une stratégie importante pour lutter contre l’agent pathogène. Il est important de noter que les invertébrés tels que les mollusques produisent des inhibiteurs de peptidases ayant des applications biomédicales et une activité antimicrobienne, mais ils sont sous-explorés en termes d’utilisation contre les pathogènes fongiques. Dans ce protocole, une extraction globale à partir de mollusques a été réalisée pour isoler les inhibiteurs potentiels de la peptidase dans des extraits bruts et clarifiés, et leurs effets contre les facteurs de virulence cryptococcique classiques ont été évalués. Cette méthode soutient la priorisation des mollusques ayant des propriétés antifongiques et offre des possibilités de découverte d’agents antivirulents en exploitant les inhibiteurs naturels présents dans les mollusques.

Introduction

Cryptococcus neoformans est un pathogène fongique humain qui produit une maladie grave chez les hôtes immunodéprimés, comme les personnes vivant avec le VIH/sida¹, et entraîne environ 19 % des décès liés au sida². Le champignon est sensible à plusieurs classes d’antifongiques, y compris les azoles, les polyènes et la flucytosine, qui exercent une activité fongicide et fongistatique en utilisant des mécanismes distincts ^3,4. Cependant, l’utilisation intensive d’antifongiques dans des contextes cliniques et agricoles combinée à l’hybridation des souches a amplifié l’évolution de la résistance chez de multiples espèces fongiques, y compris C. neoformans⁵.

Pour surmonter les défis de la résistance antifongique et réduire la prévalence des infections fongiques à l’échelle mondiale, une approche prometteuse consiste à utiliser les facteurs de virulence de Cryptococcus spp. (p. ex. adaptabilité à la température, capsule polysaccharidique, mélanine et enzymes extracellulaires) comme cibles thérapeutiques potentielles ^4,6 . Cette approche présente plusieurs avantages, car ces facteurs de virulence sont bien caractérisés dans la littérature, et le ciblage de ces facteurs pourrait potentiellement réduire les taux de résistance aux antifongiques en imposant une pression sélective plus faible en altérant la virulence plutôt qu’en ciblant la croissance cellulaire⁶. Dans ce contexte, de nombreuses études ont évalué la possibilité de cibler les enzymes extracellulaires (par exemple, les protéases, les peptidases) pour réduire ou inhiber la virulence de Cryptococcus spp.7,8,9.

Les organismes comme les invertébrés et les plantes ne possèdent pas de système immunitaire adaptatif pour se protéger des agents pathogènes. Cependant, ils s’appuient sur un système immunitaire inné fort avec une immense gamme de composés chimiques pour faire face aux micro-organismes et aux prédateurs¹⁰. Ces molécules comprennent les inhibiteurs de peptidase, qui jouent un rôle important dans de nombreux systèmes biologiques, y compris les processus cellulaires de l’immunité des invertébrés, tels que la coagulation de l’hémolymphe, la synthèse de cytokines et de peptides antimicrobiens, et la protection des hôtes en inactivant directement les protéases des agents pathogènes¹¹. Ainsi, les inhibiteurs de peptidases d’invertébrés tels que les mollusques possèdent des applications biomédicales potentielles, mais beaucoup restent non caractérisés^10,12,13. Dans ce contexte, il existe environ 34 espèces de mollusques terrestres en Ontario et 180 mollusques d’eau douce au Canada¹⁴. Cependant, leur profilage et leur caractérisation approfondis sont encore limités¹⁵. Ces organismes présentent une opportunité pour l’identification de nouveaux composés ayant une activité antifongique potentielle¹⁰.

Dans ce protocole, des méthodes pour isoler et clarifier des extraits d’invertébrés (par exemple, des mollusques) (Figure 1) suivies de la mesure de l’activité inhibitrice présumée de la peptidase sont décrites. Les propriétés antifongiques de ces extraits sont ensuite évaluées en mesurant leur impact sur la production de facteur de virulence de C. neoformans à l’aide de tests phénotypiques (Figure 2). Il est important de noter que les différences dans les propriétés antifongiques entre les extraits bruts et clarifiés peuvent indiquer des facteurs microbiens (p. ex. métabolites secondaires ou toxines produites par le microbiome hôte) du mollusque, qui peuvent influencer les observations expérimentales. De tels résultats soutiennent la nécessité pour ce protocole d’évaluer à la fois les extraits bruts et clarifiés indépendamment pour démêler les modes d’action. De plus, le processus d’extraction est impartial et peut permettre la détection de propriétés antimicrobiennes contre une pléthore d’agents pathogènes fongiques et bactériens. Par conséquent, ce protocole fournit un point d’initiation pour la priorisation des espèces de mollusques ayant des propriétés antifongiques contre C. neoformans et une occasion d’évaluer les liens entre l’activité enzymatique et la production de facteurs de virulence par des mécanismes inhibiteurs putatifs.

Protocole

1. Extraction de protéines à partir de mollusques

1. Ramasser des mollusques dans une zone naturelle désignée et approuvée (p. ex. rivière Speed, Guelph, Ontario). Pour cette étude, des espèces indigènes et envahissantes ont été sélectionnées pour évaluer un large éventail d’effets antifongiques potentiels.
2. Casser délicatement la coquille des mollusques (p. ex. Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi et Cipangopaludina chinensis) à l’aide d’un pilon et d’un mortier, et retirer les morceaux solides avec une pince à épiler. Généralement, 10 mollusques sont regroupés pour être utilisés tout au long du protocole.
3. Prélever et peser les organes. Environ 15-20 g d’échantillon est optimal. Utilisez des ciseaux pour couper les organes en petits morceaux d’environ 0,5 à 1 cm.
4. Congeler les échantillons d’organes disséqués et coupés avec de l’azote liquide. Ensuite, broyez les échantillons d’organes en une poudre fine à l’aide d’un pilon et d’un mortier.
5. Ajouter la poudre de l’échantillon d’organe (environ 15 g) dans 30 mL d’eau distillée froide (4 °C) pour obtenir un rapport de 1:2 (p/v).
6. Verser 2 mL de l’échantillon dans des tubes de 2 mL à fort impact. Ajouter une cuillère de billes d’acier inoxydable de 3 mm (environ 500 μg) dans chaque tube et homogénéiser à l’aide d’un mélangeur (voir le tableau des matériaux) pendant 3 minutes à 1 200 tr/min et à 4 °C.
7. Centrifuger à 12 000 × g pendant 20 min à 4 °C. Recueillir tous les surnageants à l’aide d’une pipette dans un tube frais de 50 mL, en jetant la pastille.
8. Filtrer-stériliser le surnageant à l’aide d’une membrane de 0,22 μm. Conservez les échantillons sur de la glace et passez au protocole de clarification (section 2), s’il y a lieu.
   NOTA : Les échantillons peuvent être surgelés dans de l’azote liquide et conservés à −20 °C pour être utilisés comme extraits bruts.

2. Clarification de l’extrait de mollusque

1. Placer l’échantillon surnageant de l’étape 1.8 dans un bain thermique à 60 °C pendant 30 min. Ensuite, refroidissez rapidement les échantillons en les transférant dans un seau avec de la glace pendant 20 min.
2. Centrifuger les échantillons à 15 000 × g pendant 45 min à 4 °C. Recueillir le surnageant dans un tube frais de 50 ml et jeter la pastille. Filtrez-stérilisez les échantillons à l’aide d’un filtre à membrane de 0,22 μm, puis conservez-les sur de la glace.
3. Déterminer la concentration de protéines dans les échantillons à partir de l’étape 1.8 (c.-à-d. l’extrait brut) et de l’étape 2.2 (c.-à-d. l’extrait clarifié) à l’aide d’un essai de quantification (p. ex. essai sur l’acide bicinchoninique¹⁷). La plage optimale de concentration en protéines est de 4 à 8 mg/mL.
4. Conservez les échantillons sur de la glace jusqu’à 1 h ou surgelez-les dans de l’azote liquide et conservez-les à −20 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

3. Essai de l’activité inhibitrice

1. Mesurer l’activité inhibitrice des extraits bruts et clarifiés à l’aide de tests enzymatiques en triplat technique.
   NOTE: Chaque test enzymatique se compose d’une enzyme (par exemple, la subtilisine A, qui est impliquée dans la virulence fongique 16,17,18; habituellement autour de 1 x ¹⁰⁻⁹ mol/L pour les tests chromogènes), d’un tampon et d’un substrat. La réaction commence lorsque le substrat rencontre l’enzyme. L’activité enzymatique est proportionnelle au taux de conversion du substrat en produit.
2. Évaluer l’effet de la concentration enzymatique (CE) sur l’activité enzymatique (EA) jusqu’à ce qu’une dépendance linéaire soit obtenue entre les deux paramètres. Pour les étapes suivantes, utilisez une concentration enzymatique dans la plage linéaire mesurée.
   NOTE: Le dosage enzymatique de la peptidase subtilisine A est détaillé dans les étapes suivantes.
3. Incuber les extraits bruts (étape 1.11) ou clarifiés (étape 2.5) de protéines de mollusques (p. ex. 10 μL contenant 4 mg/mL de protéines) avec 10 μL de subtilisine A (concentration déterminée à partir de l’étape 3.2) et 220 μL de Tris-HCl 100 mM à pH 8,6 (pour le témoin, ajouter 230 μL de tampon Tris sans ajouter l’extrait) pendant 10 min à 25 °C dans une plaque à fond plat de 96 puits.
4. Ajouter 10 μL de N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide, substrat de la subtilisine A, à une concentration finale de 1 K m (constante de Michaelis-Menten ; 0,2_mM pour ce substrat avec la subtilisine A) pour un volume de réaction final de 250 μL.
5. Mesurer l’activité enzymatique en surveillant l’aspect du produit au fil du temps en lisant la densité optique (DO) à 405 nm toutes les 15 s pendant 3 min.
6. Déterminer l’activité enzymatique résiduelle en calculant le rapport de l’activité enzymatique en présence de l’extrait de mollusque à celle en l’absence de l’extrait.
7. Si une activité inhibitrice est observée (c.-à-d. activité résiduelle inférieure à 1), mesurer la valeur de la concentration inhibitrice 50 (CI₅₀) en utilisant une gamme de concentrations des extraits (p. ex. une série de dilution double de 200 μg/mL à 1 μg/mL) selon les méthodes standard¹⁹.

4. Effet des extraits de mollusques sur la croissance de C. neoformans

1. Utiliser un embout de pipette de 10 μL pour introduire une seule colonie de C. neoformans var. grubii de type sauvage H99 (WT) dans 5 mL de milieu extrait de levure-peptone-dextrose (YPD) (10 g/L d’extrait de levure, 20 g/L de peptone et 20 g/L de dextrose, pH 6,5), et incuber pendant 16-18 h à 30 °C et 200 rpm. Effectuer l’expérience en triple exemplaire biologique et en double technique.
2. Recueillir 500 μL de la culture dans une cuvette et mesurer la croissance en lisant la DO à 600 nm. Diluer la culture avec un milieu azoté base de levure (YNB) jusqu’à obtenir une DO finale_{de 600} de 0,02.
3. Co-culture de cellules de C. neoformans avec différentes concentrations (p. ex., une série de dilution triple de 440 μg/mL à 15 μg/mL de protéines) des extraits (c.-à-d. bruts et clarifiés). Pour ce faire, mélanger 10 μL des extraits avec 190 μL de culture de C. neoformans dilué (étape 4.2) dans une plaque de 96 puits.
4. Mesurer la croissance en lisant le OD 600 à l’aide d’un lecteur de plaques toutes les 15 minutes à 1 h pendant 72 h à₂₀₀ tr/min et 37 °C.

5. Effet des extraits de mollusques sur la production de mélanine de C. neoformans

1. Préparer des plaques de L-3,4-dihydroxyphénylalanine (L-DOPA).
   1. Autoclaver 230 mL de gélose à 14 g/L et laisser refroidir jusqu’à ce qu’il atteigne 50-60 °C.
   2. Ajouter 3,25 mL de 1 M de glycine, 7,35 mL de 1 M KH 2 PO 4, 2,5 mL de 1 M MgSO_4,7H2O, 0,6 mL de glucose à 40 %, 70 μL de 10 mM de thiamine et_2,5mL de 100 mM de L-dopa (stérilisée par filtre) à la gélose liquide.
   3. Verser 15 mL du mélange dans des boîtes de Petri, les laisser sécher pendant environ 1 h dans l’obscurité et conserver entre 2 et 4 °C jusqu’à 1 semaine. Assurez-vous que les couvercles sont partiellement soulevés pour que la gélose sèche correctement.
2. Inoculer 5 mL de milieu YNB avec 50 μL de culture de C. neoformans à partir de l’étape 4.1. Incuber pendant 16-18 h à 30 °C et 200 rpm.
3. Faire tourner les cellules à 1 000 × g pendant 5 min à 4 °C. Lavez les cellules 2x avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile à pH 7,4.
4. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Resuspendre les cellules dans 1 mL de PBS pour atteindre une concentration finale de 10⁶ cellules/mL.
5. Préparer une série de dilution (p. ex. double) des extraits bruts et clarifiés de mollusques. De même, préparer une série de dilution de 10 fois de cellules de C. neoformans (étape 5.4) de 1 x 10⁶ cellules/mL à 1 x 10¹ cellules/mL en utilisant du PBS stérile dans des plaques à 96 puits.
6. Étaler 200 μL des extraits sur des plaques de Petri contenant de la gélose L-DOPA à l’aide d’un écouvillon et les laisser sécher pendant 15 min.
7. Repérer 5 μL de culture de chaque puits sur la plaque de L-DOPA, en laissant 1 cm entre les gouttes. Laissez sécher dans le noir pendant 15 min.
8. Incuber les plaques à 30 °C et 37 °C dans un incubateur statique pendant 3 à 5 jours, en capturant des images toutes les 24 heures à l’aide d’une caméra ou d’un imageur de plaques (p. ex., un scanner).
   NOTE: Deux conditions de température sont utilisées ici pour explorer l’influence de la température sur les effets inhibiteurs de croissance des extraits de mollusques, avec 30 ° C représentant l’environnement et 37 ° C représentant les températures physiologiques humaines.

6. Effet des extraits de mollusques sur la production de capsules polysaccharidiques de C. neoformans

1. Préparer un milieu à faible teneur en fer (MFR) comme décrit ci-dessous.
   1. Dissoudre 5 g de résine chélatant (voir le tableau des matériaux) dans 60 mL d’eau ultrapure et emballer dans une colonne de verre (2 cm de diamètre x 25 cm de longueur). Lavez la colonne avec 100 ml d’eau et jetez l’eau recueillie.
   2. Préparer de l’eau à faible teneur en fer (eau LI) en faisant passer 2 L d’eau ultrapure stérile à travers la colonne chélatante. Conservez l’eau LI à 4 °C jusqu’à 3 mois.
   3. Dissoudre 5 g de glucose dans 100 mL d’eau LI. Dissoudre 5 g de L-asparagine dans 200 mL d’eau LI dans un bécher séparé.
   4. Ajouter ce qui suit à 500 mL d’eau LI dans l’ordre : 4,78 g de HEPES, 0,4 g de K2HPO₄, 0,08 g de MgSO4.7H2O, 1,85 g de NaHCO3 et 0,25 g de CaCl 2.2H2O.
   5. Combinez les solutions de l’étape 6.1.3 et de l’étape 6.1.4. Ajouter 1 mL de sel de sodium (BPS) d’acide bathophénantthrolinedisulfonique de 100 mM jusqu’à une concentration finale de 100 μM.
   6. Ajuster le pH à 7,2 avec 1 M LI-MOPS. Ajouter de l’eau LI à un volume final de 1 L et filtrer - stériliser le milieu en le faisant passer à travers une membrane de 0,22 μm. Ajouter 100 μL de thiamine stérile (4 mg/mL) au milieu.
2. Inoculer 5 mL de milieu YNB avec 50 μL de culture de C. neoformans à partir de l’étape 4.1. Incuber pendant 16-18 h à 30 °C et 200 rpm. Utilisez cette culture pour inoculer 5 mL de MFR à une concentration finale de 10^{à 5} cellules/mL.
3. Ajouter les volumes appropriés d’extraits de mollusques (par exemple, une double dilution ou le volume déterminé à partir d’essais de virulence précédents) pour atteindre les concentrations souhaitées. Incuber pendant 72 h à 37 °C et 200 tr/min avec des bouchons desserrés. Après l’incubation, prélever 1 mL de cellules et en laver 2x avec du PBS stérile, pH 7,4, à 1 500 × g pendant 2 min à 4 °C.
4. Remettez doucement les cellules en suspension dans 1 mL de PBS. Mélanger les cellules avec de l’encre de Chine à un rapport de 1:1 (p. ex., 4 μL d’encre de Chine avec 4 μL de suspension cellulaire) sur une lame de microscope en verre. Placez un bordereau sur le dessus de la glissière.
5. Visualisez les échantillons à l’aide d’un microscope à contraste interférentiel différentiel (CIV) avec un objectif d’huile 63x (voir le tableau des matériaux). Réglez le contraste sur automatique et effectuez la mise au point manuellement à l’aide du cadran du microscope. Sélectionnez toutes les images et exportez-les au format TIFF. Aucun filtre ne doit être appliqué.
6. À l’aide de l’outil de règle d’ImageJ²⁰, quantifiez le rapport entre la taille totale de la cellule (y compris la capsule) et la taille du corps cellulaire.

7. Effet des extraits de mollusques sur la production de biofilm de C. neoformans

1. Inoculer 5 mL de milieu YNB avec 50 μL de culture de C. neoformans à partir de l’étape 4.1. Incuber pendant 16-18 h à 30 °C et 200 rpm.
2. Prélever les cellules de la culture de 5 mL. Laver les cellules avec du PBS stérile, pH 7,4, à 1 500 × g pendant 2 min à 4 °C.
3. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Resuspendre les cellules dans 3 mL du milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco jusqu’à une concentration finale de 10⁷ cellules/mL.
4. Transférer 300 μL de la suspension cellulaire dans les puits individuels d’une plaque stérile de polystyrène à fond plat de 24 puits. Utilisez des puits avec des milieux uniquement comme témoin.
5. Ajouter les volumes appropriés d’extraits de mollusques (p. ex., une double dilution ou le volume déterminé à partir d’essais de virulence antérieurs) pour atteindre une concentration finale de 10 à 20 μg/mL de protéines. Assurez-vous que le volume d’extrait ne dépasse pas 10 % du volume total.
6. Envelopper les plaques avec du papier d’aluminium (pour éviter l’évaporation du milieu) et incuber pendant 48 h à l’aide d’un incubateur statique à 30 °C et 37 °C.
7. À l’aide d’une bouteille ou d’un distributeur, lavez les puits 2x avec de l’eau stérile et laissez-les sécher à l’air libre pendant 10-15 minutes à température ambiante. Ensuite, ajouter 100 μL de solution de cristal violet à 0,3 % à chaque puits (y compris les puits témoins de milieu seulement) et incuber à température ambiante pendant 10 minutes.
8. Lavez soigneusement les puits 3x avec de l’eau stérile (les biofilms ne seront pas perturbés pendant le lavage). Ajouter 200 μL d’éthanol à 100 % et incuber pendant 10 min à TA.
9. Transférer 75 μL dans une nouvelle plaque à fond plat de 96 puits et lire le OD₅₅₀. Quantifier la formation du biofilm comme suit : (DO 550 nm de l’échantillon - DO_{550 nm} de blanc).

Résultats

Le flux de travail décrit ici permet d’isoler des protéines et des peptides de mollusques ayant des propriétés anti-virulence potentielles contre C. neoformans. De même, l’évaluation de différentes formes d’extraits (bruts et clarifiés) permet la semi-purification des composés actifs potentiels et appuie l’évaluation en aval (p. ex. protéomique basée sur la spectrométrie de masse). En règle générale, le flux de travail d’extraction des protéines produit des solutions homogénéisées a...

Discussion

Le protocole d’extraction décrit ici décrit l’isolement de composés de mollusques prélevés en Ontario, au Canada, et démontre une nouvelle étude sur l’utilisation d’extraits de mollusques contre l’agent pathogène fongique humain, C. neoformans. Ce protocole s’ajoute à un nombre croissant de recherches sur l’activité des inhibiteurs de la peptidase chez les invertébrés¹³. Au cours de l’extraction, certains échantillons d’extraits étaient difficiles à filtre...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Filters	VWR	28145-477 (North America)
1.5 mL Tubes (Safe-Lock)	Eppendorf	0030120086
2 mL Tubes (Safe-Lock)	Eppendorf	0030120094
3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA)	Sigma-Aldrich	D9628-5G	CAS #: 59-92-7
96-well plates	Costar (Corning)	3370
Bullet Blender Storm 24	NEXT ADVANCE	BBY24M
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428000010
Chelex 100 Resin	BioRad	142-1253
CO2 Incubator (Static)	SANYO	Not available
Cryptococcus neoformans H99	ATCC	208821
DIC Microscope	Olympus
DIC Microscope software	Zeiss
DMEM	Corning	10-013-CV
Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade)	BioShop	GLU501	CAS #: 50-99-7
Glycine	Fisher Chemical	G46-1	CAS #: 56-40-6
GraphPad Prism 9	Dotmatics
Hemocytometer	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O)	Honeywell	M1880-500G	CAS #: 10034-99-8
Peptone	BioShop	PEP403
Phosohate buffer salt pH 7.4	BioShop	PBS408	SKU: PBS408.500
Plate reader (Synergy-H1)	BioTek (Agilent)	Not available
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Fisher Chemical	P285-500	CAS #: 7778-77-0
Subtilisin A	Sigma-Aldrich	P4860	CAS #: 9014-01-01
Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide	Sigma-Aldrich	573462	CAS #: 70967-97-4
Thermal bath	VWR	76308-834
Thiamine Hydrochloride	Fisher-Bioreagents	BP892-100	CAS #: 67-03-8
Yeast extract	BioShop	YEX401	CAS #: 8013-01-2
Yeast nitrogen base (with Amino Acids)	Sigma-Aldrich	Y1250-250G	YNB