Valutazione delle presunte proprietà anticriptococco degli estratti grezzi e chiarificati dai molluschi

Riepilogo

Il patogeno fungino umano Cryptococcus neoformans produce una varietà di fattori di virulenza (ad esempio, peptidasi) per promuovere la sua sopravvivenza all'interno dell'ospite. Le nicchie ambientali rappresentano una fonte promettente di nuovi inibitori naturali della peptidasi. Questo protocollo delinea la preparazione di estratti di molluschi e la valutazione del loro effetto sulla produzione di fattori di virulenza fungini.

Abstract

Cryptococcus neoformans è un patogeno fungino umano incapsulato con una distribuzione globale che infetta principalmente individui immunocompromessi. L'uso diffuso di antifungini in ambito clinico, il loro uso in agricoltura e l'ibridazione del ceppo hanno portato ad una maggiore evoluzione della resistenza. Questo crescente tasso di resistenza contro gli antimicotici è una preoccupazione crescente tra i medici e gli scienziati di tutto il mondo, e vi è una maggiore urgenza di sviluppare nuove terapie antifungine. Ad esempio, C. neoformans produce diversi fattori di virulenza, inclusi enzimi intra ed extracellulari (ad esempio, peptidasi) con ruoli nella degradazione dei tessuti, nella regolazione cellulare e nell'acquisizione di nutrienti. L'interruzione di tale attività della peptidasi da parte degli inibitori perturba la crescita e la proliferazione dei funghi, suggerendo che questa potrebbe essere una strategia importante per combattere l'agente patogeno. È importante sottolineare che gli invertebrati come i molluschi producono inibitori della peptidasi con applicazioni biomediche e attività antimicrobica, ma sono poco esplorati in termini di utilizzo contro i patogeni fungini. In questo protocollo, è stata eseguita un'estrazione globale dai molluschi per isolare potenziali inibitori della peptidasi in estratti grezzi e chiarificati e sono stati valutati i loro effetti contro i classici fattori di virulenza criptococcica. Questo metodo supporta la prioritizzazione dei molluschi con proprietà antifungine e offre opportunità per la scoperta di agenti anti-virulenza sfruttando gli inibitori naturali presenti nei molluschi.

Introduzione

Cryptococcus neoformans è un patogeno fungino umano che produce una malattia grave negli ospiti immunocompromessi, come gli individui che vivono con l'HIV / AIDS¹, e porta a circa il 19% dei decessi correlati all'AIDS². Il fungo è suscettibile a diverse classi di antimicotici, tra cui azoli, polieni e flucitosina, che esercitano attività fungicida e fungistatica utilizzando meccanismi distinti ^3,4. Tuttavia, l'uso estensivo di antifungini in ambito clinico e agricolo combinato con l'ibridazione del ceppo ha amplificato l'evoluzione della resistenza in più specie fungine, tra cui C. neoformans⁵.

Per superare le sfide della resistenza antifungina e ridurre la prevalenza delle infezioni fungine su scala globale, un approccio promettente è quello di utilizzare i fattori di virulenza di Cryptococcus spp. (ad esempio, adattabilità alla temperatura, capsula di polisaccaridi, melanina ed enzimi extracellulari) come potenziali bersagli terapeutici ^4,6 . Questo approccio ha diversi vantaggi, in quanto questi fattori di virulenza sono ben caratterizzati in letteratura e il targeting di questi fattori potrebbe potenzialmente ridurre i tassi di resistenza antifungina imponendo una pressione selettiva più debole attraverso la compromissione della virulenza piuttosto che mirare alla crescita cellulare⁶. In questo contesto, numerosi studi hanno valutato la possibilità di colpire enzimi extracellulari (ad esempio, proteasi, peptidasi) per ridurre o inibire la virulenza di Cryptococcus spp.7,8,9.

Organismi come invertebrati e piante non possiedono un sistema immunitario adattativo per proteggersi dagli agenti patogeni. Tuttavia, si basano su un forte sistema immunitario innato con una vasta gamma di composti chimici per affrontare microrganismi e predatori¹⁰. Queste molecole includono gli inibitori della peptidasi, che svolgono ruoli importanti in molti sistemi biologici, compresi i processi cellulari dell'immunità degli invertebrati, come la coagulazione dell'emolinfa, la sintesi di citochine e peptidi antimicrobici e la protezione degli ospiti inattivando direttamente le proteasi dei patogeni¹¹. Pertanto, gli inibitori della peptidasi da invertebrati come i molluschi possiedono potenziali applicazioni biomediche, ma molti rimangono non caratterizzati^10,12,13. In questo contesto, ci sono circa 34 specie di molluschi terrestri in Ontario e 180 molluschi d'acqua dolce in Canada¹⁴. Tuttavia, la loro profilazione approfondita e la caratterizzazione sono ancora limitate¹⁵. Questi organismi rappresentano un'opportunità per l'identificazione di nuovi composti con potenziale attività antifungina¹⁰.

In questo protocollo, vengono descritti metodi per isolare e chiarire estratti da invertebrati (ad esempio, molluschi) (Figura 1) seguiti dalla misurazione della presunta attività inibitoria della peptidasi. Le proprietà antifungine di questi estratti vengono quindi valutate misurando il loro impatto sulla produzione del fattore di virulenza di C. neoformans utilizzando saggi fenotipici (Figura 2). È importante notare che le differenze nelle proprietà antifungine tra estratti grezzi e chiarificati possono essere indicative di fattori microbici (ad esempio, metaboliti secondari o tossine prodotte dal microbioma ospite) del mollusco, che possono influenzare le osservazioni sperimentali. Tali risultati supportano la necessità che questo protocollo valuti sia gli estratti grezzi che quelli chiarificati in modo indipendente per svelare le modalità di azione. Inoltre, il processo di estrazione è imparziale e può consentire il rilevamento di proprietà antimicrobiche contro una pletora di agenti patogeni fungini e batterici. Pertanto, questo protocollo fornisce un punto di partenza per la prioritizzazione delle specie di molluschi con proprietà antifungine contro C. neoformans e l'opportunità di valutare le connessioni tra attività enzimatica e produzione di fattori di virulenza attraverso meccanismi inibitori putativi.

Protocollo

1. Estrazione di proteine dai molluschi

1. Raccogli molluschi da un'area naturale designata e approvata (ad esempio, Speed River, Guelph, Ontario). Per questo studio, sono state selezionate sia specie autoctone che invasive per valutare un'ampia gamma di potenziali effetti antifungini.
2. Rompere delicatamente il guscio dei molluschi (ad esempio, Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi e Cipangopaludina chinensis) usando un pestello e un mortaio e rimuovere i pezzi solidi con un paio di pinzette. Generalmente, 10 molluschi sono raggruppati per l'uso in tutto il protocollo.
3. Raccogliere e pesare gli organi. Circa 15-20 g di campione sono ottimali. Usa le forbici per tagliare gli organi in piccoli pezzi di circa 0,5-1 cm.
4. Congelare i campioni di organi sezionati e tagliati con azoto liquido. Quindi, macinare i campioni di organo in una polvere fine usando un pestello e un mortaio.
5. Aggiungere la polvere del campione d'organo (circa 15 g) in 30 ml di acqua distillata fredda (4 °C) per ottenere un rapporto 1:2 (p/v).
6. Versare 2 mL del campione in provette da 2 mL ad alto impatto. Aggiungere un misurino di perle di acciaio inossidabile da 3 mm (circa 500 μg) a ciascun tubo e omogeneizzare con un frullatore (vedi Tabella dei materiali) per 3 minuti a 1.200 giri/min e 4 °C.
7. Centrifugare a 12.000 × g per 20 minuti a 4 °C. Raccogliere tutti i surnatanti con una pipetta in un tubo fresco da 50 ml, scartando il pellet.
8. Filtrare-sterilizzare il surnatante utilizzando una membrana da 0,22 μm. Conservare i campioni su ghiaccio e procedere al protocollo di chiarificazione (sezione 2), a seconda dei casi.
   NOTA: I campioni possono essere congelati in azoto liquido e conservati a -20 °C per essere utilizzati come estratti grezzi.

2. Chiarificazione dell'estratto di mollusco

1. Porre il campione surnatante del punto 1.8 in un bagno termale a 60 °C per 30 minuti. Quindi, raffreddare rapidamente i campioni trasferendoli in un secchio con ghiaccio per 20 minuti.
2. Centrifugare i campioni a 15.000 × g per 45 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco da 50 ml e scartare il pellet. Filtrare e sterilizzare i campioni utilizzando un filtro a membrana da 0,22 μm, quindi conservarli su ghiaccio.
3. Determinare la concentrazione proteica nei campioni dalla fase 1.8 (cioè l'estratto grezzo) e dalla fase 2.2 (cioè l'estratto chiarificato) utilizzando un saggio di quantificazione (ad esempio, saggio dell'acido bicinconinico¹⁷). L'intervallo di concentrazione proteica ottimale è 4-8 mg / ml.
4. Conservare i campioni su ghiaccio per un massimo di 1 ora o congelarli in azoto liquido e conservarli a -20 °C fino al momento del bisogno.

3. Saggio dell'attività inibitoria

1. Misurare l'attività inibitoria degli estratti grezzi e chiarificati utilizzando saggi enzimatici in triplice triplice tecnica.
   NOTA: Ogni saggio enzimatico è costituito da un enzima (ad esempio, subtilisina A, che è coinvolto nella virulenza fungina 16,17,18; di solito circa 1 x ¹⁰⁻⁹ mol/L per i saggi a base cromogenica), un tampone e un substrato. La reazione inizia quando il substrato incontra l'enzima. L'attività enzimatica è proporzionale alla velocità di conversione del substrato nel prodotto.
2. Valutare l'effetto della concentrazione enzimatica (EC) sull'attività enzimatica (EA) fino ad ottenere una dipendenza lineare tra i due parametri. Per i passaggi successivi, utilizzare una concentrazione enzimatica all'interno dell'intervallo lineare misurato.
   NOTA: Il saggio enzimatico per la peptidasi subtilisina A è dettagliato nei seguenti passaggi.
3. Incubare gli estratti proteici grezzi (fase 1.11) o chiarificati (fase 2.5) (ad esempio, 10 μL contenenti 4 mg/ml di proteine) con 10 μL di subtilisina A (concentrazione determinata dalla fase 3.2) e 220 μL di 100 mM di Tris-HCl a pH 8,6 (per il controllo, aggiungere 230 μL di tampone Tris senza aggiungere l'estratto) per 10 minuti a 25 °C in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti.
4. Aggiungere 10 μL di N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide, il substrato della subtilisina A, ad una concentrazione finale di 1 K m (costante di Michaelis-Menten; 0,2_mM per questo substrato con subtilisina A) per un volume di reazione finale di 250 μL.
5. Misurare l'attività enzimatica monitorando l'aspetto del prodotto nel tempo leggendo la densità ottica (OD) a 405 nm ogni 15 s per 3 min.
6. Determinare l'attività enzimatica residua calcolando il rapporto tra l'attività enzimatica in presenza dell'estratto di mollusco e quella in assenza dell'estratto.
7. Se si osserva attività inibitoria (cioè attività residua inferiore a 1), misurare il valore della concentrazione inibitoria 50 (IC₅₀) utilizzando un intervallo di concentrazioni degli estratti (ad esempio, una serie di diluizione doppia da 200 μg/ml a 1 μg/ml) seguendo i metodi standard¹⁹.

4. Effetto degli estratti di molluschi sulla crescita di C. neoformans

1. Utilizzare una punta di pipetta da 10 μL per introdurre una singola colonia di C. neoformans var. grubii H99 wild-type (WT) in 5 mL di estratto di lievito-peptone-destrosio (YPD) medio (10 g/L di estratto di lievito, 20 g/L peptone e 20 g/L di destrosio, pH 6,5), e incubare per 16-18 ore a 30 °C e 200 giri/min. Eseguire l'esperimento in triplice copia biologica e duplicato tecnico.
2. Raccogliere 500 μL della coltura in una cuvetta e misurare la crescita leggendo l'OD a 600 nm. Diluire la coltura con terreno di azoto base di lievito (YNB) fino a un OD₆₀₀ finale di 0,02.
3. Co-coltura di cellule C. neoformans con diverse concentrazioni (ad esempio, una triplice serie di diluizione da 440 μg / mL a 15 μg / mL di proteine) degli estratti (cioè grezzi e chiarificati). Per fare questo, mescolare 10 μL degli estratti con 190 μL della coltura diluita di C. neoformans (fase 4.2) in una piastra da 96 pozzetti.
4. Misurare la crescita leggendo l'OD 600 utilizzando un lettore di piastre ogni 15 minuti a 1 ora per 72 h a₂₀₀ rpm e 37 °C.

5. Effetto degli estratti di mollusco sulla produzione di melanina C. neoformans

1. Preparare piastre di L-3,4-diidrossifenilalanina (L-DOPA).
   1. Autoclavare 230 mL di agar da 14 g/L e lasciarlo raffreddare fino a 50-60 °C.
   2. Aggiungere 3,25 mL di 1 M glicina, 7,35 mL di 1 M KH 2 PO 4, 2,5 mL di 1 M MgSO_4,7H 2 O, 0,6 mL di glucosio al 40%, 70 μL di 10 mM di tiamina e_2,5mL di 100 mM L-DOPA (sterilizzato con filtro) all'agar liquido.
   3. Versare 15 ml della miscela in piastre di Petri, lasciarle asciugare per circa 1 ora al buio e conservare a 2-4 °C per un massimo di 1 settimana. Assicurarsi che i coperchi siano parzialmente sollevati affinché l'agar si asciughi correttamente.
2. Inoculare 5 mL di terreno YNB con 50 μL di coltura neoformans di C . dal punto 4.1. Incubare per 16-18 h a 30 °C e 200 giri/min.
3. Centrifugare le cellule a 1.000 × g per 5 minuti a 4 °C. Lavare le cellule 2 volte con soluzione salina sterile tamponata fosfato (PBS) a pH 7,4.
4. Contare le cellule usando un emocitometro. Risospendere le cellule in 1 mL di PBS per raggiungere una concentrazione finale di 10⁶ cellule/ml.
5. Preparare una serie di diluizioni (ad esempio, doppia) degli estratti di mollusco grezzi e chiarificati. Allo stesso modo, preparare una serie di diluizione di 10 volte di cellule C. neoformans (fase 5.4) da 1 x 10⁶ cellule / ml a 1 x 10^{1 cellule /} ml usando PBS sterile in piastre da 96 pozzetti.
6. Distribuire 200 μL degli estratti su piastre di Petri contenenti agar L-DOPA utilizzando un tampone e lasciarli asciugare per 15 minuti.
7. Spot 5 μL di coltura da ciascun pozzetto sulla piastra di L-DOPA, lasciando 1 cm tra le gocce. Lasciare asciugare al buio per 15 minuti.
8. Incubare le lastre a 30 °C e 37 °C in un incubatore statico per 3-5 giorni, catturando immagini ogni 24 ore con una fotocamera o un fotografo (ad esempio, scanner).
   NOTA: Qui vengono utilizzate due condizioni di temperatura per esplorare l'influenza della temperatura sugli effetti inibitori della crescita degli estratti di mollusco, con 30 °C che rappresentano le temperature ambientali e 37 °C che rappresentano le temperature fisiologiche umane.

6. Effetto degli estratti di mollusco sulla produzione di capsule polisaccaridiche di C. neoformans

1. Preparare il mezzo a basso contenuto di ferro (LIM) come descritto di seguito.
   1. Sciogliere 5 g di resina chelante (vedi Tabella dei materiali) in 60 ml di acqua ultrapura e imballare in una colonna di vetro (2 cm di diametro x 25 cm di lunghezza). Lavare la colonna con 100 ml di acqua e gettare l'acqua raccolta.
   2. Preparare acqua a basso contenuto di ferro (LI-water) facendo passare 2 L di acqua ultrapura sterile attraverso la colonna chelante. Conservare l'acqua LI a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
   3. Sciogliere 5 g di glucosio in 100 ml di LI-acqua. Sciogliere 5 g di L-asparagina in 200 mL di LI-acqua in un becher separato.
   4. Aggiungere quanto segue a 500 ml di LI-acqua in ordine: 4,78 g di HEPES, 0,4 g di K 2 HPO 4,0,08 g di MgSO_4,7H 2 O, 1,85 g di NaHCO₃ e 0,25 g di CaCl 2,2H ₂ O.
   5. Combinare le soluzioni del punto 6.1.3 e del passaggio 6.1.4. Aggiungere 1 mL di sale sodico (BPS) dell'acido batofenantropolinedisolfonico da 100 mM ad una concentrazione finale di 100 μM.
   6. Regolare il pH a 7,2 con 1 M LI-MOPS. Aggiungere acqua LIO a un volume finale di 1 L e filtrare: sterilizzare il mezzo facendolo passare attraverso una membrana da 0,22 μm. Aggiungere 100 μL di tiamina sterile (4 mg/ml) al substrato.
2. Inoculare 5 ml di terreno YNB con 50 μL di coltura neoformans di C . dal punto 4.1. Incubare per 16-18 h a 30 °C e 200 giri/min. Utilizzare questa coltura per inoculare 5 ml di LIM ad una concentrazione finale di 10⁵ cellule/ml.
3. Aggiungere volumi appropriati degli estratti di mollusco (ad esempio, una doppia diluizione o il volume determinato da precedenti saggi di virulenza) per raggiungere le concentrazioni desiderate. Incubare per 72 h a 37 °C e 200 giri/min con tappi allentati. Dopo l'incubazione, raccogliere 1 mL di cellule e lavarne 2 volte con PBS sterile, pH 7,4, a 1.500 × g per 2 minuti a 4 °C.
4. Risospendere delicatamente le cellule in 1 mL di PBS. Mescolare le cellule con inchiostro indiano in rapporto 1: 1 (ad esempio, 4 μL di inchiostro indiano con 4 μL di sospensione cellulare) su un vetrino da microscopio. Posizionare un coprivetrino sulla parte superiore della diapositiva.
5. Visualizza i campioni utilizzando un microscopio a contrasto di interferenza differenziale (DIC) con un obiettivo dell'olio 63x (vedi Tabella dei materiali). Impostare il contrasto su automatico e mettere a fuoco manualmente utilizzando il quadrante del microscopio. Selezionare tutte le immagini ed esportarle in formato TIFF. Non è necessario applicare filtri.
6. Utilizzando lo strumento righello in ImageJ²⁰, quantificare il rapporto tra la dimensione totale della cella (inclusa la capsula) e la dimensione del corpo della cella.

7. Effetto degli estratti di mollusco sulla produzione di biofilm di C. neoformans

1. Inoculare 5 mL di terreno YNB con 50 μL di coltura neoformans di C . dal punto 4.1. Incubare per 16-18 h a 30 °C e 200 giri/min.
2. Raccogliere cellule dalla coltura da 5 ml. Lavare le cellule con PBS sterile, pH 7,4, a 1.500 × g per 2 minuti a 4 °C.
3. Contare le cellule usando un emocitometro. Risospendere le cellule in 3 ml di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco ad una concentrazione finale di 10⁷ cellule/ml.
4. Trasferire 300 μL della sospensione cellulare nei singoli pozzetti di una piastra sterile, in polistirene, a fondo piatto a 24 pozzetti. Utilizzare i pozzetti con i supporti solo come controllo.
5. Aggiungere volumi appropriati degli estratti di mollusco (ad esempio, una doppia diluizione o il volume determinato da precedenti test di virulenza) per raggiungere una concentrazione finale di 10-20 μg/mL di proteine. Assicurarsi che il volume di estrazione non sia superiore al 10% del volume totale.
6. Avvolgere le piastre con un foglio di alluminio (per evitare l'evaporazione del fluido) e incubare per 48 ore utilizzando un incubatore statico a 30 °C e 37 °C.
7. Utilizzando una bottiglia o un dosatore, lavare i pozzetti 2 volte con acqua sterile e lasciarli asciugare all'aria per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 100 μL di soluzione viola cristallina allo 0,3% a ciascun pozzetto (compresi i pozzetti di controllo solo medi) e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
8. Lavare accuratamente i pozzetti 3 volte con acqua sterile (i biofilm non saranno interrotti durante il lavaggio). Aggiungere 200 μL di etanolo al 100% e incubare per 10 minuti a RT.
9. Trasferire 75 μL su una nuova piastra a fondo piatto a 96 pozzetti e leggere l'OD₅₅₀. Quantificare la formazione del biofilm come (OD 550nm di campione - OD_550nm di bianco).

Risultati

Il flusso di lavoro qui descritto consente l'isolamento di proteine e peptidi da molluschi con potenziali proprietà anti-virulenza contro C. neoformans. Allo stesso modo, la valutazione di diverse forme di estratti (cioè grezzi e chiarificati) consente la semi-purificazione dei potenziali composti attivi e supporta la valutazione a valle (ad esempio, proteomica basata sulla spettrometria di massa). Tipicamente, il flusso di lavoro di estrazione delle proteine produce soluzioni omogeneizzate con concentrazioni ...

Discussione

Il protocollo di estrazione qui descritto delinea l'isolamento di composti da molluschi raccolti dall'Ontario, in Canada, e dimostra una nuova indagine sull'uso di estratti di molluschi contro il patogeno fungino umano, C. neoformans. Questo protocollo si aggiunge a un crescente corpo di ricerca che studia l'attività degli inibitori della peptidasi dagli invertebrati¹³. Durante l'estrazione, alcuni campioni di estratto erano difficili da filtrare-sterilizzare, probabilmente a causa della...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Filters	VWR	28145-477 (North America)
1.5 mL Tubes (Safe-Lock)	Eppendorf	0030120086
2 mL Tubes (Safe-Lock)	Eppendorf	0030120094
3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA)	Sigma-Aldrich	D9628-5G	CAS #: 59-92-7
96-well plates	Costar (Corning)	3370
Bullet Blender Storm 24	NEXT ADVANCE	BBY24M
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428000010
Chelex 100 Resin	BioRad	142-1253
CO2 Incubator (Static)	SANYO	Not available
Cryptococcus neoformans H99	ATCC	208821
DIC Microscope	Olympus
DIC Microscope software	Zeiss
DMEM	Corning	10-013-CV
Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade)	BioShop	GLU501	CAS #: 50-99-7
Glycine	Fisher Chemical	G46-1	CAS #: 56-40-6
GraphPad Prism 9	Dotmatics
Hemocytometer	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O)	Honeywell	M1880-500G	CAS #: 10034-99-8
Peptone	BioShop	PEP403
Phosohate buffer salt pH 7.4	BioShop	PBS408	SKU: PBS408.500
Plate reader (Synergy-H1)	BioTek (Agilent)	Not available
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Fisher Chemical	P285-500	CAS #: 7778-77-0
Subtilisin A	Sigma-Aldrich	P4860	CAS #: 9014-01-01
Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide	Sigma-Aldrich	573462	CAS #: 70967-97-4
Thermal bath	VWR	76308-834
Thiamine Hydrochloride	Fisher-Bioreagents	BP892-100	CAS #: 67-03-8
Yeast extract	BioShop	YEX401	CAS #: 8013-01-2
Yeast nitrogen base (with Amino Acids)	Sigma-Aldrich	Y1250-250G	YNB