軟体動物からの粗および清澄抽出物の推定抗クリプトコッカス特性の評価

要約

ヒト真菌病原体クリプ トコッカス・ネオフォルマンスは 、宿主内での生存を促進するために様々な病原性因子(例えば、ペプチダーゼ)を産生する。環境ニッチは、新規天然ペプチダーゼ阻害剤の有望な供給源です。このプロトコルは、軟体動物からの抽出物の調製と真菌病原性因子産生に対するそれらの効果の評価を概説しています。

要約

クリプトコッカスネオフォルマンスは 、主に免疫不全の個人に感染する世界的な分布を持つカプセル化されたヒト真菌病原体です。臨床現場での抗真菌剤の広範な使用、農業での使用、および株のハイブリダイゼーションにより、耐性の進化が進んでいます。抗真菌剤に対する耐性のこの上昇率は、世界中の臨床医や科学者の間で懸念が高まっており、新しい抗真菌療法を開発する緊急性が高まっています。例えば、 C. neoformans は、組織分解、細胞調節、および栄養素獲得に関与する細胞内および細胞外の酵素(ペプチダーゼなど)を含むいくつかの病原性因子を産生します。阻害剤によるこのようなペプチダーゼ活性の破壊は、真菌の増殖と増殖を阻害し、これが病原体と戦うための重要な戦略である可能性があることを示唆しています。重要なことに、軟体動物などの無脊椎動物は、生物医学的用途と抗菌活性を備えたペプチダーゼ阻害剤を産生しますが、真菌病原体に対する使用法に関しては未調査です。このプロトコルでは、軟体動物からの全体的な抽出を実施して、粗抽出物および清澄抽出物中の潜在的なペプチダーゼ阻害剤を分離し、古典的なクリプトコッカス病原性因子に対するそれらの効果を評価しました。この方法は、抗真菌特性を持つ軟体動物の優先順位付けをサポートし、軟体動物に見られる天然の阻害剤を利用することにより、抗病原性剤の発見の機会を提供します。

概要

クリプトコッカス・ネオフォルマンスは、HIV/AIDS陽性者などの免疫不全宿主に重篤な疾患を引き起こすヒト真菌病原体^であり1、エイズ関連の死亡の約19%につながります²。真菌は、アゾール、ポリエン、フルシトシンを含むいくつかのクラスの抗真菌剤の影響を受けやすく、これらは異なるメカニズムを使用して殺菌および静真菌活性を発揮します^3,4。しかし、臨床および農業現場での抗真菌剤の広範な使用と株のハイブリダイゼーションの組み合わせにより、C. neoformans⁵を含む複数の真菌種における耐性の進化が増幅されました。

抗真菌耐性の課題を克服し、世界規模で真菌感染症の有病率を減らすために、有望なアプローチは、クリプトコッカス属の病原性因子(温度適応性、多糖カプセル、メラニン、細胞外酵素など)を潜在的な治療標的として使用することです^4,6。.これらの病原性因子は文献で十分に特徴付けられており、これら....

プロトコル

1.軟体動物からのタンパク質抽出

1. 指定および承認された自然地域(オンタリオ州グエルフのスピードリバーなど)から軟体動物を収集します。この研究では、在来種と侵入種の両方を選択して、幅広い潜在的な抗真菌効果を評価しました。
2. 乳棒と乳鉢を使用して軟体動物の殻(例: Cepaea nemoralis、 Planorbella pilsbryi 、 Cipangopaludina chinensis)をそっと破り、ピンセットで固形片を取り除きます。一般に、10匹の軟体動物は、プロトコル全体で使用するためにプールされます。
3. 臓器を集めて計量します。約15〜20 gのサンプルが最適です。はさみを使用して、臓器を約0.5〜1 cmの大きさの小片に切ります。
4. 解剖および切断した臓器サンプルを液体窒素でフラッシュフリーズします。次に、乳棒と乳鉢を使用して臓器サンプルを微粉末に粉砕します。
5. 臓器サンプル粉末(約15 g)を30 mLの冷蒸留水(4°C)に加えて、1:2の比率(w / v)にします。
6. 2 mLのサンプルを耐衝撃性2 mLチューブに注ぎます。各チューブに3 mmのステンレス鋼ビーズ(約500 μg)をスクープし、ブレンダー( 材料表を参照)を使用して1,200 rpmおよび4°Cで3分間ホモジナイズしま....

結果

本明細書に記載されるワークフローは、C.ネオフォルマンスに対する潜在的な抗毒性特性を有する軟体動物からのタンパク質およびペプチドの単離を可能にする。同様に、さまざまな形態の抽出物(すなわち、粗抽出物および清澄化抽出物)を評価することで、潜在的な活性化合物の半精製が可能になり、下流の評価(質量分析ベースのプロテオミクスなど)がサポートされます。通常、タ?.......

ディスカッション

ここで説明する抽出プロトコルは、カナダのオンタリオ州から収集された軟体動物からの化合物の分離の概要を説明し、ヒト真菌病原体である C.neoformansに対して軟体動物抽出物を使用する新しい調査を示しています。このプロトコルは、無脊椎動物からのペプチダーゼ阻害剤活性を調査する研究の増加に追加されます¹³。抽出中、一部の抽出物サンプルは、おそらく?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Filters	VWR	28145-477 (North America)
1.5 mL Tubes (Safe-Lock)	Eppendorf	0030120086
2 mL Tubes (Safe-Lock)	Eppendorf	0030120094
3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA)	Sigma-Aldrich	D9628-5G	CAS #: 59-92-7
96-well plates	Costar (Corning)	3370
Bullet Blender Storm 24	NEXT ADVANCE	BBY24M
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428000010
Chelex 100 Resin	BioRad	142-1253
CO2 Incubator (Static)	SANYO	Not available
Cryptococcus neoformans H99	ATCC	208821
DIC Microscope	Olympus
DIC Microscope software	Zeiss
DMEM	Corning	10-013-CV
Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade)	BioShop	GLU501	CAS #: 50-99-7
Glycine	Fisher Chemical	G46-1	CAS #: 56-40-6
GraphPad Prism 9	Dotmatics
Hemocytometer	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O)	Honeywell	M1880-500G	CAS #: 10034-99-8
Peptone	BioShop	PEP403
Phosohate buffer salt pH 7.4	BioShop	PBS408	SKU: PBS408.500
Plate reader (Synergy-H1)	BioTek (Agilent)	Not available
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Fisher Chemical	P285-500	CAS #: 7778-77-0
Subtilisin A	Sigma-Aldrich	P4860	CAS #: 9014-01-01
Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide	Sigma-Aldrich	573462	CAS #: 70967-97-4
Thermal bath	VWR	76308-834
Thiamine Hydrochloride	Fisher-Bioreagents	BP892-100	CAS #: 67-03-8
Yeast extract	BioShop	YEX401	CAS #: 8013-01-2
Yeast nitrogen base (with Amino Acids)	Sigma-Aldrich	Y1250-250G	YNB