Ultrasonografía de alta resolución para el análisis de tumores ATC ortotópicos en un modelo de ratón modificado genéticamente

Resumen

El presente protocolo describe la ecografía de alta frecuencia para visualizar toda la glándula tiroides del ratón y monitorear el crecimiento del carcinoma anaplásico de tiroides.

Resumen

El carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) se asocia con un pronóstico precario y una mediana de supervivencia corta, pero ningún tratamiento efectivo mejora significativamente los resultados. Los modelos murinos genéticamente modificados que imitan la progresión del ATC pueden ayudar a los investigadores a estudiar tratamientos para esta enfermedad. Cruzando tres genotipos diferentes de ratones, un TPO-cre/ERT2; Braf^CA/wt; Se desarrolló el modelo ATC transgénico Trp53 Δex2-10^/Δex2-10. El modelo murino ATC fue inducido por una inyección intraperitoneal de tamoxifeno con sobreexpresión de Braf^V600E y deleción de Trp53, y los tumores se generaron dentro de aproximadamente 1 mes. Se aplicó ultrasonido de alta resolución para investigar el inicio y la progresión del tumor, y la curva de crecimiento dinámico se obtuvo midiendo el tamaño del tumor. En comparación con la resonancia magnética (RM) y la tomografía computarizada, el ultrasonido tiene ventajas en la observación del modelo murino ATC, como ser no invasivo, portátil, en tiempo real y sin exposición a la radiación. El ultrasonido de alta resolución es adecuado para mediciones dinámicas y múltiples. Sin embargo, el examen ultrasonográfico de la tiroides en ratones requiere conocimientos anatómicos relevantes y experiencia. Este artículo proporciona un procedimiento detallado para utilizar ultrasonido de alta resolución para escanear tumores en el modelo ATC transgénico. Mientras tanto, se enumeran el ajuste de parámetros ultrasónicos, las habilidades de escaneo de ultrasonido, la anestesia y la recuperación de los animales, y otros elementos que necesitan atención durante el proceso.

Introducción

Aunque el carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) representa menos del 2% de los cánceres de tiroides, causa más del 50% de las muertes relacionadas con el cáncer de tiroides anualmente. La mediana del tiempo de supervivencia después del diagnóstico con ATC es de sólo unos 6 meses, y no hay tratamientos disponibles que mejoren significativamente la supervivencia ^1,2.

La rareza del ATC ha obstaculizado la investigación que estudia cómo comienza la enfermedad y progresa agresivamente. Recientemente se han puesto a disposición modelos de ratón genéticamente modificados que imitan la enfermedad, que proporcionan información sobre la enfermedad y sus respuestas a posibles tratamientos ^3,4,5. Tales estudios requieren imágenes tumorales precisas para las mediciones y el monitoreo, que generalmente se realiza mediante imágenes por resonancia magnética, tomografía computarizada o ecografía de alta resolución ^6,7. La ecografía ha sido ampliamente utilizada en órganos de ratón. Tiene ventajas sobre la resonancia magnética y la tomografía computarizada, ya que puede realizarse en tiempo real y no expone al sujeto a radiación, y el equipo necesario es lo suficientemente pequeño como para ser portátil ^8,9. Sin embargo, los estudios sobre el monitoreo continuo del crecimiento de ATC mediante ultrasonido son raros; Por lo tanto, este trabajo explora la utilidad del ultrasonido en este contexto.

Aquí, se presenta un protocolo para usar ecografía de alta resolución para escanear, monitorear y medir tumores con precisión en un modelo de ratón de ATC.

Protocolo

El presente estudio se realizó con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Sichuan. TPO-cre/ERT2; Braf^CA/wt; Trp53 Δex2-10^/Δex2-10 ratones transgénicos¹⁰ fueron utilizados en este estudio (ver Tabla de Materiales). Los pasos del protocolo se pueden modificar para diferentes especies animales si es necesario. Aquí se utilizaron doce ratones, incluidas seis hembras y seis machos, con una edad media de 93 días.

1. Preparación experimental

1. Encienda el sistema de ecografía (consulte Tabla de materiales) y cree una nueva carpeta para capturar las imágenes y recopilar los datos. Seleccione la sonda de línea de 40 MHz y haga clic en el patrón de tejido superficial para activar el transductor de tejido superficial . Utilice el "modo B" para obtener imágenes de tiroides (Figura 1A).
   NOTA: El modo B es el modo básico de imágenes de ultrasonido. La apariencia de las imágenes de ultrasonido se basa en las interacciones físicas del sonido con los tejidos del cuerpo. Las imágenes en modo B se producen como imágenes grises^11,12.
2. Mantenga a los ratones en jaulas específicas con acceso gratuito a alimentos y agua. Coloque la jaula en un dispositivo de calentamiento suplementario (consulte la Tabla de materiales) para garantizar la termorregulación.
3. Asegúrese de que haya suficiente isoflurano en el vaporizador y_O2 en el tanque. Si los suministros son insuficientes, cambie los tanques por otros nuevos.
4. Limpie la plataforma de imágenes de animales con solución salina estéril y encienda el botón de calefacción. Verifique que la temperatura sea de 38-40 °C antes de colocar al animal en la plataforma (Figura 1C).

2. Preparación del animal para la obtención de imágenes

1. Encienda el vaporizador de isoflurano. Transfiera el ratón de la jaula a la caja de anestesia.
2. Anestesiar al animal usando una mezcla de 1% -2% de isoflurano del vaporizador y oxígeno que fluye a 0.8 L / min.
3. Aplique crema depilatoria desde el pecho hasta el cuello, espere 30 segundos y luego limpie la crema y el pelaje por completo. Enjuague bien el área y el pelaje circundante con solución salina estéril tibia.
4. Coloque al animal anestesiado en la plataforma calentada. Cubra el hocico con un cono nasal conectado a la salida de anestesia (Figura 2A, B).
   NOTA: El ratón debe estar completamente sedado en 1-2 minutos. Si el animal todavía está activo, realice una inducción prolongada de isoflurano hasta que el animal ya no muestre un reflejo de retirada del pedal. Asegúrese de que el animal respire de manera estable.
5. Durante la toma de imágenes, controle la frecuencia cardíaca del ratón a través de la plataforma calentada.
   NOTA: El sistema de imágenes de ecografía está equipado con un monitor de frecuencia cardíaca.
6. Use cinta adhesiva para fijar las extremidades del ratón a la plataforma calentada, con el animal en posición supina. Asegúrese de que el cono nasal esté colocado de forma estable con un flujo de gas anestésico constante (1,5 L/min).
7. Proteger los ojos aplicando ungüento oftálmico.

3. Imágenes tumorales

1. Ajuste el sistema de imágenes para optimizar la resolución. Configure los siguientes parámetros: ganancia bidimensional, 25-30 dB; profundidad de imagen, 10 mm; número de zonas focales, 3; y centro, 3-6 mm.
   NOTA: Para el presente estudio, se utilizó una sonda de 40 MHz. El modo B se especificó para la adquisición de datos.
2. Aplique generosamente gel de ultrasonido (consulte la Tabla de materiales) en el área de la piel desnuda.
3. Sostenga la sonda y colóquela en contacto con el gel de ultrasonido en el tórax, y luego escanee desde el tórax hacia el cuello para localizar la tiroides (Figura 2C).
   NOTA: Aplique presión suavemente mientras escanea; La presión excesiva sobre el cuello del animal puede causar jadeo o apnea. Este protocolo se desarrolló en base al escaneo manual, pero el escaneo mecanizado también se puede realizar utilizando una máquina para guiar la sonda, como una plataforma de imágenes de animales que se mueve a lo largo de los ejes x e y.
4. Escanee hacia arriba y hacia abajo para identificar los límites del tumor y evaluar su tamaño y forma.
   NOTA: Una tiroides sana generalmente aparece como una estructura homogénea hipoecogénica delante de la tráquea. Los tumores anaplásicos hacen que la tiroides parezca mucho más grande, lo que se puede identificar fácilmente mediante la exploración del cuello (Figura 3).
5. Identificar los tumores ATC de la tráquea y los músculos de la correa dependiendo de la ubicación anatómica y el eco ecográfico.
   NOTA: Los músculos de la correa se encuentran delante de la tiroides y la tráquea, así como detrás de la tiroides. El eco ecográfico de los músculos de la correa parece más alto que el del ATC, mientras que existe atenuación detrás de la tráquea¹³.
   1. Según la impresión del tumor total, confirme la sección de imagen con el diámetro tumoral más grande de izquierda a derecha. Presione el botón de congelación y mida los diámetros del tumor anteroposterior y de izquierda a derecha con el calibrador de ultrasonido.
      NOTA: El diámetro anteroposterior debe medirse perpendicularmente al diámetro tumoral de izquierda a derecha (Figura 4). El tamaño tumoral del ATC se calculó multiplicando el diámetro anteroposterior por el diámetro tumoral de izquierda a derecha¹⁴. Como el tamaño de los tumores en los lados izquierdo y derecho era inconsistente, cada lado de los tumores se calculó por separado. El tamaño total de los tumores se obtuvo mediante la adición de los tumores bilaterales. Los tamaños se registraron para observar la curva de crecimiento del ATC.
6. Guarde la grabación como un bucle de cine, lo que facilita la revisión de las imágenes seleccionadas.

4. Recuperación animal

1. Después de escanear, limpie el gel de ultrasonido y retire la cinta de sujeción de las extremidades del animal.
2. Coloque el ratón sobre el dispositivo de calentamiento suplementario (paso 1.2). Coloque al animal de lado (Figura 2D).
3. Después de que el ratón se recupere (~5 min), transfiéralo de nuevo a la jaula.
4. Limpie el sistema de ecografía, la sonda y la plataforma con un paño suave y alcohol isopropílico o toallitas de glutaraldehído.
5. Apague el sistema de imágenes.

Resultados

El tamaño promedio del ATC derecho al comienzo del estudio fue de 4,867 mm 2, y el tamaño promedio del ATC izquierdo fue de 5,189 mm². En la cuarta medición, el tamaño promedio del ATC derecho había crecido a 11.844 mm 2, mientras que el tamaño del tumor del lóbulo izquierdo había crecido a 9.280 mm². El tamaño total del ATC aumentó de 10.057 mm 2 a 15.843 mm². En la etapa posterior del estudio, el ATC creció rápidamente. En términos del rató...

Discusión

Este protocolo utiliza ecografía de alta resolución para analizar tumores ATC ortotópicos en un modelo de ratón modificado genéticamente. El modelo transgénico, con un genotipo de TPO-cre/ERT2; Braf^CA/wt; Trp53 Δex2-10^/Δex2-10, fue desarrollado en nuestro laboratorio. Los animales sobreexpresan Braf^V600E y carecen de Trp53; La inyección de tamoxifeno por vía intraperitoneal a los animales conduce al crecimiento del tumor después de aproximadamente 1 mes

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape	Winner
Anesthesia system	RWDlifescience
Brafflox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Chamber for anesthesia induction	RWDlifescience
Cotton swabs	Winner
Depilatory cream	Veet
Electric heating blanket	Petbee
Isoflurane vaporizer	RWDlifescience
Medical gloves	Winner
Paper towels	Breeze	B914JY
TPO-cre/ERT2 mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasound gel	Keppler	KL-250
Ultrasound machine	VisualSonics	Vevo 3100