Hochauflösende Sonographie zur Analyse orthotoper ATC-Tumoren in einem gentechnisch veränderten Mausmodell

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Hochfrequenz-Sonographie zur Darstellung der gesamten Schilddrüse der Maus und zur Überwachung des Wachstums des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms.

Zusammenfassung

Das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ATC) ist mit einer schlechten Prognose und einer kurzen medianen Überlebenszeit verbunden, aber keine wirksame Behandlung verbessert die Ergebnisse signifikant. Gentechnisch veränderte Mausmodelle, die das Fortschreiten von ATC nachahmen, könnten Forschern helfen, Behandlungen für diese Krankheit zu untersuchen. Kreuzung von drei verschiedenen Genotypen von Mäusen, einem TPO-cre/ERT2; Braf^CA/wt; Trp53 Δex2-10^/Δex2-10 transgenes ATC-Modell wurde entwickelt. Das ATC-Mausmodell wurde durch eine intraperitoneale Injektion von Tamoxifen mit Überexpression von Braf^V600E und Deletion von Trp53 induziert, und die Tumoren wurden innerhalb von etwa 1 Monat erzeugt. Mittels hochauflösendem Ultraschall wurde die Tumorinitiation und -progression untersucht und die dynamische Wachstumskurve durch Messung der Tumorgrößen ermittelt. Im Vergleich zur Magnetresonanztomographie (MRT) und Computertomographie hat Ultraschall Vorteile bei der Beobachtung des ATC-Mausmodells, z. B. nicht-invasiv, tragbar, in Echtzeit und ohne Strahlenbelastung. Hochauflösender Ultraschall eignet sich für dynamische und Mehrfachmessungen. Die ultrasonographische Untersuchung der Schilddrüse bei Mäusen erfordert jedoch einschlägige anatomische Kenntnisse und Erfahrungen. In diesem Artikel wird ein detailliertes Verfahren zur Verwendung von hochauflösendem Ultraschall zum Scannen von Tumoren im transgenen ATC-Modell beschrieben. In der Zwischenzeit werden die Einstellung der Ultraschallparameter, die Fähigkeiten des Ultraschallscans, die Anästhesie und die Genesung der Tiere sowie andere Elemente, die während des Prozesses beachtet werden müssen, aufgelistet.

Einleitung

Obwohl das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ATC) weniger als 2 % der Schilddrüsenkrebserkrankungen ausmacht, verursacht es jährlich mehr als 50 % der Todesfälle im Zusammenhang mit Schilddrüsenkrebs. Die mediane Überlebenszeit nach der Diagnose mit ATC beträgt nur etwa 6 Monate, und es gibt keine Behandlungen, die das Überleben signifikant verbessern ^1,2.

Die Seltenheit von ATC hat die Erforschung des Beginns und des aggressiven Fortschreitens der Krankheit behindert. Seit kurzem gibt es gentechnisch veränderte Mausmodelle, die die Krankheit nachahmen und Einblicke in die Krankheit^und ihr Ansprechen auf mögliche Behandlungen geben ^3,4,5. Solche Untersuchungen erfordern eine genaue Bildgebung des Tumors für Messungen und Überwachung, die in der Regel mit Magnetresonanztomographie, Computertomographie oder hochauflösendem Ultraschall durchgeführt wird ^6,7. Die Ultraschalluntersuchung ist bei Mausorganen weit verbreitet. Es hat Vorteile gegenüber der Magnetresonanztomographie und der Computertomographie, da es in Echtzeit durchgeführt werden kann und das Subjekt keiner Strahlung ausgesetzt ist, und die erforderliche Ausrüstung klein genug ist, um tragbar zu sein ^8,9. Studien zur kontinuierlichen Überwachung des ATC-Wachstums mittels Ultraschall sind jedoch selten. Daher untersucht diese Arbeit den Nutzen von Ultraschall in diesem Zusammenhang.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Verwendung hochauflösender Ultraschalluntersuchungen zur genauen Untersuchung, Überwachung und Vermessung von Tumoren in einem Mausmodell der ATC vorgestellt.

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde mit Genehmigung des Animal Care and Use Committee der Universität Sichuan durchgeführt. TPO-cre/ERT2; Braf^CA/wt; Trp53 Δex2-10^/Δex2-10 transgene Mäuse¹⁰ wurden in dieser Studie verwendet (siehe Materialtabelle). Die Protokollschritte können bei Bedarf für verschiedene Tierarten modifiziert werden. Zwölf Mäuse, darunter sechs Weibchen und sechs Männchen, mit einem Durchschnittsalter von 93 Tagen, wurden hier eingesetzt.

1. Versuchsvorbereitung

1. Schalten Sie das Ultraschallgerät ein (siehe Materialtabelle) und erstellen Sie einen neuen Ordner für die Aufnahme der Bilder und die Erfassung der Daten. Wählen Sie die 40-MHz-Zeilensonde aus und klicken Sie auf das oberflächliche Gewebemuster, um den oberflächlichen Gewebeschallkopf zu aktivieren. Verwenden Sie den "B-Modus" für die Bildgebung der Schilddrüse (Abbildung 1A).
   Anmerkungen: Der B-Modus ist der grundlegende Ultraschall-Bildgebungsmodus. Das Auftreten von Ultraschallbildern beruht auf den physikalischen Wechselwirkungen von Schall mit dem Gewebe im Körper. B-Mode-Bilder werden als graue Bilder^11,12 erzeugt.
2. Halten Sie die Mäuse in speziellen Käfigen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser. Stellen Sie den Käfig auf ein zusätzliches Heizgerät (siehe Materialtabelle), um die Wärmeregulierung zu gewährleisten.
3. Stellen Sie sicher, dass ausreichend Isofluran im Verdampfer und O₂ im Tank vorhanden ist. Wenn die Vorräte nicht ausreichen, tauschen Sie die Tanks gegen neue aus.
4. Reinigen Sie die Tierbildgebungsplattform mit steriler Kochsalzlösung und schalten Sie den Heizknopf ein. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur 38-40 °C beträgt, bevor Sie das Tier auf die Plattform setzen (Abbildung 1C).

2. Vorbereitung der Tiere für die Bildgebung

1. Schalten Sie den Isofluran-Verdampfer ein. Übertragen Sie die Maus aus dem Käfig in die Anästhesiebox.
2. Betäuben Sie das Tier mit einer Mischung aus 1%-2% Isofluran aus dem Verdampfer und Sauerstoff, der mit 0,8 l/min fließt.
3. Tragen Sie die Enthaarungscreme von der Brust bis zum Hals auf, warten Sie 30 Sekunden und wischen Sie dann die Creme und das Fell vollständig ab. Spülen Sie den Bereich und das umgebende Fell gründlich mit warmer, steriler Kochsalzlösung ab.
4. Legen Sie das betäubte Tier auf die beheizte Plattform. Decken Sie die Schnauze mit einem Nasenkegel ab, der mit dem Anästhesieausgang verbunden ist (Abbildung 2A, B).
   HINWEIS: Die Maus muss innerhalb von 1-2 Minuten vollständig sediert sein. Wenn das Tier noch aktiv ist, führen Sie eine verlängerte Isofluran-Induktion durch, bis das Tier keinen Pedalrückzugsreflex mehr zeigt. Stellen Sie sicher, dass das Tier stabil atmet.
5. Überwachen Sie während der Bildgebung die Herzfrequenz der Maus über die beheizte Plattform.
   HINWEIS: Das Ultraschall-Bildgebungssystem ist mit einem Herzfrequenzmesser ausgestattet.
6. Verwenden Sie Klebeband, um die Gliedmaßen der Maus auf der beheizten Plattform zu befestigen, während sich das Tier in Rückenlage befindet. Stellen Sie sicher, dass der Nasenkonus mit einem konstanten Anästhesiegasfluss (1,5 l/min) stabil positioniert ist.
7. Schützen Sie die Augen, indem Sie Augensalbe auftragen.

3. Bildgebung des Tumors

1. Passen Sie das Bildgebungssystem an, um die Auflösung zu optimieren. Stellen Sie die folgenden Parameter ein: zweidimensionale Verstärkung, 25-30 dB; Bildtiefe, 10 mm; Anzahl der Fokuszonen, 3; und Mitte, 3-6 mm.
   HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurde eine 40-MHz-Sonde verwendet. Für die Datenerfassung wurde der B-Modus spezifiziert.
2. Tragen Sie das Ultraschallgel (siehe Materialtabelle) großzügig auf den Bereich der nackten Haut auf.
3. Halten Sie die Sonde und bringen Sie sie mit dem Ultraschallgel auf der Brust in Kontakt, und scannen Sie dann von der Brust in Richtung Hals, um die Schilddrüse zu lokalisieren (Abbildung 2C).
   Anmerkungen: Üben Sie während des Scannens sanften Druck aus. Übermäßiger Druck auf den Hals des Tieres kann zu Keuchen oder Apnoe führen. Dieses Protokoll wurde auf der Grundlage des Handscanners entwickelt, aber es kann auch ein mechanisiertes Scannen mit einer Maschine durchgeführt werden, um die Sonde zu führen, z. B. eine Tierbildgebungsplattform, die sich entlang der x- und y-Achse bewegt.
4. Scannen Sie nach oben und unten, um die Grenzen des Tumors zu identifizieren und seine Größe und Form zu beurteilen.
   HINWEIS: Eine gesunde Schilddrüse erscheint in der Regel als echogene, homogene Struktur vor der Luftröhre. Anaplastische Tumoren lassen die Schilddrüse viel größer erscheinen, was durch einen Halsscan leicht identifiziert werden kann (Abbildung 3).
5. Identifizieren Sie die ATC-Tumoren anhand der Luftröhre und der Gurtmuskulatur in Abhängigkeit von der anatomischen Lokalisation und dem Ultraschallecho.
   HINWEIS: Die Gurtmuskulatur befindet sich vor der Schilddrüse und der Luftröhre sowie hinter der Schilddrüse. Das Ultraschallecho der Gurtmuskulatur erscheint höher als das des ATC, während hinter der Luftröhre eine Dämpfung besteht¹³.
   1. Bestätigen Sie anhand des Abdrucks des Gesamttumors den Bildausschnitt mit dem größten Tumordurchmesser von links nach rechts. Drücken Sie die Freeze-Taste und messen Sie den anteroposterioren und den Tumordurchmesser von links nach rechts mit dem Ultraschallmessschieber.
      HINWEIS: Der anteroposteriore Durchmesser muss senkrecht zum Tumordurchmesser von links nach rechts gemessen werden (Abbildung 4). Die Tumorgröße des ATC wurde berechnet, indem der anteroposteriore Durchmesser mit dem von links nach rechts verlaufenden Tumordurchmesser multipliziert wurde¹⁴. Da die Größe der Tumore auf der linken und rechten Seite uneinheitlich war, wurde jede Seite der Tumore separat berechnet. Die Gesamtgröße der Tumoren wurde durch Addition der bilateralen Tumoren ermittelt. Die Größen wurden aufgezeichnet, um die Wachstumskurve des ATC zu beobachten.
6. Speichern Sie die Aufnahme als Cine-Loop, was die Überprüfung der ausgewählten Bilder erleichtert.

4. Genesung von Tieren

1. Wischen Sie nach dem Scannen das Ultraschallgel ab und entfernen Sie das Fesselband von den Gliedmaßen des Tieres.
2. Setzen Sie die Maus auf das Zusatzheizgerät (Schritt 1.2). Legen Sie das Tier auf die Seite (Abbildung 2D).
3. Nachdem sich die Maus erholt hat (~5 min), bringen Sie sie zurück in den Käfig.
4. Reinigen Sie das Ultraschallsystem, die Sonde und die Plattform mit einem weichen Tuch und Isopropylalkohol- oder Glutaraldehydtüchern.
5. Schalten Sie das Imaging-System aus.

Ergebnisse

Die durchschnittliche rechte ATC-Größe betrug zu Beginn der Studie 4,867 mm2 und die durchschnittliche linke ATC-Größe 5,189^mm2. Bei der vierten Messung war die durchschnittliche rechte ATC-Größe auf 11,844 mm2 angewachsen, während die Tumorgröße des linken Lappens auf 9,280^mm2 angewachsen war. Die Gesamtgröße des ATC stieg von 10,057 mm 2 auf 15,843 mm². In der späteren Phase der Studie wuchs das ATC schnell. Bei der Maus mit der Bezeichnung "...

Diskussion

Dieses Protokoll verwendet hochauflösende Ultraschalluntersuchungen, um orthotope ATC-Tumore in einem gentechnisch veränderten Mausmodell zu analysieren. Das transgene Modell mit einem Genotyp von TPO-cre/ERT2; Braf^CA/wt; Trp53 Δex2-10^/Δex2-10 wurde in unserem Labor entwickelt. Die Tiere überexprimieren Braf^V600E und es fehlt Trp53; Die intraperitoneale Injektion von Tamoxifen führt nach ca. 1 Monat zu einem Tumorwachstum¹⁰. Die Tumore wachs...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape	Winner
Anesthesia system	RWDlifescience
Brafflox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Chamber for anesthesia induction	RWDlifescience
Cotton swabs	Winner
Depilatory cream	Veet
Electric heating blanket	Petbee
Isoflurane vaporizer	RWDlifescience
Medical gloves	Winner
Paper towels	Breeze	B914JY
TPO-cre/ERT2 mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasound gel	Keppler	KL-250
Ultrasound machine	VisualSonics	Vevo 3100