Genetiği Değiştirilmiş Bir Fare Modelinde Ortotopik ATC Tümörlerinin Analizi için Yüksek Çözünürlüklü Ultrasonografi

Özet

Bu protokol, fare tiroid bezinin tamamını görselleştirmek ve anaplastik tiroid karsinomunun büyümesini izlemek için yüksek frekanslı ultrasonografiyi tanımlamaktadır.

Özet

Anaplastik tiroid karsinomu (ATK) kötü prognoz ve kısa medyan sağkalım süresi ile ilişkilidir, ancak etkili bir tedavi sonuçları önemli ölçüde iyileştirmez. ATC'nin ilerlemesini taklit eden genetik olarak tasarlanmış murin modelleri, araştırmacıların bu hastalık için tedavileri incelemelerine yardımcı olabilir. Üç farklı fare genotipini geçmek, bir TPO-cre / ERT2; Braf^CA/wt; Trp53 Δex2-10^/Δex2-10 transgenik ATC modeli geliştirildi. ATC murin modeli, Braf^V600E'nin aşırı ekspresyonu ve Trp53'ün silinmesi ile intraperitoneal tamoksifen enjeksiyonu ile indüklendi ve tümörler yaklaşık 1 ay içinde üretildi. Tümörün başlama ve progresyonunu araştırmak için yüksek çözünürlüklü ultrasonografi uygulandı ve tümör boyutları ölçülerek dinamik büyüme eğrisi elde edildi. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve bilgisayarlı tomografi taraması ile karşılaştırıldığında, ultrasonun ATC murin modelini gözlemlemede noninvaziv, taşınabilir, gerçek zamanlı ve radyasyona maruz kalmadan avantajlar vardır. Yüksek çözünürlüklü ultrason dinamik ve çoklu ölçümler için uygundur. Bununla birlikte, farelerde tiroidin ultrasonografik incelemesi, ilgili anatomik bilgi ve deneyimi gerektirir. Bu makalede, transgenik ATC modelinde tümörleri taramak için yüksek çözünürlüklü ultrason kullanımı için ayrıntılı bir prosedür sunulmaktadır. Bu arada, ultrasonik parametre ayarı, ultrason tarama becerileri, anestezi ve hayvanların iyileşmesi ve işlem sırasında dikkat edilmesi gereken diğer unsurlar listelenmiştir.

Giriş

Anaplastik tiroid karsinomu (ATC) tiroid kanserlerinin %2'sinden azını oluştursa da, yılda tiroid kanserine bağlı ölümlerin %50'sinden fazlasına neden olmaktadır. ATC tanısından sonra medyan sağkalım süresi sadece yaklaşık 6 aydır ve sağkalımı önemli ölçüde artıran hiçbir tedavi mevcut değildir ^1,2.

ATC'nin nadirliği, hastalığın nasıl başladığını ve agresif bir şekilde ilerlediğini inceleyen araştırmaları engellemiştir. Hastalığı taklit eden genetiği değiştirilmiş fare modelleri yakın zamanda kullanıma sunulmuştur, bu da hastalık ve olası tedavilere verdiği yanıtlar hakkında fikir vermektedir ^3,4,5. Bu tür çalışmalar, tipik olarak manyetik rezonans görüntüleme, bilgisayarlı tomografi veya yüksek çözünürlüklü ultrasonografi ^6,7 kullanılarak gerçekleştirilen ölçümler ve izleme için doğru tümör görüntülemesi gerektirir. Ultrasonografi fare organlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Gerçek zamanlı olarak yapılabilmesi ve konuyu radyasyona maruz bırakmaması nedeniyle manyetik rezonans görüntüleme ve bilgisayarlı tomografiye göre avantajları vardır ve gerekli ekipmanlar taşınabilir olacak kadar küçüktür ^8,9. Bununla birlikte, ultrason kullanarak ATC büyümesini sürekli izlemeye yönelik çalışmalar nadirdir; Bu nedenle, bu çalışma bu bağlamda ultrasonun faydasını araştırmaktadır.

Burada, ATC'nin bir fare modelinde tümörleri doğru bir şekilde taramak, izlemek ve ölçmek için yüksek çözünürlüklü ultrasonografi kullanmak için bir protokol sunulmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışma, Sichuan Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir. TPO-cre/ERT2; Braf^CA/wt; Bu çalışmada Trp53^{Δex2-10/Δex2-10} transgenik fareler¹⁰ kullanılmıştır (bakınız Malzeme Tablosu). Protokol adımları gerekirse farklı hayvan türleri için değiştirilebilir. Burada altı dişi ve altı erkek olmak üzere, yaş ortalaması 93 gün olan on iki fare kullanılmıştır.

1. Deneysel hazırlık

1. Ultrasonografi sistemini açın (bakınız Malzeme Tablosu) ve görüntüleri yakalamak ve verileri toplamak için yeni bir klasör oluşturun. 40 MHz çizgi probunu seçin ve yüzeysel doku dönüştürücüsünü etkinleştirmek için yüzeysel doku desenine tıklayın. Tiroid görüntüleme için "B modunu" kullanın (Şekil 1A).
   NOT: B modu temel ultrason görüntüleme modudur. Ultrason görüntülerinin ortaya çıkması, sesin vücuttaki dokularla fiziksel etkileşimlerine dayanır. B modu görüntüler gri görüntüler^{olarak üretilir 11,12}.
2. Fareleri, yiyecek ve suya serbest erişimi olan belirli kafeslerde tutun. Termoregülasyonu sağlamak için kafesi ek bir ısıtma cihazına yerleştirin (bkz.
3. Buharlaştırıcıda yeterli izofluran ve tankta_O2 olduğundan emin olun. Sarf malzemeleri yetersizse, tankları yenileriyle değiştirin.
4. Hayvan görüntüleme platformunu steril salin ile temizleyin ve ısıtma düğmesini açın. Hayvanı platforma yerleştirmeden önce sıcaklığın 38-40 °C olduğunu doğrulayın (Şekil 1C).

2. Görüntüleme için hayvan hazırlığı

1. İzofluran buharlaştırıcıyı açın. Fareyi kafesten anestezi kutusuna aktarın.
2. Buharlaştırıcıdan% 1 -% 2 izofluran karışımı ve 0.8 L / dak'da akan oksijen kullanarak hayvanı uyuşturun.
3. Tüy dökücü kremi göğüsten boyuna sürün, 30 saniye bekleyin ve ardından kremi ve kürkü tamamen silin. Alanı ve çevresindeki kürkü ılık steril salinle iyice durulayın.
4. Anestezi uygulanan hayvanı ısıtılmış platforma yerleştirin. Burnu anestezi çıkışına bağlı bir burun konisi ile örtün (Şekil 2A, B).
   NOT: Fare 1-2 dakika içinde tamamen sakinleştirilmelidir. Hayvan hala aktifse, hayvan artık bir pedal geri çekilme refleksi göstermeyene kadar uzun süreli izofluran indüksiyonu yapın. Hayvanın istikrarlı bir şekilde nefes aldığından emin olun.
5. Görüntüleme sırasında, farenin kalp atış hızını ısıtılmış platformdan izleyin.
   NOT: Ultrasonografi görüntüleme sistemi kalp atış hızı monitörü ile donatılmıştır.
6. Farenin uzuvlarını, hayvan sırtüstü pozisyonda olacak şekilde ısıtılmış platforma sabitlemek için yapışkan bant kullanın. Burun konisinin sabit bir anestezik gaz akışı (1,5 L/dak) ile stabil bir şekilde konumlandırıldığından emin olun.
7. Oftalmik merhem uygulayarak gözleri koruyun.

3. Tümör görüntüleme

1. Çözünürlüğü optimize etmek için görüntüleme sistemini ayarlayın. Aşağıdaki parametreleri ayarlayın: iki boyutlu kazanç, 25-30 dB; görüntü derinliği, 10 mm; odak bölgelerinin sayısı, 3; ve merkez, 3-6 mm.
   NOT: Bu çalışmada 40 MHz prob kullanılmıştır. Veri toplama için B modu belirtildi.
2. Çıplak cilt bölgesine ultrason jelini (bakınız Malzeme Tablosu) serbestçe uygulayın.
3. Probu tutun ve göğüsteki ultrason jeli ile temas ettirin ve ardından tiroidi bulmak için göğüsten boyuna doğru tarayın (Şekil 2C).
   NOT: Tarama sırasında basıncı nazikçe uygulayın; Hayvanın boynundaki aşırı baskı, nefes darlığına veya apneye neden olabilir. Bu protokol elde taramaya dayalı olarak geliştirilmiştir, ancak mekanize tarama, x ve y eksenleri boyunca hareket eden bir hayvan görüntüleme platformu gibi probu yönlendirmek için bir makine kullanılarak da gerçekleştirilebilir.
4. Tümörün sınırlarını belirlemek ve boyutunu ve şeklini değerlendirmek için yukarı ve aşağı tarayın.
   NOT: Sağlıklı bir tiroid genellikle trakeanın önünde hipoekojenik, homojen bir yapı olarak ortaya çıkar. Anaplastik tümörler tiroidin çok daha büyük görünmesine neden olur ve bu da boyun taraması ile kolayca tanımlanabilir (Şekil 3).
5. ATC tümörlerini trakeadan tanımlayın ve anatomik lokalizasyona ve ultrason ekosuna bağlı olarak kasları bağlayın.
   NOT: Kayış kasları tiroid ve trakeanın önünde ve tiroidin arkasında bulunur. Kayış kaslarının ultrason ekosu ATC'ninkinden daha yüksek görünürken, trakea^13'ün arkasında zayıflama vardır.
   1. Toplam tümörün izlenimine dayanarak, en büyük soldan sağa tümör çapına sahip görüntü bölümünü onaylayın. Dondurma düğmesine basın ve ultrason kaliperi kullanarak anteroposterior ve soldan sağa tümör çaplarını ölçün.
      NOT: Anteroposterior çap, soldan sağa tümör çapına dik olarak ölçülmelidir (Şekil 4). ATK'nın tümör boyutu, anteroposterior çapın soldan sağa tümör çapı¹⁴ ile çarpılmasıyla hesaplandı. Sol ve sağ taraftaki tümörlerin boyutları tutarsız olduğundan, tümörlerin her iki tarafı ayrı ayrı hesaplandı. Bilateral tümörlerin eklenmesiyle tümörlerin toplam büyüklüğü elde edildi. ATC'nin büyüme eğrisini gözlemlemek için boyutlar kaydedildi.
6. Kaydı, seçilen görüntülerin incelenmesini kolaylaştıran bir sinema döngüsü olarak kaydedin.

4. Hayvan kurtarma

1. Taradıktan sonra, ultrason jelini silin ve kısıtlayıcı bandı hayvanın uzuvlarından çıkarın.
2. Fareyi ek ısıtma aygıtının üzerine yerleştirin (adım 1.2). Hayvanı yan yatırdınız (Şekil 2D).
3. Fare iyileştikten sonra (~ 5 dakika), kafese geri aktarın.
4. Ultrasonografi sistemini, probu ve platformu yumuşak bir bez ve izopropil alkol veya glutaraldehit mendiller kullanarak temizleyin.
5. Görüntüleme sistemini kapatın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Çalışmanın başında ortalama sağ ATC boyutu 4.867 mm2, ortalama sol ATC boyutu 5.189^mm2 idi. Dördüncü ölçümde, ortalama sağ ATC boyutu 11.844 mm2'ye yükselirken, sol lobun tümör boyutu 9.280^mm2'ye yükselmiştir. Toplam ATC boyutu 10,057 mm^2'den 15,843^mm2'ye yükseltildi. Çalışmanın sonraki aşamasında, ATC hızla büyüdü. "P92" etiketli fare açısından (Tablo 1), dördüncü ölçümdeki tümör boyutu, ilk ölç?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, genetiği değiştirilmiş bir fare modelinde ortotopik ATC tümörlerini analiz etmek için yüksek çözünürlüklü ultrasonografi kullanır. TPO-cre/ERT2 genotipine sahip transgenik model; Braf^CA/wt; Trp53 Δex2-10^/Δex2-10, laboratuvarımızda geliştirilmiştir. Hayvanlar Braf^V600E'yi aşırı ifade eder ve Trp53'ten yoksundur; Hayvanlara intraperitoneal olarak tamoksifen enjekte edilmesi yaklaşık 1 ay sonra tümör büyümesine yol açar

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape	Winner
Anesthesia system	RWDlifescience
Brafflox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Chamber for anesthesia induction	RWDlifescience
Cotton swabs	Winner
Depilatory cream	Veet
Electric heating blanket	Petbee
Isoflurane vaporizer	RWDlifescience
Medical gloves	Winner
Paper towels	Breeze	B914JY
TPO-cre/ERT2 mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasound gel	Keppler	KL-250
Ultrasound machine	VisualSonics	Vevo 3100