Échographie à haute résolution pour l’analyse des tumeurs ATC orthotopiques dans un modèle murin génétiquement modifié

Résumé

Le présent protocole décrit l’échographie à haute fréquence pour visualiser l’ensemble de la glande thyroïde de la souris et surveiller la croissance du carcinome anaplasique de la thyroïde.

Résumé

Le carcinome anaplasique de la thyroïde (ATC) est associé à un mauvais pronostic et à une courte durée médiane de survie, mais aucun traitement efficace n’améliore significativement les résultats. Les modèles murins génétiquement modifiés qui imitent la progression de l’ATC peuvent aider les chercheurs à étudier les traitements pour cette maladie. Croisement de trois génotypes différents de souris, un TPO-cre/ERT2; Braf^CA/poids; Le modèle ATC transgénique Trp53 Δex2-10^/Δex2-10 a été développé. Le modèle murin ATC a été induit par une injection intrapéritonéale de tamoxifène avec surexpression de Braf^V600E et délétion de Trp53, et les tumeurs ont été générées en environ 1 mois. Une échographie à haute résolution a été appliquée pour étudier l’initiation et la progression de la tumeur, et la courbe de croissance dynamique a été obtenue en mesurant la taille des tumeurs. Par rapport à l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et à la tomodensitométrie, l’échographie présente des avantages dans l’observation du modèle murin ATC, comme être non invasive, portable, en temps réel et sans exposition aux rayonnements. Les ultrasons haute résolution conviennent aux mesures dynamiques et multiples. Cependant, l’examen échographique de la thyroïde chez la souris nécessite des connaissances anatomiques et une expérience pertinentes. Cet article fournit une procédure détaillée pour l’utilisation d’ultrasons à haute résolution pour scanner les tumeurs dans le modèle ATC transgénique. Pendant ce temps, l’ajustement des paramètres ultrasoniques, les compétences en échographie, l’anesthésie et la récupération des animaux, et d’autres éléments qui nécessitent une attention pendant le processus sont énumérés.

Introduction

Bien que le carcinome anaplasique de la thyroïde (ATC) représente moins de 2 % des cancers de la thyroïde, il cause plus de 50 % des décès liés au cancer de la thyroïde chaque année. Le temps de survie médian après le diagnostic d’ATC n’est que d’environ 6 mois, et aucun traitement n’est disponible qui améliore significativement la survie ^1,2.

La rareté de l’ATC a entravé la recherche sur la façon dont la maladie commence et progresse agressivement. Des modèles murins génétiquement modifiés qui imitent la maladie sont récemment devenus disponibles, qui fournissent des informations sur la maladie et ses réponses aux traitements possibles ^3,4,5. De telles études nécessitent une imagerie tumorale précise pour les mesures et la surveillance, qui est généralement effectuée à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique, de la tomodensitométrie ou de l’échographie à haute résolution ^6,7. L’échographie a été largement utilisée dans les organes de souris. Il présente des avantages par rapport à l’imagerie par résonance magnétique et à la tomodensitométrie, car il peut être effectué en temps réel et n’expose pas le sujet à un rayonnement, et l’équipement nécessaire est suffisamment petit pour être portable ^8,9. Cependant, les études sur la surveillance continue de la croissance de l’ATC à l’aide d’ultrasons sont rares; Par conséquent, ce travail explore l’utilité de l’échographie dans ce contexte.

Ici, un protocole d’utilisation de l’échographie à haute résolution pour scanner, surveiller et mesurer avec précision les tumeurs dans un modèle murin d’ATC est présenté.

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Protocole

La présente étude a été réalisée avec l’approbation du Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Sichuan. TPO-cre/ERT2; Braf^CA/poids; Des souris transgéniques Trp53 Δex2-10^{/Δex2-10 10} ont été utilisées dans cette étude (voir le tableau des matériaux). Les étapes du protocole peuvent être modifiées pour différentes espèces animales si nécessaire. Douze souris, dont six femelles et six mâles, avec un âge moyen de 93 jours, ont été utilisées ici.

1. Préparation expérimentale

1. Allumez le système d’échographie (voir Tableau des matériaux) et créez un nouveau dossier pour capturer les images et recueillir les données. Sélectionnez la sonde linéaire 40 MHz et cliquez sur le motif tissulaire superficiel pour activer le transducteur tissulaire superficiel. Utilisez le « mode B » pour l’imagerie thyroïdienne (Figure 1A).
   REMARQUE: Le mode B est le mode d’imagerie échographique de base. L’apparition des images échographiques repose sur les interactions physiques du son avec les tissus du corps. Les images en mode B sont produites sous forme d’images grises^11,12.
2. Gardez les souris dans des cages spécifiques avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau. Placez la cage sur un dispositif de chauffage d’appoint (voir le tableau des matériaux) pour assurer la thermorégulation.
3. Assurez-vous de suffisamment d’isoflurane dans le vaporisateur et_d’O2 dans le réservoir. Si les fournitures sont insuffisantes, échangez les réservoirs contre de nouveaux.
4. Nettoyez la plate-forme d’imagerie animale avec une solution saline stérile et allumez le bouton de chauffage. Vérifiez que la température est comprise entre 38 et 40 °C avant de placer l’animal sur la plate-forme (figure 1C).

2. Préparation de l’animal pour l’imagerie

1. Allumez le vaporisateur d’isoflurane. Transférez la souris de la cage à la boîte d’anesthésie.
2. Anesthésier l’animal en utilisant un mélange de 1 % à 2 % d’isoflurane provenant du vaporisateur et d’oxygène circulant à 0,8 L/min.
3. Appliquez de la crème dépilatoire de la poitrine au cou, attendez 30 secondes, puis essuyez complètement la crème et la fourrure. Rincez soigneusement la zone et la fourrure environnante avec une solution saline stérile chaude.
4. Placez l’animal anesthésié sur la plate-forme chauffée. Couvrir le museau avec un cône nasal relié à la sortie de l’anesthésie (Figure 2A, B).
   REMARQUE: La souris doit être complètement sous sédation dans les 1-2 minutes. Si l’animal est toujours actif, effectuer une induction prolongée d’isoflurane jusqu’à ce que l’animal ne présente plus de réflexe de retrait de la pédale. Assurez-vous que l’animal respire de façon stable.
5. Pendant l’imagerie, surveillez la fréquence cardiaque de la souris à travers la plate-forme chauffée.
   REMARQUE: Le système d’imagerie par échographie est équipé d’un moniteur de fréquence cardiaque.
6. Utilisez du ruban adhésif pour fixer les membres de la souris à la plate-forme chauffée, avec l’animal en décubitus dorsal. Assurez-vous que le cône nasal est positionné de manière stable avec un débit constant de gaz anesthésique (1,5 L/min).
7. Protégez les yeux en appliquant une pommade ophtalmique.

3. Imagerie tumorale

1. Ajustez le système d’imagerie pour optimiser la résolution. Paramétrez les paramètres suivants : gain bidimensionnel, 25-30 dB ; profondeur de l’image, 10 mm; nombre de zones focales, 3; et centre, 3-6 mm.
   REMARQUE : Pour la présente étude, une sonde de 40 MHz a été utilisée. Le mode B a été spécifié pour l’acquisition de données.
2. Appliquez généreusement le gel à ultrasons (voir le tableau des matériaux) sur la zone de la peau nue.
3. Tenez la sonde et placez-la en contact avec le gel à ultrasons sur la poitrine, puis balayez de la poitrine vers le cou pour localiser la thyroïde (Figure 2C).
   REMARQUE: Appliquez une pression doucement pendant la numérisation; Une pression excessive sur le cou de l’animal peut provoquer un halètement ou une apnée. Ce protocole a été développé sur la base de la numérisation portable, mais le balayage mécanisé peut également être effectué à l’aide d’une machine pour guider la sonde, telle qu’une plate-forme d’imagerie animale qui se déplace le long des axes x et y.
4. Scannez de haut en bas pour identifier les limites de la tumeur et évaluer sa taille et sa forme.
   REMARQUE: Une thyroïde saine apparaît généralement comme une structure hypoéchogène et homogène devant la trachée. Les tumeurs anaplasiques font apparaître la thyroïde beaucoup plus grande, ce qui peut facilement être identifié par balayage du cou (Figure 3).
5. Identifier les tumeurs ATC de la trachée et des muscles de la sangle en fonction de l’emplacement anatomique et de l’écho échographique.
   REMARQUE: Les muscles de la sangle sont situés devant la thyroïde et la trachée, ainsi que derrière la thyroïde. L’écho échographique des muscles de la sangle apparaît plus élevé que celui de l’ATC, tandis que l’atténuation existe derrière la trachée¹³.
   1. Sur la base de l’impression de la tumeur totale, confirmez la section d’image avec le plus grand diamètre tumoral de gauche à droite. Appuyez sur le bouton de congélation et mesurez les diamètres tumoraux antéropostérieur et de gauche à droite à l’aide de l’étrier à ultrasons.
      NOTE: Le diamètre antéropostérieur doit être mesuré perpendiculairement au diamètre tumoral de gauche à droite (Figure 4). La taille de la tumeur de l’ATC a été calculée en multipliant le diamètre antéropostérieur par le diamètre tumoral de gauche à droite¹⁴. Comme la taille des tumeurs sur les côtés gauche et droit était incohérente, chaque côté des tumeurs a été calculé séparément. La taille totale des tumeurs a été obtenue en ajoutant les tumeurs bilatérales. Les tailles ont été enregistrées pour observer la courbe de croissance de l’ATC.
6. Enregistrez l’enregistrement en boucle ciné, ce qui facilite la révision des images sélectionnées.

4. Récupération des animaux

1. Après le balayage, essuyez le gel à ultrasons et retirez le ruban de retenue des membres de l’animal.
2. Placez la souris sur le dispositif de chauffage d’appoint (étape 1.2). Posez l’animal sur le côté (figure 2D).
3. Une fois que la souris a récupéré (~5 min), transférez-la dans la cage.
4. Nettoyez le système d’échographie, la sonde et la plate-forme à l’aide d’un chiffon doux et de lingettes à base d’alcool isopropylique ou de glutaraldéhyde.
5. Éteignez le système d’imagerie.

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Résultats

La taille moyenne de l’ATC droit au début de l’étude était de 4,867 mm² et la taille moyenne de l’ATC gauche était de 5,189^mm2. Sur la quatrième mesure, la taille moyenne de l’ATC droit était passée à 11,844 mm 2, tandis que la taille tumorale du lobe gauche avait atteint 9,280 mm². La taille ATC totale est passée de 10,057^mm2 à 15,843 mm². Dans la dernière étape de l’étude, l’ATC a connu une croissance rapide. En ce qui concerne l...

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Discussion

Ce protocole utilise l’échographie à haute résolution pour analyser les tumeurs ATC orthotopiques dans un modèle murin génétiquement modifié. Le modèle transgénique, avec un génotype de TPO-cre/ERT2 ; Braf^CA/poids; Trp53 Δex2-10^/Δex2-10, a été développé dans notre laboratoire. Les animaux surexpriment Braf^V600E et manquent de Trp53; L’injection intrapéritonéale de tamoxifène chez les animaux entraîne une croissance tumorale après environ 1 mois

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape	Winner
Anesthesia system	RWDlifescience
Brafflox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Chamber for anesthesia induction	RWDlifescience
Cotton swabs	Winner
Depilatory cream	Veet
Electric heating blanket	Petbee
Isoflurane vaporizer	RWDlifescience
Medical gloves	Winner
Paper towels	Breeze	B914JY
TPO-cre/ERT2 mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasound gel	Keppler	KL-250
Ultrasound machine	VisualSonics	Vevo 3100