Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

Resumen

En el sistema de cocultivo de los ganglios de la raíz dorsal y las células de Schwann, se puede estudiar la mielinización del sistema nervioso periférico. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para observar y cuantificar la mielinización periférica y estudiar los efectos de compuestos de interés en la vaina de mielina.

Resumen

El proceso de mielinización es esencial para permitir una transducción de señal rápida y suficiente en el sistema nervioso. En el sistema nervioso periférico, las neuronas y las células de Schwann participan en una interacción compleja para controlar la mielinización de los axones. Las alteraciones de esta interacción y la ruptura de la vaina de mielina son características de las neuropatías inflamatorias y ocurren secundariamente en trastornos neurodegenerativos. Aquí, presentamos un modelo de cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal y células de Schwann, que desarrolla una mielinización robusta de axones periféricos para investigar el proceso de mielinización en el sistema nervioso periférico, estudiar las interacciones axón-célula de Schwann y evaluar los efectos potenciales de los agentes terapéuticos en cada tipo de célula por separado. Metodológicamente, los ganglios de la raíz dorsal de ratas embrionarias (E13.5) fueron cosechados, disociados de su tejido circundante y cultivados como explantes enteros durante 3 días. Las células de Schwann se aislaron de ratas adultas de 3 semanas de edad, y los nervios ciáticos se digirieron enzimáticamente. Las células de Schwann resultantes se purificaron mediante clasificación celular activada magnéticamente y se cultivaron en condiciones enriquecidas con neuregulina y forskolina. Después de 3 días de cultivo de explante del ganglio de la raíz dorsal, se agregaron 30,000 células de Schwann a un explante del ganglio de la raíz dorsal en un medio que contenía ácido ascórbico. Los primeros signos de mielinización se detectaron en el día 10 de cocultivo, a través de señales dispersas para la proteína básica de mielina en la tinción inmunocitoquímica. A partir del día 14, se formaron vainas de mielina y se propagaron a lo largo de los axones. La mielinización se puede cuantificar mediante tinción de proteínas básicas de mielina como una relación entre el área de mielinización y el área del axón, para tener en cuenta las diferencias en la densidad axonal. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para estudiar diversos aspectos de la mielinización periférica in vitro, lo cual es crucial para comprender la patología y las posibles oportunidades de tratamiento para la desmielinización y la neurodegeneración en enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas del sistema nervioso periférico.

Introducción

En el sistema nervioso periférico (SNP), la transducción rápida de información está mediada por axones envueltos en mielina. La mielinización de los axones es esencial para permitir la rápida propagación de los impulsos eléctricos, ya que la velocidad de conducción de las fibras nerviosas se correlaciona con el diámetro del axón y el grosor de la mielina¹. La señalización sensorial desde la periferia hasta el sistema nervioso central (SNC) se basa en la activación de neuronas sensoriales de primer orden que residen en agrandamientos de la raíz dorsal, denominados ganglios de la raíz dorsal (GRD). Para la formación y el mantenimiento de la mielina, la comunicación continua entre los axones y las células de Schwann, que son las células gliales mielinizantes en el SNP, es obligatoria².

Muchas enfermedades del SNP perturban la transducción de información por daño axonal primario o desmielinizante, lo que resulta en hipestesia o disestesia. Las neuronas sensoriales de primer orden tienen la capacidad de regenerarse en cierta medida después del daño neuronal, por una interacción compleja entre la neurona y las células de Schwann circundantes³. En este caso, las células de Schwann pueden someterse a una reprogramación celular para eliminar los desechos axonales y de mielina y promover la regeneración axonal, lo que resulta en la remielinización⁴. Comprender los mecanismos de mielinización en la salud y la enfermedad es importante, con el fin de encontrar posibles opciones de tratamiento para los trastornos desmielinizantes de la SNP. La mielina también puede ser dañada por neurotrauma agudo, y los enfoques para promover la mielinización para avanzar en la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico están bajo investigación⁵.

Nuestro conocimiento de la mielinización periférica se ha beneficiado en gran medida de los cocultivos mielinizantes de células de Schwann y neuronas sensoriales. Desde que se aplicaron los primeros abordajes ^6,7,8, la mielinización ha sido intensamente estudiada con el uso de diferentes sistemas de cocultivo^9,10,11. Aquí, proporcionamos un protocolo rápido y fácil para la mielinización in vitro robusta de los axones ganglionares de la raíz dorsal. El protocolo para la preparación de células de Schwann se basa en el protocolo de Andersen et al.12, publicado previamente en Pitarokoili et ^al.13. Utilizamos células de Schwann derivadas de ratas jóvenes y cultivos embrionarios de explante DRG para el cocultivo, en el que la mielinización ocurre alrededor del día 14. El objetivo del método es proporcionar un sistema para investigar la formación de mielina como resultado de la interacción directa axón-célula de Schwann, y estudiar los moduladores de la mielinización del SNP. En comparación con los cultivos celulares neuronales disociados, los explantes de DRG se conservan más anatómicamente y forman procesos axonales largos. La cuantificación del área del axón mielinizado proporciona una lectura suficiente para la mielinización en el cocultivo. El método es una herramienta valiosa para detectar compuestos terapéuticos por su efecto potencial sobre la mielinización del SNP, y también puede ser utilizado además de estudios in vivo en modelos animales¹⁴.

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Cultivo celular de Schwann

1. Recubrimiento para cultivo celular de Schwann
   1. Cubra las placas de cultivo celular en condiciones estériles. Aplicar 2 ml de poli-L-lisina (PLL) al 0,01% en dos placas de cultivo de tejidos (CT) de 60 mm cada una e incubar durante la noche a 4 °C.
   2. Retirar el PLL, lavar los platos TC 2x con agua destilada e incubar con 2 mL de laminina 1 μg/^cm2 durante la noche a 4 °C. Lave los platos TC 2x con aqua dest y deje que los platos se sequen al aire.
2. Preparación del medio para el cultivo celular de Schwann
   1. Prepare 50 ml de medio celular de Schwann agregando 10% de suero fetal de ternera (FCS) inactivado por calor, 2 μM de forskolina, 10 nM de neuregulina y 50 μg / ml de gentamicina al medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) / F-12 (glucosa alta) en condiciones estériles.
   2. Preparar 70 ml de medio L-15 de Leibovitz con 50 μg/ml de gentamicina en condiciones estériles.
3. Preparación del nervio ciático
   NOTA: Todos los pasos de preparación del nervio ciático se realizan bajo un banco limpio.
   1. Prepare un plato de TC de 100 mm con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco helada sin Ca 2+ y Mg²⁺, un plato de TC de 100 mm con 5 ml de medio L-15 de Leibovitz helado y un plato TC de 100 mm con 5 ml de medio L-15 de Leibovitz helado y 50 μg/ml de gentamicina.
   2. Limpie todos los instrumentos en autoclave. Rocíe los instrumentos y el área de trabajo con etanol al 70%.
   3. Eutanasia de cinco ratas Sprague Dawley macho de 3 semanas de edad usando inhalación y decapitación de_CO2 . Rocíe el torso de la rata con etanol al 70%.
   4. Abra la extremidad inferior izquierda dorsal con tijeras y retire el músculo bíceps femoral con cuidado. Afloje el nervio ciático mediante una elevación suave con fórceps curvos, asegurándose de no magullar el nervio.
   5. Sostenga la parte más proximal del nervio con los fórceps curvos para enderezar el nervio y sujete el nervio lo más alto posible con tijeras. Luego, recorte el nervio cerca del plexo sacro y la pata con tijeras. Repita los pasos 1.3.4-1.3.5 para el lado derecho.
      NOTA: Al abrir la extremidad, tenga cuidado de no magullar ningún vaso sanguíneo.
   6. Usando fórceps, coloque los nervios ciáticos izquierdo y derecho en una placa TC de 100 mm con DPBS helado.
4. Renovación del nervio ciático
   1. Use fórceps para transferir todos los nervios a una placa TC de 100 mm con medio L-15 de Leibovitz helado y gentamicina de 50 μg/ml. Continúe usando un microscopio estereoscópico y elimine la grasa, los músculos y los vasos sanguíneos de los nervios con dos pares de pinzas finas. Agarre los nervios con fórceps y transfiéralos a un plato TC de 100 mm con el medio L-15 de Leibovitz helado.
   2. Identificar los extremos proximal y distal del nervio ciático. Retire el epineuro con un par de pinzas finas en dirección proximal a distal, mientras sostiene el extremo del nervio proximal con el segundo par de pinzas finas.
   3. Transfiera los nervios purificados a una placa TC de 100 mm con medio L-15 de Leibovitz helado y gentamicina de 50 μg/ml. Realice burlas de los fascículos nerviosos aislados para separar y aislar fibras nerviosas individuales usando dos pares de pinzas finas.
   4. Transfiera las fibras nerviosas a un tubo de 50 ml utilizando una pipeta serológica de 10 ml y tome el menor medio posible. Agregue 50 ml de medio L-15 de Leibovitz con 50 μg / ml de gentamicina a las fibras nerviosas y lea varias veces en el tubo de 50 ml.
5. Digestión enzimática del nervio ciático
   NOTA: Los siguientes pasos (pasos 1.5-1.8, 2.1 y 2.2) se realizan en condiciones estériles.
   1. Prepare la solución de digestión enzimática que contiene 0,25% de dispasa II, 0,05% de colagenasa tipo I y 50 μg/ml de gentamicina en 10 ml de DMEM (glucosa alta).
   2. Centrifugar el tubo a 188 x g durante 5 min a 4 °C, extraer el sobrenadante con una pipeta serológica de 25 ml y transferir el pellet con el medio L-15 restante de Leibovitz a una placa TC de 60 mm utilizando una pipeta de 1.000 ml.
   3. Enjuague el tubo de 50 ml con 10 ml de la solución de digestión enzimática y agréguelo al plato que contiene las fibras nerviosas. Distribuya el tejido en el plato cuidadosamente con la punta de una pipeta para maximizar la superficie accesible para la digestión.
   4. Incubar a 37 °C y 5% de_CO2 durante 18 h, y detener la digestión añadiendo 10 ml de FCS al 40% en la solución salina equilibrada de Hanks, sin Ca² y Mg²⁺ (HBSS).
6. Separación celular
   1. Transfiera los nervios digeridos a un tubo de 50 ml utilizando una pipeta serológica y centrifugar a 188 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 ml de DMEM que contenga 10% de FCS y 50 μg/ml de gentamicina. Vuelva a suspender el pellet 20 veces posteriormente, utilizando una punta de pipeta de 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml y 200 μl.
   2. Filtrar la suspensión celular a través de un filtro celular de 100 μm y centrifugar a 188 x g durante 10 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet con 4 mL de DMEM que contenga 10% de FCS y 50 μg/ml de gentamicina.
   3. Añadir 2 ml de la suspensión celular a cada una de las dos placas de TC de 60 mm recubiertas de PLL y laminina, e incubar a 37 °C y 5% de_CO2. Deje las placas intactas durante 2 días en la incubadora para proteger las células del estrés mecánico y para apoyar la adherencia.
7. Diferenciación celular de Schwann
   1. Después de 2 días, retire el medio y enjuague cuidadosamente las placas 2x con DMEM (glucosa alta), 10% FCS y 50 μg / ml de gentamicina. Después, agregue 2 ml de medio celular de Schwann. Reemplace el medio celular de Schwann cada^2º día, y observe la apariencia y confluencia celular usando un microscopio.
      NOTA: Las células de Schwann y los explantes DRG deben prepararse de manera oportuna y coordinada para el cocultivo. Asegúrese de que una rata con embriones en E 13.5 esté disponible para la preparación de DRG cuando las células de Schwann estén cerca de una confluencia del 80%.
8. Tripsinización celular y separación magnética
   NOTA: Para obtener imágenes ejemplares de diferentes etapas de cultivo celular de Schwann, ver Figura complementaria 1.
   1. Cuando las células alcancen una confluencia de aproximadamente 80% (6-12 días de cultivo), lavar cuidadosamente las placas 2x con 3 mL de DPBS e incubar con 2 mL de tripsina/EDTA al 0,05% (precalentado a 37 °C) durante 3 min. Cuando las células se desprenden del fondo de la placa, inactivar la digestión mediante la adición de 2 ml de DMEM con 10% de FCS y 50 μg / ml de gentamicina.
      NOTA: Apéguese a un tiempo de tripsinización de estrictamente 3 minutos, y proceda rápidamente después.
   2. Resuspender el pellet celular en 2 ml de tampón de separación celular magnética que contenga DPBS con 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 nM EDTA. Combine 10 μL de la suspensión celular con 10 μL de azul de tripano y cuente las células utilizando una cámara de tinción.
   3. Centrifugar la suspensión celular a 188 x g durante 10 min a 4 °C y resuspender el pellet celular en 90 μL de tampón magnético de separación celular por 1 x 10⁷ células. Añadir 10 μL de microperlas Thy-1 por 1 x 10⁷ células. Vuelva a suspender la solución varias veces e incubar durante 15 minutos en la oscuridad a 8 °C.
   4. Añadir 2 ml del tampón de separación de células magnéticas a la suspensión celular y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μL de tampón de separación de células magnéticas.
   5. Humedezca la columna de separación de células magnéticas con 1 ml de tampón de separación de células magnéticas. Coloque la columna de separación de células magnéticas en el separador de células magnéticas. Aplique las celdas a la columna de separación de células magnéticas. Recoger el flujo y centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 10 min.
      NOTA: Los fibroblastos se seleccionan positivamente y permanecen en la columna, mientras que las células de Schwann pasan por la columna. Los fibroblastos se pueden recolectar con un sello (por ejemplo, como control negativo para los protocolos de tinción de células de Schwann).
   6. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml del medio de cocultivo (ver paso 3.1.1). Cuente las células después de la tinción con azul de tripano y una cámara de tinción.

2. Cultivo de explante DRG

1. Preparación del medio de crecimiento DRG
   1. Prepare el medio de crecimiento DRG agregando 2% de B27, 2% de suero de caballo, 1% de L-glutamina, 0.5% de penicilina/estreptomicina y 10 ng / ml de factor de crecimiento nervioso (NGF) al medio neurobasal. Conservar el medio de cultivo a 4 °C.
      NOTA: El medio de crecimiento se puede utilizar durante 2 días.
2. Recubrimiento para explantes DRG
   1. Incubar los cubedores en etanol al 70% durante 1 h y colóquelos en los pocillos de los platos de 4 pocillos utilizando pinzas curvas. Después de que el etanol se haya secado, aplicar 300 μL de 0,2 mg/ml de poli-D-lisina (PDL) por pocillo e incubar durante la noche a 37 °C y 5% de_CO2.
   2. Lave los cubreobjetos 3 veces durante 5 minutos cada uno con DPBS consecutivamente. Retire el DPBS, aplique 300 μL de laminina de 1 μg/ml a los cubreobjetos e incube durante la noche a 37 °C y 5% de_CO2.
   3. Después de tres pasos de lavado con DPBS durante 5 minutos, reemplace el DPBS con 190 μL de medio de crecimiento DRG. Colocar las placas de 4 pocillos en la incubadora a 37 °C y al 5% de_CO2.
3. Preparación DRG
   NOTA: Coseche el DRG de ratas embrionarias bajo un banco limpio.
   1. Antes de la preparación, limpie todos los instrumentos con etanol al 70%. Llene 10 (dos por embrión) platos de TC de 35 mm con 2 ml de HBSS helado por plato, y dos platos de TC de 100 mm con 5 ml de HBSS helado por plato.
   2. Eutanasia de las ratas preñadas (hembras adultas de ratas Sprague Dawley, E13.5) por inhalación y decapitación de_CO2 .
   3. Rocíe el cuerpo con etanol al 70% y abra el torso ventral de la rata. Retire con cuidado el útero y colóquelo en una placa TC de 100 mm con HBSS helado.
   4. Sostenga el útero con fórceps curvos y abra la pared del útero con fórceps finos. Retire un saco amniótico y ábralo cuidadosamente pellizcando un orificio con fórceps finos.
   5. Retire el embrión de los tejidos circundantes, corte el cordón umbilical y decapite el embrión con fórceps finos. Coloque el torso en una placa TC de 100 mm llena de HBSS usando pinzas curvas y una espátula.
   6. Retire rápidamente todos los embriones del útero y transfiéralos a una placa TC de 100 mm llena de HBSS. Si hay más de cinco embriones, preparar una placa adicional de 35 mm TC con 2 ml de HBSS, de acuerdo con el paso 2.3.1.
   7. Coloque suavemente el torso de un embrión en una placa TC de 35 mm llena de HBSS usando una espátula y pinzas curvas. Bajo un microscopio estereoscópico, abra la parte dorsal del torso para dividir el embrión en dos mitades usando fórceps finos y microtijeras. Gire una mitad hacia un lado e identifique la hebra de DRG ubicada en una línea en la parte dorsal del embrión.
   8. Corte el DRG como una hebra completa usando pinzas finas y micro tijeras. Coloque el DRG en una placa fresca de TC de 35 mm llena de 2 ml de HBSS y separe un solo DRG del tejido restante con pinzas finas y microtijeras.
4. Cultivo celular DRG
   1. Tome placas de 4 pocillos que contengan 190 μL de medio de crecimiento DRG de la incubadora al banco limpio donde se preparará el DRG. Transfiera un solo DRG cuidadosamente a un pocillo de una placa de cultivo de 4 pocillos usando fórceps finos y una espátula. Coloque el DRG en el centro de cada pozo, ya que una posición central es importante para la fijación del DRG.
   2. Trabaje en condiciones estériles a partir de ahora. Colocar los cultivos de explante en la incubadora a 37 °C y 5% de_CO2. Al día siguiente, añadir 50 μL del medio de crecimiento DRG cuidadosamente a cada pocillo con una pipeta de 100 ml.
   3. Observe la adherencia al explante de DRG y el crecimiento de axones usando un microscopio diariamente, y deseche los explantes de DRG que se hayan desprendido del cubreobjetos o no hayan superado los axones en el día 3 de cultivo.
      NOTA: Los explantes DRG son muy frágiles en los primeros días de cultivo y deben manejarse con cuidado, especialmente cuando se mueven las placas dentro y fuera de la incubadora cuando se cambia el medio, o incluso cuando se cierra la puerta de la incubadora. El volumen preciso de 190 μL de medio por pocillo es crucial para mantener los explantes DRG en su lugar durante el primer día de cultivo. Los explantes DRG sueltos se pueden identificar fácilmente durante el control diario, ya que nadan en el medio en lugar de adherirse al cubreobjetos.

3. Cocultura

1. Transferencia de células de Schwann al cultivo de explante DRG
   1. Preparar el medio de cocultivo añadiendo ácido ascórbico al 0,1% al medio de crecimiento DRG.
   2. En el día 3 del cultivo de explante de DRG, reemplace cuidadosamente el medio de crecimiento DRG con 250 μL del medio de cocultivo que contiene 30,000 células de Schwann (del paso 1.8) por pocillo.
   3. Mantenga el cocultivo de los explantes DRG y las células de Schwann hasta por 22 días. Reemplace 250 μL del medio de cocultivo cuidadosamente cada dos días y observe la apariencia de las células con un microscopio.
      NOTA: Para ver un ejemplo de axones DRG y células de Schwann en el cocultivo en los primeros días de cultivo, ver Figura 1.
2. Tinción inmunocitoquímica
   NOTA: Manipule las muestras de cocultivo con mucho cuidado durante el procedimiento de tinción, ya que pueden dañarse fácilmente.
   1. Para fijar las células en los cubreobjetos, retire el medio lentamente, lave 3 veces con DPBS cuidadosamente e incube en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 10 min. Reemplace el PFA con DPBS y almacene las celdas fijas a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
      PRECAUCIÓN: Cuando manipule PFA al 4%, use el equipo de protección personal recomendado.
   2. Lave los cubreobjetos 3 veces con DPBS durante 5 minutos, luego bloquee con solución de bloqueo (10% de suero de cabra, 10% de albúmina sérica bovina [BSA], 0,1% de gelatina y Triton X-100 al 0,05%) en DPBS durante 1 h. Diluir los anticuerpos primarios βIII-tubulina (1:7.500) y la proteína básica de mielina (MBP) (1:750) en la solución bloqueante, e incubar durante la noche a 4 °C.
   3. Lave las celdas 3 veces con DPBS durante 5 min. Utilice anticuerpos secundarios conjugados con colorante fluorescente en una dilución de 1:1.000 en solución de bloqueo e incube durante 2 h a temperatura ambiente (RT).
   4. Lave las celdas 3 veces con DPBS durante 5 minutos y monte las células en portaobjetos microscópicos con medio de montaje de fluorescencia, incluido el 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Conservar los portaobjetos en la oscuridad a 4 °C hasta que estén documentados de forma microscópica.
      PRECAUCIÓN: Cuando manipule un medio de montaje de fluorescencia, use el equipo de protección personal recomendado.
3. Análisis
   1. Tome fotografías de ocho regiones definidas que rodean el explante de DRG en el centro con un microscopio invertido.
   2. Utilice una aplicación de software de análisis de imágenes para cuantificar las áreas de axones βIII-tubulina positivos y mielinización teñidos por MBP.
   3. Calcular el porcentaje de mielinización como una relación entre los axones mielinizados y los axones no mielinizados.

Resultados

La mielinización en el cocultivo se evaluó en los días 10, 12, 14, 16, 18 y 20. Los explantes de DRG y las células de Schwann se tiñeron para MBP, βIII-tubulina y DAPI. La red axonal en el cocultivo fue densa y no cambió visiblemente en el curso temporal de la observación. Los primeros signos de mielina, en forma de pequeños fragmentos, fueron detectables el día 10 y aumentaron el día 12 (Figura 2). Las áreas positivas para MBP aumentaron con el tiempo hasta el día 20 de cultura...

Discusión

Aquí, presentamos un protocolo rápido y fácil para la generación de mielinización in vitro mediante la fusión de dos cultivos de tipo celular separados, células de Schwann y explantes ganglionares de la raíz dorsal.

Un paso crítico del protocolo es el cultivo de explantes DRG, especialmente en los primeros días de cultivo. Los DRG son muy frágiles antes de que se construya una red axonal fuerte y deben manejarse con mucho cuidado, por ejemplo, cuando se sacan de la incubado...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-MBP, rabbit	Novus Biologicals, Centannial, USA	ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse	Biolegend, San Diego, USA	657402
Ascorbic acid	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	A4403-100MG
B27-supplement	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70765210
Bovine serum albumin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8076.4
Cell strainer, 100 µM	BD Bioscience, Heidelberg, Germany	352360
Centrifuge 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5811000015
CO2 Incubator Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Coverslips 12 mm	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P231.1
Curved fine forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-42
DAPI fluoromount-G(R)	Biozol, Eching, Germany	SBA-0100-20
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	4942078001
Distilled water (Water Purification System)	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D8537-6X500ML
Ethanol	VWR, Radnor, USA	1009862500
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F7524	FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11252-20
Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-40
Forskolin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F6886-10MG
Gelatin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	G1393-20ML
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	14170138
HERAcell Incubator	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Heraguard ECO 1.2	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51029882
Horse serum	Pan-Biotech, Aidenbach, Germany	P30-0712
Image J Software	HIH, Bethesda, USA
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	11415064
L-Glutamine 200 mM	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25030024
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130042303
Microscissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15000-08
Microscope	Motic, Wetzlar, Germany	Motic BA 400
Microscope Axio observer 7	Zeiss, Oberkochen, Germany	491917-0001-000
Microscope slide	VWR, Radnor, USA	630-1985
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130091632
MS columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-201
Neubauer counting chamber	Assistant, Erlangen, Germany	40441
Neuregulin	Peprotech, Rocky Hill, USA	100-03
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	21103049
NGF	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	N1408
Normal goat serum	Biozol, Eching, Germany	S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D6789
Paraformaldehyde	Acros Organics, New Jersey, USA	10342243
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15140-122
Pipetboy	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	4430000018
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	2231300004
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P6407-5MG
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62554502
Reaction tubes, 50 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62547254
Reaction vessels, 1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
Safety Cabinet S2020 1.8	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51026640
Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14083-08
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861254025
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861685001
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861253001
Spatula	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8	Zeiss, Oberkochen, Germany	495015-0012-000
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14007-14
TC dish 100, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833902300
TC dish 35, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833900300
TC dish 60, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-094-523
Triton X-100	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25300-054
Type I Collagenase	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	C1639
Water bath type 1008	GFL, Burgwedel, Germany	4285