Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann

Resumo

No sistema de cocultura dos gânglios da raiz dorsal e células de Schwann, a mielinização do sistema nervoso periférico pode ser estudada. Este modelo oferece oportunidades experimentais para observar e quantificar a mielinização periférica e estudar os efeitos de compostos de interesse sobre a bainha de mielina.

Resumo

O processo de mielinização é essencial para permitir a transdução rápida e suficiente do sinal no sistema nervoso. No sistema nervoso periférico, neurônios e células de Schwann se envolvem em uma interação complexa para controlar a mielinização dos axônios. Distúrbios dessa interação e quebra da bainha de mielina são características das neuropatias inflamatórias e ocorrem secundariamente em doenças neurodegenerativas. Aqui, apresentamos um modelo de cocultura de explantes do gânglio da raiz dorsal e células de Schwann, que desenvolve uma mielinização robusta de axônios periféricos para investigar o processo de mielinização no sistema nervoso periférico, estudar as interações axônio-célula de Schwann e avaliar os potenciais efeitos dos agentes terapêuticos sobre cada tipo celular separadamente. Metodologicamente, gânglios da raiz dorsal de ratos embrionários (E13.5) foram colhidos, dissociados de seu tecido circundante e cultivados como explantes inteiros por 3 dias. Células de Schwann foram isoladas de ratos adultos com 3 semanas de idade, e os nervos ciáticos foram digeridos enzimaticamente. As células de Schwann resultantes foram purificadas por triagem celular ativada por magnetismo e cultivadas sob condições enriquecidas com neuregulina e forskolina. Após 3 dias de cultura do explante do gânglio da raiz dorsal, 30.000 células de Schwann foram adicionadas a um explante do gânglio da raiz dorsal em meio contendo ácido ascórbico. Os primeiros sinais de mielinização foram detectados no 10º dia de cocultivo, através de sinais esparsos para proteína básica de mielina na coloração imunocitoquímica. A partir do 14º dia, bainhas de mielina foram formadas e propagadas ao longo dos axônios. A mielinização pode ser quantificada pela coloração da proteína básica da mielina como uma razão entre a área de mielinização e a área axonal, para explicar as diferenças na densidade axonal. Este modelo oferece oportunidades experimentais para o estudo de vários aspectos da mielinização periférica in vitro, o que é crucial para a compreensão da patologia e possíveis oportunidades de tratamento para desmielinização e neurodegeneração em doenças inflamatórias e neurodegenerativas do sistema nervoso periférico.

Introdução

No sistema nervoso periférico (SNP), a rápida transdução de informação é mediada por axônios envoltos em mielina. A mielinização dos axônios é essencial para permitir a rápida propagação dos impulsos elétricos, uma vez que a velocidade de condução das fibras nervosas correlaciona-se com o diâmetro do axônio e a espessura da mielina¹. A sinalização sensorial da periferia para o sistema nervoso central (SNC) depende da ativação de neurônios sensoriais de primeira ordem que residem em ampliações da raiz dorsal, denominados gânglios da raiz dorsal (DRG). Para a formação e manutenção da mielina,^{é obrigatória a} comunicação contínua entre os axônios e as células de Schwann, que são as células mielinizantes da Glia no SNP2.

Muitas doenças dos SPN perturbam a transdução de informações por dano axonal primário ou desmielinizante, resultando em hipoestesia ou disestesia. Os neurônios sensoriais de primeira ordem têm a capacidade de se regenerar até certo ponto após dano neuronal, por meio de uma complexa interação entre o neurônio e as células de Schwann^{circundantes 3}. Nesse caso, as células de Schwann podem sofrer reprogramação celular para limpar debris axonais e mielínicos e promover regeneração axonal, resultando em remielinização⁴. A compreensão dos mecanismos da mielinização na saúde e na doença é importante, a fim de encontrar possíveis opções de tratamento para as desordens desmielinizantes dos SPN. A mielina também pode ser lesada por neurotrauma agudo, e abordagens para promover mielinização para avançar na recuperação funcional após lesão de nervo periférico estão sendo investigadas⁵.

Nosso conhecimento da mielinização periférica tem se beneficiado em grande parte das coculturas mielinizantes de células de Schwann e neurônios sensoriais. Desde as primeiras^{abordagens 6,7,8}, a mielinização tem sido intensamente estudada com o uso de diferentes sistemas de cocultura9,10,11. Aqui, fornecemos um protocolo rápido e fácil para mielinização in vitro robusta de axônios ganglionares da raiz dorsal. O protocolo para preparação de células de Schwann é baseado no protocolo de Andersen et al.12, publicado anteriormente em Pitarokoili et ^al.13. Utilizamos células de Schwann derivadas de ratos juvenis e culturas embrionárias de explantes DRG para a cocultura, na qual a mielinização ocorre por volta do 14º dia. O objetivo do método é fornecer um sistema para investigar a formação de mielina como resultado da interação direta axônio-célula de Schwann, e estudar moduladores da mielinização do SNP. Em comparação com culturas de células neuronais dissociadas, os explantes DRG são mais anatomicamente preservados e formam processos axonais longos. A quantificação da área do axônio mielinizado fornece uma leitura suficiente para mielinização na cocultura. O método é uma ferramenta valiosa para triagem de compostos terapêuticos quanto ao seu potencial efeito sobre a mielinização dos SPN, podendo também ser utilizado em complemento a estudos in vivo em modelos^animais14.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. Cultura de células de Schwann

1. Revestimento para cultura de células de Schwann
   1. Revestir as placas de cultura celular em condições estéreis. Aplicar 2 mL de poli-L-lisina (PLL) a 0,01% em duas placas de cultura de tecidos (CT) de 60 mm cada e incubar durante a noite a 4 °C.
   2. Retire o PLL, lave as placas de TC 2x com água destilada e incube com 2 mL de laminina 1 μg/cm² durante a noite a 4 °C. Lave as placas TC 2x com aqua dest, e deixe as placas secarem ao ar.
2. Preparo do meio para cultura de células de Schwann
   1. Preparar 50 mL de meio celular de Schwann adicionando 10% de soro fetal inativado por calor (FCS), 2 μM de forskolina, 10 nM de neuregulina e 50 μg/mL de gentamicina ao meio de Dulbecco Modified Eagle (DMEM)/F-12 (alta glicose) em condições estéreis.
   2. Preparar 70 mL de meio L-15 de Leibovitz com 50 μg/mL de gentamicina em condições estéreis.
3. Preparo do nervo ciático
   NOTA: Todas as etapas de preparação do nervo ciático são realizadas sob uma bancada limpa.
   1. Preparar uma placa TC de 100 mm com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco gelada (DPBS) sem Ca 2+ e Mg²⁺, uma placa de TC de 100 mm com 5 mL de meio L-15 de Leibovitz gelado e uma placa de TC de 100 mm com 5 mL de meio L-15 de Leibovitz gelado e 50 μg/mL de gentamicina.
   2. Limpe todos os instrumentos por autoclavagem. Borrife os instrumentos e a área de trabalho com etanol 70%.
   3. Eutanásia de cinco ratos machos Sprague Dawley com 3 semanas de idade usando inalação e decapitação de CO₂ . Borrifar o tronco do rato com etanol 70%.
   4. Abra o dorso inferior esquerdo com tesoura e remova o músculo bíceps femoral cuidadosamente. Solte o nervo ciático por elevação suave com pinça curva, garantindo não machucar o nervo.
   5. Segure a parte mais proximal do nervo com a pinça curva para endireitar o nervo e prenda o nervo o mais alto possível usando uma tesoura. Em seguida, clipe o nervo próximo ao plexo sacral e à pata com tesoura. Repita as etapas 1.3.4-1.3.5 para o lado direito.
      NOTA: Ao abrir o membro, tome cuidado para não machucar nenhum vaso sanguíneo.
   6. Usando pinças, colocar os nervos ciáticos esquerdo e direito em uma placa de TC de 100 mm com DPBS gelada.
4. Remodelação do nervo ciático
   1. Use pinça para transferir todos os nervos para uma placa de TC de 100 mm com meio L-15 de Leibovitz gelado e gentamicina de 50 μg/mL. Continue usando um estereomicroscópio e remova gordura, músculo e vasos sanguíneos dos nervos com dois pares de pinças finas. Pegue os nervos com pinça e transfira-os para um prato TC de 100 mm com o meio L-15 de Leibovitz gelado.
   2. Identificar as extremidades proximal e distal do nervo ciático. Remova o epineuro com um par de pinças finas no sentido proximal a distal, mantendo a extremidade proximal do nervo com o segundo par de pinças finas.
   3. Transferir os nervos purificados para uma placa de TC de 100 mm com meio L-15 de Leibovitz gelado e gentamicina 50 μg/mL. Provocar os fascículos nervosos isolados para separar e isolar fibras nervosas únicas usando dois pares de pinças finas.
   4. Transfira as fibras nervosas para um tubo de 50 mL usando uma pipeta sorológica de 10 mL e use o mínimo de meio possível. Adicionar 50 mL de meio L-15 de Leibovitz com 50 μg/mL de gentamicina às fibras nervosas e rodar algumas vezes no tubo de 50 mL.
5. Digestão enzimática do nervo ciático
   Observação : as próximas etapas (etapas 1.5-1.8, 2.1 e 2.2) são executadas em condições estéreis.
   1. Preparar a solução de digestão enzimática contendo 0,25% dispase II, 0,05% colagenase tipo I e 50 μg/mL de gentamicina em 10 mL de DMEM (glicose alta).
   2. Centrifugar o tubo a 188 x g durante 5 minutos a 4 °C, remover o sobrenadante com uma pipeta serológica de 25 ml e transferir o pellet com o restante meio L-15 de Leibovitz para uma placa TC de 60 mm utilizando uma pipeta de 1.000 ml.
   3. Enxaguar o tubo de 50 mL com 10 mL da solução de digestão enzimática e adicioná-lo à placa que contém as fibras nervosas. Distribua o tecido no prato cuidadosamente com a ponta de uma pipeta para maximizar a superfície acessível para a digestão.
   4. Incubar a 37 °C e 5% CO 2 por 18 h e interromper a digestão adicionando 10 mL de SFB a 40% em solução salina balanceada de Hanks, sem Ca₂ e Mg²⁺ (HBSS).
6. Separação celular
   1. Transfira os nervos digeridos para um tubo de 50 mL usando uma pipeta sorológica e centrífuga a 188 x g por 10 min a 4 °C. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 mL de DMEM contendo SFB a 10% e gentamicina a 50 μg/mL. Ressuspender o pellet 20 vezes posteriormente, usando uma ponteira de pipeta de 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL e 200 μL.
   2. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 100 μm e centrifugar a 188 x g durante 10 min a 4 °C. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet com 4 mL de DMEM contendo SFB a 10% e gentamicina a 50 μg/mL.
   3. Adicionar 2 ml da suspensão celular a cada uma das duas placas de TC de 60 mm revestidas com PLL e laminina e incubar a 37 °C e 5% de CO₂. Deixe as placas intactas por 2 dias na incubadora para proteger as células do estresse mecânico e suportar a aderência.
7. Diferenciação celular de Schwann
   1. Após 2 dias, retirar o meio e enxaguar cuidadosamente as placas 2x com DMEM (glicose alta), SFB a 10% e gentamicina 50g/mL. Em seguida, adicionar 2 mL de meio celular de Schwann. Substitua o meio celular de Schwann a cada 2^dias e observe a aparência e confluência das células usando um microscópio.
      NOTA: As células de Schwann e os explantes DRG precisam ser preparados de forma oportuna e coordenada para o cocultivo. Certifique-se de que um rato com embriões em E 13.5 está disponível para preparação de DRG quando as células de Schwann estiverem próximas de uma confluência de 80%.
8. Tripsinização celular e separação magnética
   NOTA: Para obter imagens exemplares de diferentes estágios de cultura de células de Schwann, consulte a Figura Suplementar 1.
   1. Quando as células atingirem uma confluência de cerca de 80% (6-12 dias de cultura), lavar cuidadosamente as placas 2x com 3 mL de DPBS e incubar com 2 mL de tripsina/EDTA a 0,05% (pré-aquecido a 37 °C) por 3 min. Quando as células se desprendem do fundo da placa, inativam a digestão pela adição de 2 mL de DMEM com SFB a 10% e gentamicina a 50 μg/mL.
      NOTA: Mantenha um tempo de tripsinização de estritamente 3 min, e prossiga rapidamente depois.
   2. Ressuspender o pellet celular em 2 mL de tampão de separação magnética contendo DPBS com albumina de soro bovino (BSA) a 0,5% e EDTA 2 nM. Combinar 10 μL da suspensão celular com 10 μL de azul de tripano e contar as células usando uma câmara de coloração.
   3. Centrifugar a suspensão celular a 188 x g durante 10 min a 4 °C e ressuspender a pastilha celular em 90 μL de tampão de separação de células magnéticas por 1 x 10⁷ células. Adicionar 10 μL de microesferas Thy-1 por 1 x 10⁷ células. Ressuspender a solução algumas vezes e incubar durante 15 minutos no escuro a 8 °C.
   4. Adicionar 2 ml do tampão de separação de células magnéticas à suspensão celular e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão de separação de células magnéticas.
   5. Umedeça a coluna de separação de células magnéticas com 1 mL do tampão de separação de células magnéticas. Coloque a coluna de separação de células magnéticas no separador de células magnéticas. Aplique as células à coluna de separação de células magnéticas. Recolher o fluxo e centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 10 min.
      NOTA: Os fibroblastos são selecionados positivamente e permanecem na coluna, enquanto as células de Schwann passam pela coluna. Os fibroblastos podem ser coletados com um carimbo (por exemplo, como controle negativo para protocolos de coloração de células de Schwann).
   6. Eliminar o sobrenadante e voltar a suspender o pellet em 1 ml do meio de cocultura (ver passo 3.1.1). Contar as células após coloração com azul de tripano e uma câmara de coloração.

2. Cultura de explantes DRG

1. Preparação do meio de crescimento DRG
   1. Preparar o meio de crescimento DRG adicionando 2% de B27, 2% de soro de cavalo, 1% de L-glutamina, 0,5% de penicilina/estreptomicina e 10 ng/mL de fator de crescimento nervoso (NGF) ao meio neurobasal. Conservar o meio de cultura a 4 °C.
      NOTA: O meio de crescimento pode ser usado por 2 dias.
2. Revestimento para explantes DRG
   1. Incubar as lamínulas em etanol 70% por 1 h e colocar nos poços de placas de 4 poços usando pinças curvas. Após a secagem do etanol, aplicar 300 μL de poli-D-lisina (PDL) 0,2 mg/mL por poço e incubar durante a noite a 37 °C e 5% de CO₂.
   2. Lave as lamínulas 3x por 5 min cada com DPBS consecutivamente. Retirar o DPBS, aplicar 300 μL de 1 μg/mL de laminina nas lamínulas e incubar durante a noite a 37 °C e 5% CO₂.
   3. Após três etapas de lavagem com DPBS por 5 min, substitua o DPBS por 190 μL de meio de crescimento DRG. Coloque as placas de 4 poços na incubadora a 37 °C e 5% CO_2.
3. Preparação para DRG
   NOTA: Colher o DRG de ratos embrionários sob uma bancada limpa.
   1. Antes do preparo, limpe todos os instrumentos com etanol 70%. Encher 10 (duas por embrião) placas de TC de 35 mm com 2 mL de HBSS gelado por prato, e duas placas de TC de 100 mm com 5 mL de HBSS gelado por prato.
   2. Eutanásia das ratas prenhes (fêmeas adultas de ratos Sprague Dawley, E13.5) por inalação e decapitação de CO₂ .
   3. Borrifar o corpo com etanol 70% e abrir o tronco ventral do rato. Retire cuidadosamente o útero e coloque-o em uma placa TC de 100 mm com HBSS gelado.
   4. Segure o útero usando pinças curvas e abra a parede do útero com pinças finas. Retire um saco amniótico e abra-o cuidadosamente apertando um orifício com pinça fina.
   5. Remova o embrião dos tecidos circundantes, corte o cordão umbilical e decapite o embrião usando pinças finas. Coloque o tronco em uma placa de TC de 100 mm preenchida com HBSS usando pinça curva e uma espátula.
   6. Retire rapidamente todos os embriões do útero e transfira-os para uma placa de 100 mm de TC preenchida com HBSS. Se houver mais de cinco embriões, preparar uma placa adicional de 35 mm de TC com 2 mL de HBSS, de acordo com a etapa 2.3.1.
   7. Coloque delicadamente um tronco embrionário em uma placa TC de 35 mm cheia de HBSS usando uma espátula e pinça curva. Sob um estereomicroscópio, abra a parte dorsal do tronco para dividir o embrião em duas metades usando pinça fina e microtesoura. Vire uma metade para o lado e identifique o fio de DRG localizado em uma linha na parte dorsal do embrião.
   8. Corte o fio DRG como um todo usando pinças finas e micro tesouras. Coloque o DRG em uma placa de TC de 35 mm fresca preenchida com 2 mL de HBSS e separe um único DRG do tecido restante usando pinça fina e microtesoura.
4. Cultura de células DRG
   1. Leve placas de 4 poços contendo 190 μL de meio de crescimento DRG da incubadora para a bancada limpa onde o DRG deve ser preparado. Transfira um único DRG cuidadosamente para um poço de uma placa de cultura de 4 poços usando pinça fina e uma espátula. Coloque o DRG no centro de cada poço, pois uma posição central é importante para a fixação do DRG.
   2. Trabalhe em condições estéreis a partir de agora. Colocar as culturas de explantes na estufa a 37 °C e 5% de CO₂. No dia seguinte, adicionar cuidadosamente 50 μL do meio de crescimento DRG a cada poço usando uma pipeta de 100 mL.
   3. Observe a aderência do explante DRG e a expansão do axônio usando um microscópio diariamente, e descarte os explantes DRG que se desprenderam da lamínula ou não conseguiram superar os axônios no dia 3 de cultura.
      OBS: Os explantes DRG são muito frágeis nos primeiros dias de cultivo e precisam ser manuseados com cuidado, principalmente ao movimentar as placas para dentro e para fora da incubadora quando o meio é trocado, ou mesmo ao fechar a porta da incubadora. O volume preciso de 190 μL de meio por poço é crucial para manter os explantes DRG no local durante o primeiro dia de cultivo. Explantes DRG soltos podem ser facilmente identificados durante o controle diário, pois nadam no meio em vez de aderir à lamínula.

3. Cocultura

1. Transferência de células de Schwann para a cultura de explantes DRG
   1. Preparar o meio de cocultura adicionando ácido ascórbico a 0,1% ao meio de cultura DRG.
   2. No dia 3 da cultura do explante DRG, substituir cuidadosamente o meio de crescimento DRG por 250 μL do meio de cocultura contendo 30.000 células de Schwann (a partir da etapa 1.8) por poço.
   3. Manter a cocultura dos explantes DRG e células de Schwann por até 22 dias. Substitua cuidadosamente 250 μL do meio de cocultura a cada dois dias e observe a aparência das células usando um microscópio.
      NOTA: Para obter um exemplo de axônios DRG e células de Schwann na cocultura nos primeiros dias de cultura, consulte a Figura 1.
2. Coloração imunocitoquímica
   OBS: Manusear as amostras de cocultura com extremo cuidado durante o procedimento de coloração, pois elas podem ser danificadas facilmente.
   1. Para fixar as células nas lamínulas, retire o meio lentamente, lave 3x com DPBS cuidadosamente e incube em paraformaldeído (PFA) a 4% por 10 min. Substitua o PFA por DPBS e armazene as células fixas a 4 °C por até 1 semana.
      CUIDADO: Ao manusear 4% de PFA, use o equipamento de proteção individual recomendado.
   2. Lavar as lamínulas 3x com DPBS por 5 min, em seguida, bloquear com solução de bloqueio (10% de soro de cabra, 10% de albumina de soro bovino [BSA], 0,1% de gelatina e 0,05% de Triton X-100) em DPBS por 1 h. Diluir os anticorpos primários βIII-tubulina (1:7.500) e proteína básica da mielina (MBP) (1:750) na solução de bloqueio e incubar durante a noite a 4 °C.
   3. Lave as células 3x com DPBS por 5 min. Use anticorpos secundários conjugados com corante fluorescente em uma diluição de 1:1.000 em solução de bloqueio e incube por 2 h à temperatura ambiente (TR).
   4. Lavar as células 3x com DPBS por 5 min e montar as células em lâminas microscópicas com meio de montagem de fluorescência, incluindo 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Conservar as lâminas no escuro a 4 °C até documentação microscópica.
      CUIDADO: Ao manusear o meio de montagem com fluorescência, use o equipamento de proteção individual recomendado.
3. Análise
   1. Tire fotos de oito regiões definidas ao redor do explante DRG no centro usando um microscópio invertido.
   2. Utilizar um software de análise de imagens para quantificar as áreas de axônios βIII-tubulina positiva e mielinização coradas pela MBP.
   3. Calcular a porcentagem de mielinização como uma proporção dos axônios mielinizados e axônios não mielinizados.

Resultados

A mielinização na cocultura foi avaliada nos dias 10, 12, 14, 16, 18 e 20. Os explantes DRG e as células de Schwann foram corados para MBP, βIII-tubulina e DAPI. A rede axonal na cocultura foi densa e não se alterou visivelmente no decorrer do tempo de observação. Os primeiros sinais de mielina, na forma de pequenos fragmentos, foram detectáveis no 10º dia e aumentaram no 12º dia (Figura 2). As áreas positivas para PAM aumentaram ao longo do tempo até o 20º dia de cultura. A mie...

Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo rápido e fácil para a geração de mielinização in vitro através da fusão de duas culturas de tipos celulares distintas, células de Schwann e explantes do gânglio da raiz dorsal.

Uma etapa crítica do protocolo é o cultivo de explantes DRG, especialmente nos primeiros dias de cultivo. Os DRG são muito frágeis antes que uma rede axonal forte seja construída e devem ser manuseados com muito cuidado, por exemplo, quando retirados da incubadora ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-MBP, rabbit	Novus Biologicals, Centannial, USA	ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse	Biolegend, San Diego, USA	657402
Ascorbic acid	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	A4403-100MG
B27-supplement	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70765210
Bovine serum albumin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8076.4
Cell strainer, 100 µM	BD Bioscience, Heidelberg, Germany	352360
Centrifuge 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5811000015
CO2 Incubator Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Coverslips 12 mm	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P231.1
Curved fine forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-42
DAPI fluoromount-G(R)	Biozol, Eching, Germany	SBA-0100-20
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	4942078001
Distilled water (Water Purification System)	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D8537-6X500ML
Ethanol	VWR, Radnor, USA	1009862500
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F7524	FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11252-20
Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-40
Forskolin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F6886-10MG
Gelatin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	G1393-20ML
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	14170138
HERAcell Incubator	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Heraguard ECO 1.2	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51029882
Horse serum	Pan-Biotech, Aidenbach, Germany	P30-0712
Image J Software	HIH, Bethesda, USA
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	11415064
L-Glutamine 200 mM	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25030024
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130042303
Microscissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15000-08
Microscope	Motic, Wetzlar, Germany	Motic BA 400
Microscope Axio observer 7	Zeiss, Oberkochen, Germany	491917-0001-000
Microscope slide	VWR, Radnor, USA	630-1985
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130091632
MS columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-201
Neubauer counting chamber	Assistant, Erlangen, Germany	40441
Neuregulin	Peprotech, Rocky Hill, USA	100-03
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	21103049
NGF	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	N1408
Normal goat serum	Biozol, Eching, Germany	S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D6789
Paraformaldehyde	Acros Organics, New Jersey, USA	10342243
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15140-122
Pipetboy	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	4430000018
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	2231300004
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P6407-5MG
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62554502
Reaction tubes, 50 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62547254
Reaction vessels, 1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
Safety Cabinet S2020 1.8	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51026640
Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14083-08
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861254025
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861685001
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861253001
Spatula	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8	Zeiss, Oberkochen, Germany	495015-0012-000
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14007-14
TC dish 100, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833902300
TC dish 35, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833900300
TC dish 60, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-094-523
Triton X-100	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25300-054
Type I Collagenase	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	C1639
Water bath type 1008	GFL, Burgwedel, Germany	4285