Mielinizzazione in vitro di assoni periferici in una cocoltura di espianti di ganglio di radice dorsale di ratto e cellule di Schwann

Riepilogo

Nel sistema di cocoltura dei gangli della radice dorsale e delle cellule di Schwann, può essere studiata la mielinizzazione del sistema nervoso periferico. Questo modello offre opportunità sperimentali per osservare e quantificare la mielinizzazione periferica e per studiare gli effetti dei composti di interesse sulla guaina mielinica.

Abstract

Il processo di mielinizzazione è essenziale per consentire una rapida e sufficiente trasduzione del segnale nel sistema nervoso. Nel sistema nervoso periferico, i neuroni e le cellule di Schwann si impegnano in una complessa interazione per controllare la mielinizzazione degli assoni. I disturbi di questa interazione e la rottura della guaina mielinica sono segni distintivi delle neuropatie infiammatorie e si verificano secondariamente nei disturbi neurodegenerativi. Qui, presentiamo un modello di cocoltura di espianti di ganglio di radice dorsale e cellule di Schwann, che sviluppa una robusta mielinizzazione degli assoni periferici per studiare il processo di mielinizzazione nel sistema nervoso periferico, studiare le interazioni assone-cellule di Schwann e valutare separatamente i potenziali effetti degli agenti terapeutici su ciascun tipo di cellula. Metodologicamente, i gangli delle radici dorsali di ratti embrionali (E13.5) sono stati raccolti, dissociati dal tessuto circostante e coltivati come espianti interi per 3 giorni. Le cellule di Schwann sono state isolate da ratti adulti di 3 settimane e i nervi sciatici sono stati digeriti enzimaticamente. Le cellule di Schwann risultanti sono state purificate mediante selezione cellulare attivata magneticamente e coltivate in condizioni arricchite di neuregulina e forskolina. Dopo 3 giorni di coltura dell'espianto del ganglio della radice dorsale, 30.000 cellule di Schwann sono state aggiunte a un espianto di ganglio della radice dorsale in un mezzo contenente acido ascorbico. I primi segni di mielinizzazione sono stati rilevati il giorno 10 della cocoltura, attraverso segnali sparsi per la proteina basica della mielina nella colorazione immunocitochimica. Dal giorno 14 in poi, le guaine mieliniche si sono formate e propagate lungo gli assoni. La mielinizzazione può essere quantificata dalla colorazione delle proteine basiche della mielina come rapporto tra l'area di mielinizzazione e l'area assone, per tenere conto delle differenze nella densità assonale. Questo modello offre opportunità sperimentali per studiare vari aspetti della mielinizzazione periferica in vitro, che è cruciale per comprendere la patologia e le possibili opportunità di trattamento per la demielinizzazione e la neurodegenerazione nelle malattie infiammatorie e neurodegenerative del sistema nervoso periferico.

Introduzione

Nel sistema nervoso periferico (PNS), la rapida trasduzione dell'informazione è mediata da assoni avvolti dalla mielina. La mielinizzazione degli assoni è essenziale per consentire la rapida propagazione degli impulsi elettrici, poiché la velocità di conduzione delle fibre nervose è correlata al diametro dell'assone e allo spessore della mielina¹. La segnalazione sensoriale dalla periferia al sistema nervoso centrale (SNC) si basa sull'attivazione di neuroni sensoriali di primo ordine che risiedono negli allargamenti della radice dorsale, chiamati gangli della radice dorsale (DRG). Per la formazione e il mantenimento della mielina, la comunicazione continua tra assoni e cellule di Schwann, che sono le cellule della glia mielinica nel PNS, è obbligatoria².

Molte malattie del PNS disturbano la trasduzione delle informazioni da parte di danni assonali primari o demielinizzanti, con conseguente ipestesia o disestesia. I neuroni sensoriali di primo ordine hanno la capacità di rigenerarsi in una certa misura dopo il danno neuronale, da una complessa interazione tra il neurone e le cellule di Schwann circostanti³. In questo caso, le cellule di Schwann possono subire una riprogrammazione cellulare per eliminare i detriti assonale e mielinico e promuovere la rigenerazione assonale, con conseguente rimielinizzazione⁴. Comprendere i meccanismi della mielinizzazione nella salute e nella malattia è importante, al fine di trovare possibili opzioni di trattamento per i disturbi demielinizzanti del PNS. La mielina può anche essere danneggiata da neurotraumi acuti e gli approcci per promuovere la mielinizzazione per far avanzare il recupero funzionale dopo la lesione del nervo periferico sono in fase di indagine⁵.

La nostra conoscenza della mielinizzazione periferica ha beneficiato in gran parte delle cocolture mieliniche di cellule di Schwann e neuroni sensoriali. Da quando sono stati applicati i primi approcci ^6,7,8, la mielinizzazione è stata studiata intensamente con l'uso di diversi sistemi di cocoltura 9,10,11. Qui, forniamo un protocollo rapido e semplice per la mielinizzazione in vitro robusta degli assoni del ganglio della radice dorsale. Il protocollo per la preparazione delle cellule di Schwann si basa sul protocollo di Andersen et al.12, precedentemente pubblicato su Pitarokoili et ^al.13. Utilizziamo cellule di Schwann derivate da ratti giovani e colture embrionali di espianti DRG per la cocoltura, in cui la mielinizzazione si verifica intorno al giorno 14. L'obiettivo del metodo è quello di fornire un sistema per studiare la formazione di mielina come risultato dell'interazione diretta assone-cellule di Schwann e di studiare i modulatori della mielinizzazione PNS. Rispetto alle colture cellulari neuronali dissociate, gli espianti di DRG sono più anatomicamente conservati e formano lunghi processi assonali. La quantificazione dell'area dell'assone mielinica fornisce una lettura sufficiente per la mielinizzazione nella cocoltura. Il metodo è uno strumento prezioso per lo screening dei composti terapeutici per il loro potenziale effetto sulla mielinizzazione PNS e può anche essere utilizzato in aggiunta agli studi in vivo in modelli animali¹⁴.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la direttiva del Consiglio delle Comunità europee per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Coltura cellulare di Schwann

1. Rivestimento per coltura cellulare Schwann
   1. Rivestire i piatti di coltura cellulare in condizioni sterili. Applicare 2 ml di poli-L-lisina (PLL) allo 0,01% su due piatti di coltura tissutale (TC) da 60 mm ciascuno e incubare per una notte a 4 °C.
   2. Rimuovere il PLL, lavare le stoviglie TC 2x con acqua distillata e incubare con 2 ml di 1 μg/cm² di laminina per una notte a 4 °C. Lavare i piatti TC 2 volte con acqua dest e lasciare asciugare i piatti all'aria.
2. Preparazione media per la coltura cellulare di Schwann
   1. Preparare 50 ml di terreno cellulare di Schwann aggiungendo il 10% di siero fetale di vitello inattivato dal calore (FCS), 2 μM di forskolina, 10 nM di neuregulina e 50 μg/mL di gentamicina al terreno di Dulbecco Modified Eagle (DMEM) / F-12 (alto glucosio) in condizioni sterili.
   2. Preparare 70 mL di terreno L-15 di Leibovitz con 50 μg/mL di gentamicina in condizioni sterili.
3. Preparazione del nervo sciatico
   NOTA: Tutte le fasi di preparazione del nervo sciatico vengono eseguite sotto una panca pulita.
   1. Preparare un piatto TC da 100 mm con 5 ml di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco ghiacciata (DPBS) senza Ca 2+ e Mg²⁺, una capsula TC da 100 mm con 5 ml di terreno L-15 di Leibovitz ghiacciato e una capsula TC da 100 mm con 5 ml di terreno L-15 di Leibovitz ghiacciato e 50 μg/mL di gentamicina.
   2. Pulire tutti gli strumenti in autoclave. Spruzzare gli strumenti e l'area di lavoro con etanolo al 70%.
   3. Eutanasia cinque ratti Sprague Dawley maschi di 3 settimane usando l'inalazione e la decapitazione di CO₂ . Spruzzare il torso del ratto con etanolo al 70%.
   4. Aprire l'arto inferiore sinistro dorsale con le forbici e rimuovere con cura il muscolo bicipite femorale. Allentare il nervo sciatico con un'elevazione liscia con una pinza curva, assicurandosi di non ferire il nervo.
   5. Tenere la parte più prossimale del nervo con la pinza curva per raddrizzare il nervo e tagliare il nervo il più in alto possibile usando le forbici. Quindi, tagliare il nervo vicino al plesso sacrale e la zampa con le forbici. Ripetere i passaggi 1.3.4-1.3.5 per il lato destro.
      NOTA: Durante l'apertura dell'arto, fare attenzione a non lividi nei vasi sanguigni.
   6. Usando una pinza, metti i nervi sciatici sinistro e destro in un piatto TC da 100 mm con DPBS ghiacciato.
4. Ristrutturazione del nervo sciatico
   1. Utilizzare una pinza per trasferire tutti i nervi in un piatto TC da 100 mm con terreno L-15 di Leibovitz ghiacciato e gentamicina da 50 μg/ml. Continuare a utilizzare uno stereomicroscopio e rimuovere grasso, muscoli e vasi sanguigni dai nervi con due paia di pinze sottili. Afferrare i nervi con una pinza e trasferirli su un piatto TC da 100 mm con il mezzo L-15 di Leibovitz ghiacciato.
   2. Identificare le estremità prossimali e distali del nervo sciatico. Rimuovere l'epineurium con un paio di pinze fini in direzione da prossimale a distale, tenendo l'estremità del nervo prossimale con il secondo paio di pinze sottili.
   3. Trasferire i nervi purificati in un piatto TC da 100 mm con terreno L-15 di Leibovitz ghiacciato e gentamicina da 50 μg/ml. Prendere in giro i fasci nervosi isolati per separare e isolare singole fibre nervose usando due paia di pinze sottili.
   4. Trasferire le fibre nervose in un tubo da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL e occupare il minor mezzo possibile. Aggiungere 50 ml di terreno L-15 di Leibovitz con 50 μg/mL di gentamicina alle fibre nervose e uccidere alcune volte nel tubo da 50 ml.
5. Digestione enzimatica del nervo sciatico
   NOTA: i passaggi successivi (passaggi 1.5-1.8, 2.1 e 2.2) vengono eseguiti in condizioni sterili.
   1. Preparare la soluzione di digestione enzimatica contenente 0,25% dispasi II, 0,05% collagenasi di tipo I e 50 μg/mL di gentamicina in 10 mL di DMEM (alto contenuto di glucosio).
   2. Centrifugare il tubo a 188 x g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica da 25 ml e trasferire il pellet con il terreno L-15 rimanente di Leibovitz in un piatto TC da 60 mm utilizzando una pipetta da 1.000 ml.
   3. Risciacquare il tubo da 50 mL con 10 mL della soluzione di digestione enzimatica e aggiungerlo al piatto contenente le fibre nervose. Distribuire con cura il fazzoletto nel piatto con la punta di una pipetta per massimizzare la superficie accessibile per la digestione.
   4. Incubare a 37 °C e 5% di CO 2 per 18 ore e interrompere la digestione aggiungendo 10 ml di FCS al 40% nella soluzione salina bilanciata di Hanks, senza Ca² e Mg²⁺ (HBSS).
6. Separazione cellulare
   1. Trasferire i nervi digeriti in una provetta da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica e centrifugare a 188 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di DMEM contenente il 10% di FCS e 50 μg/mL di gentamicina. Risospendere il pellet 20 volte successivamente, utilizzando una punta per pipetta da 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml e 200 μL.
   2. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 100 μm e centrifugare a 188 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con 4 ml di DMEM contenente il 10% di FCS e 50 μg/mL di gentamicina.
   3. Aggiungere 2 mL di sospensione cellulare a ciascuna delle due piastre TC da 60 mm rivestite di PLL e laminina e incubare a 37 °C e al 5% di CO₂. Lasciare intatte le piastre per 2 giorni nell'incubatore per proteggere le cellule dalle sollecitazioni meccaniche e per sostenere l'aderenza.
7. Differenziazione cellulare di Schwann
   1. Dopo 2 giorni, rimuovere il mezzo e sciacquare accuratamente le piastre 2 volte con DMEM (alto glucosio), 10% FCS e 50 μg / mL di gentamicina. Successivamente, aggiungere 2 ml di mezzo cellulare di Schwann. Sostituire il mezzo cellulare di Schwann ogni 2^° giorno e osservare l'aspetto e la confluenza cellulare utilizzando un microscopio.
      NOTA: Le cellule di Schwann e gli espianti di DRG devono essere preparati in modo tempestivo e coordinato per la cocoltura. Assicurarsi che un ratto con embrioni a E 13,5 sia disponibile per la preparazione di DRG quando le cellule di Schwann sono vicine a una confluenza dell'80%.
8. Tripsinizzazione cellulare e separazione magnetica
   NOTA: Per immagini esemplari di diversi stadi di coltura cellulare di Schwann, vedere la Figura supplementare 1.
   1. Quando le cellule raggiungono una confluenza di circa l'80% (6-12 giorni di coltura), lavare accuratamente le piastre 2 volte con 3 ml di DPBS e incubare con 2 ml di tripsina/EDTA allo 0,05% (preriscaldato a 37 °C) per 3 minuti. Quando le cellule si staccano dal fondo della piastra, inattivare la digestione con l'aggiunta di 2 ml di DMEM con FCS al 10% e 50 μg / mL di gentamicina.
      NOTA: attenersi a un tempo di tripsinizzazione di 3 minuti e procedere rapidamente in seguito.
   2. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di tampone magnetico di separazione cellulare contenente DPBS con albumina sierica bovina allo 0,5% (BSA) e 2 nM EDTA. Combinare 10 μL della sospensione cellulare con 10 μL di blu tripano e contare le cellule utilizzando una camera di colorazione.
   3. Centrifugare la sospensione cellulare a 188 x g per 10 minuti a 4 °C e risospendere il pellet cellulare in 90 μL di tampone di separazione magnetica per 1 x 10⁷ cellule. Aggiungere 10 μL di microsfere Thy-1 per 1 x 10⁷ cellule. Risospendere la soluzione alcune volte e incubare per 15 minuti al buio a 8 °C.
   4. Aggiungere 2 mL del tampone di separazione magnetica alla sospensione della cella e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di tampone di separazione magnetica cellulare.
   5. Inumidire la colonna di separazione delle celle magnetiche con 1 mL del tampone di separazione della cella magnetica. Posizionare la colonna di separazione delle celle magnetiche nel separatore di celle magnetiche. Applicare le celle alla colonna di separazione delle celle magnetiche. Raccogliere il flusso e centrifugare a 300 x g a 4 °C per 10 minuti.
      NOTA: I fibroblasti sono selezionati positivamente e rimangono nella colonna, mentre le cellule di Schwann passano la colonna. I fibroblasti possono essere raccolti con un timbro (ad esempio, come controllo negativo per i protocolli di colorazione delle cellule di Schwann).
   6. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL del terreno di coltura (cfr. punto 3.1.1). Contare le cellule dopo la colorazione con tripano blu e una camera di colorazione.

2. Coltura di espianti DRG

1. Preparazione del terreno di crescita DRG
   1. Preparare il terreno di crescita DRG aggiungendo il 2% di B27, il 2% di siero di cavallo, l'1% di L-glutammina, lo 0,5% di penicillina / streptomicina e il fattore di crescita del nervo (NGF) 10 ng / mL al mezzo neurobasale. Conservare il terreno di coltura a 4 °C.
      NOTA: Il terreno di coltura può essere utilizzato per 2 giorni.
2. Rivestimento per espianti DRG
   1. Incubare i coprivetrini in etanolo al 70% per 1 ora e metterli nei pozzetti di piatti a 4 pozzetti usando una pinza curva. Dopo che l'etanolo si è asciugato, applicare 300 μL di 0,2 mg/ml di poli-D-lisina (PDL) per pozzetto e incubare per una notte a 37 °C e 5% di CO₂.
   2. Lavare i vetrini 3 volte per 5 minuti ciascuno con DPBS consecutivamente. Togliere il DPBS, applicare 300 μL di 1 μg/mL di laminina sui vetrini di copertura e incubare per una notte a 37 °C e 5% di CO₂.
   3. Dopo tre fasi di lavaggio con DPBS per 5 minuti, sostituire il DPBS con 190 μL di terreno di coltura DRG. Posizionare le piastre a 4 pozzetti nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO_2.
3. Preparazione DRG
   NOTA: Raccogliere il DRG di ratti embrionali sotto un banco pulito.
   1. Prima della preparazione, pulire tutti gli strumenti con etanolo al 70%. Riempire 10 (due per embrione) piatti TC da 35 mm con 2 ml di HBSS ghiacciato per piatto e due piatti TC da 100 mm con 5 ml di HBSS ghiacciato per piatto.
   2. Eutanasia dei ratti gravidi (femmine adulte di ratti Sprague Dawley, E13.5) mediante inalazione e decapitazione di CO₂ .
   3. Spruzzare il corpo con etanolo al 70% e aprire il busto ventrale del ratto. Rimuovere con cura l'utero e inserirlo in un piatto TC da 100 mm con HBSS ghiacciato.
   4. Tenere l'utero con una pinza curva e aprire la parete dell'utero con una pinza fine. Rimuovere un sacco amniotico e aprirlo con attenzione pizzicando un foro con una pinza sottile.
   5. Rimuovere l'embrione dai tessuti circostanti, tagliare il cordone ombelicale e decapitare l'embrione usando una pinza sottile. Posizionare il busto in un piatto TC da 100 mm riempito con HBSS usando una pinza curva e una spatola.
   6. Rimuovere rapidamente tutti gli embrioni dall'utero e trasferirli in un piatto TC da 100 mm riempito con HBSS. Se ci sono più di cinque embrioni, preparare un ulteriore piatto TC da 35 mm con 2 ml di HBSS, secondo il punto 2.3.1.
   7. Posizionare delicatamente un tronco embrionale in un piatto TC da 35 mm riempito con HBSS usando una spatola e una pinza curva. Sotto uno stereomicroscopio, aprire la parte dorsale del busto per dividere l'embrione in due metà usando una pinza sottile e micro forbici. Girare una metà di lato e identificare il filamento di DRG situato in una linea nella parte dorsale dell'embrione.
   8. Ritagliare il DRG nel suo insieme usando una pinza fine e micro forbici. Posizionare il DRG in un piatto TC fresco da 35 mm riempito con 2 ml di HBSS e separare un singolo DRG dal tessuto rimanente usando una pinza fine e microforbici.
4. Coltura cellulare DRG
   1. Prelevare piastre a 4 pozzetti contenenti 190 μL di terreno di coltura DRG dall'incubatore al banco pulito dove devono essere preparati i DRG. Trasferire con cura un singolo DRG in un pozzetto di una piastra di coltura a 4 pozzetti usando una pinza fine e una spatola. Posizionare il DRG al centro di ciascun pozzetto, poiché una posizione centrale è importante per il fissaggio del DRG.
   2. Lavorare in condizioni sterili d'ora in poi. Porre le colture espiantate nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO₂. Il giorno successivo, aggiungere attentamente 50 μL del terreno di coltura DRG a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta da 100 ml.
   3. Osservare l'aderenza all'espianto DRG e la crescita degli assoni usando un microscopio ogni giorno e scartare gli espianti DRG che si sono staccati dal coprislip o non sono riusciti a superare gli assoni il giorno 3 della coltura.
      NOTA: Gli espianti DRG sono molto fragili nei primi giorni di coltura e devono essere maneggiati con cura, specialmente quando si spostano le piastre dentro e fuori dall'incubatore quando il terreno viene cambiato, o anche quando si chiude la porta dell'incubatore. Il volume preciso di 190 μL di terreno per pozzetto è fondamentale per mantenere gli espianti DRG in posizione durante il primo giorno di coltura. Gli espianti di DRG sciolti possono essere identificati facilmente durante il controllo quotidiano, poiché nuotano nel mezzo invece di aderire al coprifoglio.

3. Cocultura

1. Trasferimento di cellule di Schwann alla coltura di espianti DRG
   1. Preparare il terreno di cocoltura aggiungendo lo 0,1% di acido ascorbico al terreno di coltura DRG.
   2. Il giorno 3 della coltura di espianto DRG, sostituire con cura il terreno di coltura DRG con 250 μL del terreno di coltura contenente 30.000 cellule di Schwann (dal punto 1.8) per pozzetto.
   3. Mantenere la cocoltura degli espianti DRG e delle cellule di Schwann per un massimo di 22 giorni. Sostituire attentamente 250 μL del terreno di coltura a giorni alterni e osservare l'aspetto delle cellule usando un microscopio.
      NOTA: Per un esempio di assoni DRG e cellule di Schwann nella cocoltura nei primi giorni di coltura, vedere la Figura 1.
2. Colorazione immunocitochimica
   NOTA: Maneggiare i campioni di cocoltura con estrema attenzione durante la procedura di colorazione, poiché possono essere danneggiati facilmente.
   1. Per fissare le cellule sui vetrini, rimuovere lentamente il substrato, lavare accuratamente 3 volte con DPBS e incubare in paraformaldeide (PFA) al 4% per 10 minuti. Sostituire il PFA con DPBS e conservare le celle fisse a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
      ATTENZIONE: Quando si maneggia il 4% di PFA, indossare i dispositivi di protezione individuale raccomandati.
   2. Lavare i vetrini 3 volte con DPBS per 5 minuti, quindi bloccare con soluzione bloccante (siero di capra al 10%, albumina sierica bovina al 10% [BSA], gelatina allo 0,1% e Triton X-100 allo 0,05%) in DPBS per 1 ora. Diluire gli anticorpi primari βIII-tubulina (1:7.500) e la proteina basica della mielina (MBP) (1:750) nella soluzione bloccante e incubare per una notte a 4 °C.
   3. Lavare le celle 3 volte con DPBS per 5 minuti. Utilizzare anticorpi secondari coniugati con coloranti fluorescenti in una diluizione di 1:1.000 in soluzione bloccante e incubare per 2 ore a temperatura ambiente (RT).
   4. Lavare le cellule 3 volte con DPBS per 5 minuti e montare le cellule su vetrini microscopici con mezzo di montaggio a fluorescenza, incluso 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Conservare i vetrini al buio a 4 °C fino a documentazione microscopica.
      ATTENZIONE: Quando si maneggia il mezzo di montaggio a fluorescenza, indossare i dispositivi di protezione individuale raccomandati.
3. Analisi
   1. Scatta foto di otto regioni definite che circondano l'espianto DRG al centro usando un microscopio invertito.
   2. Utilizzare un'applicazione software di analisi delle immagini per quantificare le aree degli assoni positivi alla tubulina βIII e della mielinizzazione colorata da MBP.
   3. Calcolare la percentuale di mielinizzazione come rapporto tra assoni mielinizzati e assoni non mielinici.

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Risultati

La mielinizzazione nella cocultura è stata valutata nei giorni 10, 12, 14, 16, 18 e 20. Gli espianti DRG e le cellule di Schwann sono stati colorati per MBP, βIII-tubulina e DAPI. La rete assonale nella cocultura era densa e non cambiava visibilmente nel corso dell'osservazione. I primi segni di mielina, sotto forma di piccoli frammenti, erano rilevabili il giorno 10 e aumentavano il giorno 12 (Figura 2). Le aree MBP-positive sono aumentate nel tempo fino al giorno 20 della cultura. La mie...

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Discussione

Qui, presentiamo un protocollo rapido e facile per la generazione di mielinizzazione in vitro fondendo due colture di tipo cellulare separate, cellule di Schwann e espianti di ganglio della radice dorsale.

Un passaggio critico del protocollo è la coltivazione di espianti DRG, soprattutto nei primi giorni di coltura. I DRG sono molto fragili prima che venga costruita una forte rete assonale e devono essere maneggiati con molta attenzione, ad esempio, quando vengono estratti dall'incub...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-MBP, rabbit	Novus Biologicals, Centannial, USA	ABIN446360
Anti-ßIII-tubulin, mouse	Biolegend, San Diego, USA	657402
Ascorbic acid	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	A4403-100MG
B27-supplement	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	17504-044
Biosphere Filter Tip, 100 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70760212
Biosphere Filter Tip, 1250 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701186210
Biosphere Filter Tip, 20 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	701114210
Biosphere Filter Tip, 300 µL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	70765210
Bovine serum albumin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8076.4
Cell strainer, 100 µM	BD Bioscience, Heidelberg, Germany	352360
Centrifuge 5810-R	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	5811000015
CO2 Incubator Heracell	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Coverslips 12 mm	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	P231.1
Curved fine forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-42
DAPI fluoromount-G(R)	Biozol, Eching, Germany	SBA-0100-20
Dispase II	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	4942078001
Distilled water (Water Purification System)	Millipore, Molsheim, France	ZLXS5010Y
DMEM/F-12, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	31331093
DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D8537-6X500ML
Ethanol	VWR, Radnor, USA	1009862500
FCS	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F7524	FCS must be tested for Schwann cell culture
Fine forceps (Dumont #5)	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11252-20
Forceps	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	11370-40
Forskolin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	F6886-10MG
Gelatin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	G1393-20ML
Gentamycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	5710064
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11036
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	A11001
HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	14170138
HERAcell Incubator	Heraeus Instruments, Hanau, Germany	51017865
Heraguard ECO 1.2	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51029882
Horse serum	Pan-Biotech, Aidenbach, Germany	P30-0712
Image J Software	HIH, Bethesda, USA
Laminin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	L2020-1MG
Leibovitz´s L-15 Medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	11415064
L-Glutamine 200 mM	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25030024
MACS Multistand	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130042303
Microscissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	15000-08
Microscope	Motic, Wetzlar, Germany	Motic BA 400
Microscope Axio observer 7	Zeiss, Oberkochen, Germany	491917-0001-000
Microscope slide	VWR, Radnor, USA	630-1985
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130091632
MS columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-201
Neubauer counting chamber	Assistant, Erlangen, Germany	40441
Neuregulin	Peprotech, Rocky Hill, USA	100-03
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	21103049
NGF	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	N1408
Normal goat serum	Biozol, Eching, Germany	S-1000
Nunclon Δ multidishes, 4 well	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	D6789
Paraformaldehyde	Acros Organics, New Jersey, USA	10342243
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15140-122
Pipetboy	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	4430000018
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany	2231300004
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P6407-5MG
Poly-L-Lysin	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	P4707-50ML
Reaction tubes, 15 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62554502
Reaction tubes, 50 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	62547254
Reaction vessels, 1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72690001
Safety Cabinet S2020 1.8	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	51026640
Scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14083-08
Serological pipette, 10 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861254025
Serological pipette, 25 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861685001
Serological pipette, 5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	861253001
Spatula	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	10094-13
Stereomicroscope Discovery.V8	Zeiss, Oberkochen, Germany	495015-0012-000
Surgical scissors	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany	14007-14
TC dish 100, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833902300
TC dish 35, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833900300
TC dish 60, cell +	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	833901300
Thy-1 Microbeads (MACS Kit)	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-094-523
Triton X-100	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	X100-500ML
Trypan Blue Solution 0.4%	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15250061
Trypsin (2.5%), no phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	15090-046
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	25300-054
Type I Collagenase	Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany	C1639
Water bath type 1008	GFL, Burgwedel, Germany	4285