Ex Vivo Cultivo de perfusión de grandes vasos sanguíneos en un biorreactor impreso en 3D

Resumen

Este protocolo presenta la configuración y el funcionamiento de un biorreactor impreso en 3D recientemente desarrollado para el cultivo ex vivo de vasos sanguíneos en perfusión. El sistema está diseñado para ser fácilmente adoptado por otros usuarios, práctico, asequible y adaptable a diferentes aplicaciones experimentales, como biología básica y estudios farmacológicos.

Resumen

Las enfermedades vasculares constituyen la base de la mayoría de las enfermedades cardiovasculares (ECV), que siguen siendo la principal causa de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. Se necesitan urgentemente intervenciones quirúrgicas y farmacológicas eficaces para prevenir y tratar la enfermedad vascular. En parte, la escasez de modelos traslacionales limita la comprensión de los procesos celulares y moleculares implicados en la enfermedad vascular. Los biorreactores de cultivo de perfusión ex vivo proporcionan una plataforma ideal para el estudio de grandes vasos animales (incluidos los seres humanos) en un entorno dinámico controlado, combinando la facilidad del cultivo in vitro y la complejidad del tejido vivo. Sin embargo, la mayoría de los biorreactores se fabrican a medida y, por lo tanto, son difíciles de adoptar, lo que limita la reproducibilidad de los resultados. Este artículo presenta un sistema impreso en 3D que se puede producir y aplicar fácilmente en cualquier laboratorio biológico, y proporciona un protocolo detallado para su configuración, lo que permite la operación de los usuarios. Este innovador y reproducible sistema de cultivo de perfusión ex vivo permite el cultivo de vasos sanguíneos durante un máximo de 7 días en condiciones fisiológicas. Esperamos que la adopción de un biorreactor de perfusión estandarizado apoye una mejor comprensión de los procesos fisiológicos y patológicos en los vasos sanguíneos de animales grandes y acelere el descubrimiento de nuevas terapias.

Introducción

La pared vascular existe en un estado estacionario reactivo, lo que asegura tanto la responsabilidad a los estímulos externos (i.e., cambio de presión, vasoconstrictores) como una superficie consistente no activadora que impide la coagulación de la sangre y la infiltración de células inflamatorias¹. En respuesta a estímulos dependientes del envejecimiento y del estilo de vida y ante el daño directo, la pared vascular activa procesos de remodelación como la reestenosis y la aterosclerosis, que se sabe que contribuyen a las enfermedades cardiovasculares (ECV) comunes, como el accidente cerebrovascular isquémico y el infarto de miocardio². Si bien existen enfoques intervencionistas como la revascularización percutánea y la colocación de stents para abordar las manifestaciones avanzadas de la enfermedad vascular, se sabe que provocan un daño vascular adicional, lo que a menudo conduce a la recurrencia. Además, solo se dispone de soluciones preventivas y de fase inicial limitadas. La comprensión de los mecanismos que mantienen la homeostasis de la pared vascular y conducen a su disfunción es fundamental para el desarrollo de nuevas curas³.

A pesar del constante desarrollo y los avances en biología molecular e ingeniería de tejidos, los estudios con animales siguen siendo un componente crucial de los estudios de biología vascular. Los estudios in vivo en animales han proporcionado una enorme comprensión de los mecanismos de la homeostasis vascular y la patología; Sin embargo, estos procedimientos son costosos, tienen un rendimiento relativamente bajo y plantean problemas éticos sustanciales. Además, los animales pequeños son poco representativos de la fisiología vascular humana, y los experimentos con animales más grandes son mucho más caros y crean más consideraciones éticas ^4,5. Con la creciente demanda de soluciones farmacéuticas y médicas para una población que envejece rápidamente, las desventajas del uso de animales se magnifican, lo que afecta la reproducibilidad, confiabilidad y transferibilidad de los resultados a la atención del paciente⁶.

Los sistemas in vitro ofrecen una plataforma simplificada para estudiar los mecanismos básicos, pero no recapitulan la complejidad de todo el tejido, las interacciones entre las células y la matriz extracelular, y las fuerzas mecánicas, que son determinantes críticos en el desarrollo de enfermedades vasculares⁷.

Los estudios ex vivo realizados en tejidos enteros mantenidos en entornos controlados artificialmente imitan la complejidad in vivo al tiempo que permiten investigaciones de rendimiento relativamente alto⁸. Dada la capacidad de controlar de cerca las condiciones de cultivo y el entorno, los modelos ex vivo permiten una amplia gama de estudios complejos y proporcionan una alternativa adecuada para reducir el uso de procedimientos animales en biología vascular. Los cultivos estáticos de anillos vasculares ofrecieron información interesante, pero no incorporaron el elemento hemodinámico crucial⁹. De hecho, el estudio del sistema vascular ex vivo plantea desafíos específicos relacionados con las muchas fuerzas dinámicas que se aplican a las células dentro de la pared de los vasos sanguíneos. Estímulos como el flujo luminal, la turbulencia, el esfuerzo cortante, la presión y la deformación de la pared impactan significativamente en la fisiopatología tisular^10,11,12.

Los biorreactores de perfusión son esenciales para el estudio de la homeostasis y la remodelación vascular en respuesta a lesiones o cambios hemodinámicos¹³. Además, el cultivo de perfusión se puede utilizar para mejorar la maduración y durabilidad de los vasos sanguíneos de ingeniería tisular (TEBV), proporcionando alternativas adecuadas para los injertos vasculares¹⁴.

Los biorreactores de perfusión disponibles en el mercado tienen una flexibilidad y adaptabilidad limitadas y son costosos. En cambio, muchos de los biorreactores desarrollados internamente existentes son difíciles de replicar en otros laboratorios, debido a las descripciones limitadas y la falta de disponibilidad de componentes especialmente fabricados 7,8,9,10,11,12. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado recientemente un nuevo biorreactor (EasyFlow), que es económico de producir, se adapta a una amplia gama de tejidos y permite modificaciones relativamente sencillas para adaptarse a diferentes demandas de investigación¹³. El inserto está impreso en 3D y encaja como en la tapa de un tubo de centrífuga estándar de 50 ml. Su diseño modular y su fabricación en impresión 3D lo hacen accesible y reproducible en diferentes laboratorios, así como fácilmente modificable para adaptarse a diferentes necesidades científicas. Este protocolo describe el montaje y el funcionamiento básico del sistema de biorreactor en un entorno de perfusión arterial.

Protocolo

Este protocolo describe el montaje y uso de un sistema compuesto por dos insertos EasyFlow (biorreactor): uno que representa la cámara de reacción (C), que contiene la muestra de arteria perfundida, y otro que funciona como un depósito de medio (R) (Figura 1 y Figura 2A). Las arterias carótidas se obtuvieron de lechones machos y hembras de 4-6 semanas de edad (6-12 kg) en el Instituto Pirbright, Reino Unido. Los procedimientos con animales se llevaron a cabo en virtud de la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Ministerio del Interior (1986) (ASPA) y fueron aprobados por la Junta de Revisión de Ética y Bienestar Animal (AWERB) del Instituto Pirbright. Los animales fueron alojados de acuerdo con el Código de Prácticas para el Alojamiento y Cuidado de Animales de Raza. Todos los procedimientos fueron realizados por titulares de licencias personales que estaban capacitados y eran competentes bajo la licencia de proyecto PPL70/8852. Los lechones fueron sacrificados de acuerdo con el método de la lista uno bajo el ASPA.

1. Fabricación de insertos

1. Fabrica el inserto mediante impresión 3D, utilizando el modelo 3D proporcionado (Archivo complementario 1).
   NOTA: El modelado 3D permite realizar cambios sencillos en el diseño para adaptarse a nuevas aplicaciones. También se pueden utilizar materiales alternativos y técnicas de fabricación alternativas para producir el inserto. Debido a la compleja estructura interna, la sinterización selectiva por láser y la estereolitografía son alternativas apropiadas¹⁵. La poliamida 12 (PA12; ver Tabla de Materiales) es un buen candidato a material debido a su rendimiento superior en términos de retención de líquidos y resistencia a ciclos repetidos de esterilización por calor¹⁶.
2. Fabrica las juntas de silicona y las arandelas de policarbonato mediante corte láser¹⁷, utilizando los diseños proporcionados en el Archivo Suplementario 2.
   NOTA: El corte por láser se subcontrata fácilmente y es un método de fabricación barato. Las arandelas se pueden fabricar en acero inoxidable, lo que proporciona un componente más resistente para un uso repetido. Todos los demás componentes son artículos disponibles en el mercado. En la Tabla 1 se proporciona una lista completa de los materiales necesarios. Los detalles comerciales de los artículos se incluyen en la Tabla de Materiales.

2. Esterilización, ensamblaje y cebado del dispositivo

1. Esterilice todos los componentes siguiendo las instrucciones de la Tabla 1.
2. En condiciones de flujo laminar, ensamble dos insertos fabricados (paso 1), como se muestra en la Figura 1A.
3. Ensamble el sistema de perfusión como se muestra en la Figura 2, siguiendo los pasos a continuación:
   1. Conecte dos válvulas de tres vías conectadas al puerto R1 del depósito (puerto de intercambio de medios).
   2. Conecte la salida resultante al cabezal de la bomba peristáltica mediante un tubo equipado con una válvula unidireccional (tubo de válvula unidireccional).
   3. Conecte el cabezal de la bomba al puerto C4 de la cámara de reacción utilizando un tubo del sistema equipado con una válvula unidireccional.
      NOTA: Esta rama puede equiparse opcionalmente con un sensor de presión que permite un monitoreo constante.
   4. Conecte el puerto C1 de la cámara de reacción al tubo de pared blanda, y éste al canal de resistencia (diámetro interior pequeño).
      NOTA: La longitud de la tubería de resistencia influirá en gran medida en la presión presente en el sistema. Esto debe investigarse más a fondo para garantizar unas condiciones de perfusión adecuadas.
   5. Extienda el canal de resistencia con la tubería del sistema, creando un canal de retorno y cerrando el bucle de circulación luminal conectándolo al depósito en R5 (Figura 2C).
   6. Cree un canal de desbordamiento conectando la cámara de reacción C3 al depósito R3 con la tubería del sistema.
   7. Coloque un filtro de ventilación a través de R2.
   8. Cree un amortiguador de presión conectando una jeringa que contenga aire y medios a la cámara de reacción C6.
      NOTA: La relación aire-medio correcta dependerá de la amortiguación de presión requerida.
4. Prepare el sistema con medio de perfusión (medio de águila modificado de Dulbecco [DMEM] + 10% [v/v] de suero fetal bovino [FBS] + 1% [v/v] de penicilina-estreptomicina + 1% [v/v] de anfotericina B + 30% [v/v] de dextrano; ver Tabla de Materiales) a través de los puertos de intercambio de medios y el depósito.
   NOTA: El cebado del sistema reduce el riesgo de burbujas atrapadas en el sistema e identifica cualquier fuga potencial. El volumen recomendado de medios es de aproximadamente 100-120 ml. El volumen utilizado dependerá del volumen muerto de la tubería utilizada para la experimentación.

3. Recolección y preparación de muestras

1. Recolectar las arterias carótidas comunes izquierda y derecha, minimizando el manejo directo del tejido arterial¹³.
2. Colocar el tejido en un medio de transporte frío (DMEM+ 20% [v/v] FBS + 2% [v/v] penicilina-estreptomicina + 1% [v/v] anfotericina B, ver Tabla de Materiales) para su transferencia.
3. En una cabina de flujo laminar, retire el exceso de tejido conectivo y recorte los extremos del tejido con una hoja de bisturí. Lave el pañuelo dos veces en medios de transporte fríos.
4. Coloque el pañuelo en un agitador orbital en medios de transporte durante al menos 30 minutos para un lavado completo.
5. Conecte un segmento no ramificado de la arteria al sistema de biorreactor utilizando dos conectores Luer de púas y fíjelo en su lugar mediante una unión vascular (ligaduras vasculares de silicona; Tabla 1).
   NOTA: La unión del vaso proporciona la tensión y la retracción adecuadas para asegurar el recipiente. La sección ovalada evita el daño tisular.
6. Haga fluir suavemente el medio a través de la arteria para verificar la permeabilidad.
7. Después de asegurar la arteria al inserto fabricado, llene el espacio de reacción con medios de perfusión (paso 2.4). Finalmente, llene suavemente el circuito de circulación luminal con medios para eliminar cualquier resto de aire del sistema.
8. Conectar el espacio de reacción con el sistema de perfusión previamente montado (sección 2), completando la circulación.
   NOTA: Se recomienda realizar un control de calidad mediante inmunohistoquímica del tejido procesado. Esto identifica cualquier daño debido a una manipulación excesiva durante la preparación.

4. Cultura de perfusión y cambio de medios

1. Coloque el sistema de perfusión en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂ y luego conéctelo a una bomba peristáltica (ver Tabla de materiales)
2. Conecte cualquier sistema de adquisición adicional (facultativo), como sensores de presión (consulte la tabla de materiales).
3. Deje que el sistema se equilibre durante la noche con un bajo caudal de medios de ~10-15 ml/min.
   NOTA: Se requieren experimentos iniciales para determinar la configuración de la bomba, el flujo del medio, la presión del sistema y la configuración óptima de los amortiguadores/abrazaderas de presión para garantizar que se cumplan las condiciones adecuadas.
4. Al día siguiente, aumente el caudal de forma incremental (+1 rpm cada hora, equivalente a un aumento de ~2,5 ml/min cada hora, en el sistema actual) hasta alcanzar el caudal final (35 ml/min). Monitoree el sistema periódicamente en busca de fugas.
   NOTA: Para calcular el caudal exacto en función de la velocidad de la bomba peristáltica, los usuarios deben realizar primero una calibración adecuada de la bomba¹⁸. Utilizando la fórmula (1), el caudal volumétrico (Q) se puede calcular en función del volumen dispensado (V) en un tiempo determinado (t). Para calcular la velocidad de flujo estimada () podemos utilizar el caudal (Q) previamente calculado y el área de la sección transversal del recipiente (A), descritos en la ecuación (2).
   (1)
   (2)
5. Cada 3 días, cambie el 50% del medio (~50 ml) conectando una jeringa llena de medios nuevos al puerto de intercambio de medios más cercano a la bomba y una jeringa vacía al puerto más cercano al depósito para recoger el medio gastado (Figura 2).
   NOTA: El uso de dos válvulas de tres vías como puertos de intercambio de medios facilita el funcionamiento continuo de la perfusión durante el intercambio de medios.
6. Al final del experimento, recoja el tejido de la cámara de reacción recortando los extremos conectados al biorreactor con tijeras quirúrgicas estériles.
7. Desmonte, limpie y esterilice el sistema para su uso posterior.

5. Análisis de la muestra

1. Fijar la muestra recolectada en paraformaldehído (PFA) al 4% durante la noche a 4 °C.
2. Incrustar el tejido a la temperatura óptima de corte (OCT; ver Tabla de Materiales)¹⁹ y congelar por inmersión en isopentano enfriado en nitrógeno líquido.
3. Obtener secciones criogénicas de 3-5 mm de espesor utilizando un criostato.
4. Realizar inmunohistoquímica (hematoxilina y eosina [H&E]) y/o inmunofluorescencia. Siga el protocolo típico de inmunofluorescencia:
   1. Bloquee las rodajas durante 1 h a temperatura ambiente con suero de cabra al 20% [v/v] en solución salina tamponada con fosfato (PBS; consulte la Tabla de materiales).
   2. Incubar las rodajas durante la noche a 4 °C con anticuerpo primario de conejo contra CD31 diluido 1:50 en PBS (ver Tabla de Materiales).
   3. Lavar tres veces con PBS durante 5 min.
   4. Incubar durante 1 h a 37 °C con anticuerpo secundario anti-conejo de cabra marcado con fluorescencia diluido 1:200 en PBS y anticuerpo fluorescente conjugado directamente conjugado con α músculo liso (AME) diluido 1:200 en PBS (ver Tabla de materiales).
   5. Lavar tres veces con PBS durante 5 min.
   6. Tiñir los núcleos con DAPI diluido 1:1.000 en PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
   7. Incubar con negro de Sudán al 0,1 % (p/v) (ver Tabla de materiales) en etanol al 70 % (v/v) durante 10 min a temperatura ambiente para reducir la autofluorescencia tisular.
   8. Lavar el pañuelo con abundante agua desionizada. Monte las guías en el medio de montaje.
   9. Tome imágenes de las muestras con un microscopio de barrido láser confocal.

Discusión

Los sistemas de perfusión vascular ex vivo constituyen una plataforma única para estudiar la función y el comportamiento de las células vasculares dentro de sus tejidos nativos en condiciones controladas, lo que permite la disección de procesos complejos como la remodelación vascular post-lesión²². Sin embargo, la mayoría de los biorreactores de los que se tiene noticia son sistemas de fabricación propia basados en componentes hechos a medida y, a menudo, son difíciles de replicar por otros²³. Existen soluciones comerciales alternativas, pero carecen de flexibilidad en el diseño y pueden ser relativamente costosas²⁴.

Hemos desarrollado un sistema alternativo que proporciona una plataforma fácil, barata y reproducible que se puede fabricar utilizando técnicas de impresión 3D de código abierto¹³. En el presente artículo se describe la configuración del sistema para permitir aplicaciones reproducibles por parte de los usuarios finales. Esta configuración permite la aplicación de condiciones fisiológicas y patológicas de presión (40-180 mmHg), caudal (6-30 mL/min) y en combinación con medios que imitan la viscosidad de la sangre, con diversos grados de tensión de cizallamiento.

La reproducibilidad es un aspecto esencial del proceso científico, ya que permite a los investigadores validar los hallazgos de otros y basarse en ellos para avanzar en nuestra comprensión de las enfermedades vasculares. Además, las herramientas que permiten y promueven la colaboración entre grupos son esenciales para avanzar en el conocimiento científico. EasyFlow representa un ejemplo de este tipo de soluciones accesibles y de código abierto que pueden ser fácilmente producidas y adoptadas por laboratorios que trabajan en una amplia gama de proyectos dentro del campo de las ciencias vasculares y más allá.

Informamos que este cultivo de dispositivos mantiene la viabilidad del tejido arterial durante al menos 7 días y se puede utilizar para modelar pasos específicos de la enfermedad vascular. Con esto, se podrían modelar los caudales fisiológicos y las condiciones de presión¹³. Es importante destacar que este cultivo de perfusión es rentable debido a los bajos costos de producción y al bajo volumen de medio necesario para operar el sistema.

El diseño 3D también se puede adaptar a nuevas aplicaciones y se pueden probar nuevos materiales para la impresión. Incluso en su formato actual, el espacio de alojamiento de muestras se puede adaptar fácilmente a muestras de diferentes tamaños cambiando la longitud de los accesorios o el orificio de los conectores luer. Es importante tener en cuenta que, dada la naturaleza modular del dispositivo y sus pequeñas dimensiones, este biorreactor se puede utilizar en varias configuraciones (Figura 5) y se puede aplicar a cultivos multiplex, donde varias muestras pueden exponerse a diferentes condiciones al mismo tiempo en biorreactores separados.

Se prevé que el uso del sistema se amplíe en el futuro para apoyar el cultivo de vasos sanguíneos de diferentes orígenes (por ejemplo, diferentes especies) y de diferentes naturalezas (por ejemplo, venas, linfáticos), y tal vez se aplique al cultivo de otros tejidos huecos (por ejemplo, tráquea, intestino). En particular, la investigación muestra que el cultivo de andamios de ingeniería tisular en perfusión constante ayuda a la distribución homogénea de las células dentro de la construcción y maduración del tejido resultante^25,26. Además, la siembra de injertos vasculares en perfusión contribuye a lograr una luz vascular celularizada más uniforme, en comparación con los métodos estáticos²⁷. Por esta razón, prevemos que el sistema se aplique a la ingeniería de tejidos para ayudar a abordar los desafíos actuales, lo que permitirá el desarrollo futuro de sustitutos sintéticos reproducibles de los vasos sanguíneos²⁸.

El protocolo descrito aquí presenta algunos pasos importantes críticos para el éxito de la cultura de flujo. El establecimiento y monitoreo de las condiciones de flujo adecuadas no es trivial y debe realizarse en cada sistema cuando se configura por primera vez, para garantizar que las condiciones de cultivo sean fisiológicas. El caudal y la presión se monitorizaron mediante sensores de presión e imágenes de ultrasonido. Otro punto crítico es asegurarse de que el tejido sea viable e intacto al comienzo del cultivo. Esto requiere una fuente fresca, un manejo cuidadoso y puede verificarse mediante análisis histológicos. Además, la solución de problemas debe realizarse al comienzo de cada experimento para identificar cualquier posible contaminación bacteriana o fuente de fuga de medios.

Es importante destacar que el sistema de perfusión descrito, si bien proporciona condiciones fisiológicas de presión y flujo, no puede imitar completamente los complejos patrones de ondas de presión registrados in vivo. Esta limitación es atribuible al uso de una bomba peristáltica y puede ser resuelta utilizando equipos más especializados para reproducir condiciones hemodinámicas avanzadas. El cultivo de vasos sanguíneos en un biorreactor tampoco es capaz de abordar estudios en los que el sistema inmunitario o la interacción con otros órganos es crítico.

En conclusión, se presenta un sistema de perfusión simple impreso en 3D que puede imitar el entorno hemodinámico fisiológico, que se espera que contribuya a la estandarización de cultivos de vasos sanguíneos ex vivo . Su potencial de personalización y aplicación al cultivo a largo plazo lo convierte en una herramienta esencial para avanzar en la comprensión de estos complejos sistemas biológicos en fisiología y condiciones patológicas.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasyFlow	-	-	3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs
PA12 - 3D printing	Protolabs	-	-
Peristaltic pump	Heidolph	PD5201
Culture media components:
Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water	Sigma-Aldrich	A2942-20ML
Dextran  from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D8802-25ML
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D6429-6X500ML
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F9665
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Immunostaining materials:
Cryostat	LEICA	CM3050 S
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-10MG
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-10ML
Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11008
Invitrogen eBioscience Fluoromount G	Thermo Fisher Scientific	50-187-88
MX35 Premier + Microtome Blade	Thermo Scientific	3052835
Optimal Cooling Tempearure Compound - OCT	Agar Scientific	AGR1180
Rabbit α-CD31 antibody	Abcam	ab28364
Sudan Black B	Santa Cruz Biotechnology	SC-203760
X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box	Fisher Scientific	J1800AMNZ
α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody	R&D Systems	IC1420R
Material for laser cutting of components:
Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of  washers)	RS Components	258-6590
RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of  silicone seals)	RS Components	840-5541
Optional pressure monitors:
Pressure sensor	Parker Hannifin	080-699PSX-3P-5
SciPres Pressure Monitor	Parker Hannifin	206-200-M
Pre-sterilized single use plasticware:
0.2 um filter	Sarstedt	70.1114.210
20 mL Sterile syringe	IMS Euro	40004
50 mL Centrifuge Tube	Thermo Fisher Scientific	Sarstedt - 62.547.254
Small components:
Cable ties	-	-
Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb	Cole-Parmer	WZ-30800-10	Barb Adaptor
Masterflex Polycarbonate Luer Fittings	Cole-Parmer	AU-45504-84
Nylon Miniature Check Valve	Cole-Parmer	98553-00
RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of  silicone seals)	RS Components	840-5541
Stainless Steel M2 Hex Nuts	RS Components	527-218
Stainless Steel M2 x 6 mm Screws	RS Components	418-7426
Stainless Steel M5 Hex Nuts	RS Components	189-585
Surgical vessel loop	Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies	10-1003
Three-way valves	IMS Euro	91000
Surgical Equipment
Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07	International Medical Supplies	SKU: BD-07
Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm	International Medical Supplies	SKU: BD-361
Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm	International Medical Supplies	SKU: FD-12
Troge Surgical Scalpels - Size 23 - Box of 100	International Medical Supplies	63114
Tubing:
Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm)	Eppendorf	M0740-2396	System tubing
Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing	ISMATEC	95714-48	Soft wall tubing (for clamp)
RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone	RS Components	667-8432	Resistance tubing (small inner diameter)
Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm)	Heidolph	525-30027-00-0	One way valve tube
Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene	RS Components	125-4042	Pump Tubing