Ex Vivo Perfusionskultur großer Blutgefäße in einem 3D-gedruckten Bioreaktor

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt den Aufbau und Betrieb eines neu entwickelten, 3D-gedruckten Bioreaktors für die ex vivo Kultur von Blutgefäßen in Perfusion vor. Das System ist so konzipiert, dass es leicht von anderen Benutzern übernommen werden kann, praktisch, erschwinglich und an verschiedene experimentelle Anwendungen wie grundlegende biologische und pharmakologische Studien anpassbar ist.

Zusammenfassung

Gefäßerkrankungen bilden die Grundlage für die meisten Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs), die nach wie vor weltweit die Hauptursache für Mortalität und Morbidität sind. Wirksame chirurgische und pharmakologische Eingriffe zur Vorbeugung und Behandlung von Gefäßerkrankungen sind dringend erforderlich. Zum Teil schränkt der Mangel an translationalen Modellen das Verständnis der zellulären und molekularen Prozesse ein, die an Gefäßerkrankungen beteiligt sind. Ex-vivo-Perfusionskultur-Bioreaktoren bieten eine ideale Plattform für die Untersuchung großer Tiergefäße (einschließlich Menschen) in einer kontrollierten dynamischen Umgebung, die die Leichtigkeit der In-vitro-Kultur und die Komplexität des lebenden Gewebes kombiniert. Die meisten Bioreaktoren sind jedoch kundenspezifisch gefertigt und daher schwer zu übernehmen, was die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse einschränkt. In diesem Artikel wird ein 3D-gedrucktes System vorgestellt, das leicht hergestellt und in jedem biologischen Labor angewendet werden kann, und es wird ein detailliertes Protokoll für seine Einrichtung bereitgestellt, das den Benutzern den Betrieb ermöglicht. Dieses innovative und reproduzierbareEx-vivo-Perfusionskultursystem ermöglicht die Kultivierung von Blutgefäßen für bis zu 7 Tage unter physiologischen Bedingungen. Wir gehen davon aus, dass die Einführung eines standardisierten Perfusionsbioreaktors zu einem besseren Verständnis der physiologischen und pathologischen Prozesse in den Blutgefäßen großer Tiere beitragen und die Entdeckung neuer Therapeutika beschleunigen wird.

Einleitung

Die Gefäßwand befindet sich in einem reaktiven stationären Zustand, der sowohl die Empfindlichkeit gegenüber äußeren Reizen (d. h. Druckänderungen, Vasokonstriktoren) als auch eine konsistente, nicht aktivierende Oberfläche gewährleistet, die die Blutgerinnung und die Infiltration von Entzündungszellen verhindert¹. Als Reaktion auf alters- und lebensstilabhängige Reize und bei direkter Schädigung aktiviert die Gefäßwand Umbauprozesse wie Restenose und Atherosklerose, die bekanntermaßen zu häufigen kardiovaskulären Erkrankungen wie ischämischem Schlaganfall und Myokardinfarkt beitragen². Während interventionelle Ansätze wie perkutane Revaskularisation und Stentimplantation zur Behandlung fortgeschrittener Manifestationen von Gefäßerkrankungen zur Verfügung stehen, ist bekannt, dass diese weitere Gefäßschäden hervorrufen, die oft zu einem Rezidiv führen. Darüber hinaus gibt es nur begrenzte präventive und frühzeitige Lösungen. Das Verständnis der Mechanismen, die die Homöostase der Gefäßwand aufrechterhalten und ihre Dysfunktion vorantreiben, steht im Mittelpunkt der Entwicklung neuer Heilmittel³.

Trotz der ständigen Entwicklung und der Fortschritte in der Molekularbiologie und dem Tissue Engineering bleiben Tierversuche ein entscheidender Bestandteil der gefäßbiologischen Studien. In-vivo-Tierstudien haben enorme Einblicke in die Mechanismen der vaskulären Homöostase und Pathologie geliefert. Diese Verfahren sind jedoch kostspielig, haben einen relativ geringen Durchsatz und werfen erhebliche ethische Fragen auf. Darüber hinaus sind Kleintiere für die menschliche Gefäßphysiologie nur unzureichend repräsentativ, und größere Tierversuche sind erheblich teurer und werfen weitere ethische Überlegungen auf ^4,5. Mit der steigenden Nachfrage nach pharmazeutischen und medizinischen Lösungen für eine schnell alternde Bevölkerung werden die Nachteile der Verwendung von Tieren verstärkt, was sich auf die Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit und Übertragbarkeit der Ergebnisse auf die Patientenversorgung auswirkt⁶.

In-vitro-Systeme bieten eine vereinfachte Plattform zur Untersuchung grundlegender Mechanismen, können aber nicht die Komplexität des gesamten Gewebes, die Wechselwirkungen zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix sowie die mechanischen Kräfte rekapitulieren, die entscheidende Determinanten bei der Entwicklung von Gefäßerkrankungen sind⁷.

Ex-vivo-Studien, die an ganzen Geweben durchgeführt wurden, die in künstlich kontrollierten Umgebungen gehalten wurden, ahmen die In-vivo-Komplexität nach^und ermöglichen gleichzeitig Untersuchungen mit relativ hohem Durchsatz 8. Aufgrund der Fähigkeit, die Kulturbedingungen und die Umgebung genau zu kontrollieren, ermöglichen Ex-vivo-Modelle ein breites Spektrum komplexer Studien und bieten eine geeignete Alternative, um den Einsatz von tierischen Verfahren in der Gefäßbiologie zu reduzieren. Statische vaskuläre Ringkulturen boten interessante Einblicke, konnten aber das entscheidende hämodynamische Element⁹ nicht integrieren. In der Tat stellt die Untersuchung des Gefäßsystems ex vivo besondere Herausforderungen dar, die mit den vielen dynamischen Kräften zusammenhängen, die auf die Zellen innerhalb der Blutgefäßwand wirken. Stimuli wie luminale Strömung, Turbulenz, Scherspannung, Druck und Wandverformung haben einen signifikanten Einfluss auf die Pathophysiologie des Gewebes^10,11,12.

Perfusionsbioreaktoren sind unerlässlich für die Untersuchung der vaskulären Homöostase und des Umbaus als Reaktion auf Verletzungen oder hämodynamische Veränderungen¹³. Darüber hinaus kann die Perfusionskultur verwendet werden, um die Reifung und Haltbarkeit von Tissue-Engineering-Blutgefäßen (TEBVs) zu verbessern und geeignete Alternativen für Gefäßtransplantate zu bieten¹⁴.

Kommerziell erhältliche Perfusionsbioreaktoren sind in ihrer Flexibilität und Anpassungsfähigkeit eingeschränkt und kostspielig. Viele der existierenden, intern entwickelten Bioreaktoren sind jedoch aufgrund der begrenzten Beschreibungen und der Nichtverfügbarkeit speziell angefertigter Komponenten 7,8,9,10,11,12 nur schwer in anderen Labors zu replizieren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir kürzlich einen neuen Bioreaktor (EasyFlow) entwickelt, der wirtschaftlich herzustellen ist, eine Reihe von Geweben aufnehmen kann und relativ einfache Modifikationen ermöglicht, um sich an unterschiedliche Forschungsanforderungen anzupassen¹³. Der Einsatz ist 3D-gedruckt und passt wie in einen Deckel eines Standard-50-ml-Zentrifugenröhrchens. Sein modularer Aufbau und die 3D-Druckfertigung machen es in verschiedenen Labors zugänglich und reproduzierbar sowie leicht modifizierbar, um sich an unterschiedliche wissenschaftliche Anforderungen anzupassen. Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau und den grundlegenden Betrieb des Bioreaktorsystems in einer arteriellen Perfusionsumgebung.

Protokoll

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau und die Verwendung eines Systems, das aus zwei EasyFlow-Einsätzen (Bioreaktoren) besteht: einem, der die Reaktionskammer (C) darstellt, die die perfundierte Arterienprobe enthält, und einem, der als Mediumreservoir (R) fungiert (Abbildung 1 und Abbildung 2A). Die Halsschlagadern wurden von 4-6 Wochen alten männlichen und weiblichen Ferkeln (6-12 kg) am Pirbright Institute in Großbritannien gewonnen. Tierbehandlungen wurden gemäß dem Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986) (ASPA) durchgeführt und vom Animal Welfare and Ethical Review Board (AWERB) am Pirbright Institute genehmigt. Die Unterbringung der Tiere erfolgte in Übereinstimmung mit dem Verhaltenskodex für die Unterbringung und Pflege von Zuchttieren. Alle Verfahren wurden von Inhabern einer persönlichen Lizenz durchgeführt, die im Rahmen der Projektlizenz PPL70/8852 geschult und kompetent waren. Die Ferkel wurden nach der Schedule-One-Methode im Rahmen des ASPA gekeult.

1. Herstellung von Einsätzen

1. Fertigen Sie die Einlage im 3D-Druck unter Verwendung des bereitgestellten 3D-Modells (Zusatzdatei 1).
   HINWEIS: Die 3D-Modellierung ermöglicht einfache Änderungen am Design, um sie an neue Anwendungen anzupassen. Für die Herstellung des Einsatzes können auch alternative Materialien und alternative Fertigungstechniken verwendet werden. Aufgrund der komplexen inneren Struktur sind selektives Lasersintern und Stereolithographie geeignete Alternativen¹⁵. Polyamid 12 (PA12; siehe Materialtabelle) ist aufgrund seiner überlegenen Leistung in Bezug auf Flüssigkeitsrückhaltung und Beständigkeit gegen wiederholte Hitzesterilisationszyklen ein guter Materialkandidat¹⁶.
2. Herstellung der Silikondichtungen und Polycarbonat-Unterlegscheiben durch Laserschneiden¹⁷ unter Verwendung der in der Zusatzdatei 2 bereitgestellten Designs.
   HINWEIS: Das Laserschneiden ist leicht ausgelagert und eine billige Herstellungsmethode. Unterlegscheiben können aus Edelstahl hergestellt werden, was eine widerstandsfähigere Komponente für den wiederholten Gebrauch darstellt. Alle anderen Komponenten sind handelsübliche Artikel. Eine vollständige Liste der benötigten Materialien ist in Tabelle 1 enthalten. Die kaufmännischen Details der Artikel sind in der Materialtabelle enthalten.

2. Sterilisation, Montage und Grundierung von Geräten

1. Sterilisieren Sie alle Komponenten gemäß den Anweisungen in Tabelle 1.
2. Montieren Sie unter laminaren Strömungsbedingungen zwei gefertigte Einsätze (Schritt 1), wie in Abbildung 1A dargestellt.
3. Montieren Sie das Perfusionssystem wie in Abbildung 2 dargestellt, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:
   1. Schließen Sie zwei angeschlossene Dreiwegeventile an den R1-Anschluss (Medienwechselanschluss) des Behälters an.
   2. Verbinden Sie den so entstandenen Auslass mit dem Kopf der Schlauchpumpe über einen Schlauch, der mit einem Einwegventil (Einwegventilrohr) ausgestattet ist.
   3. Verbinden Sie den Pumpenkopf mit dem C4-Anschluss der Reaktionskammer über einen Systemschlauch, der mit einem Einwegventil ausgestattet ist.
      HINWEIS: Dieser Zweig kann optional mit einem Drucksensor ausgestattet werden, der eine ständige Überwachung ermöglicht.
   4. Verbinden Sie den Reaktionskammeranschluss C1 mit einem Weichwandschlauch und diesen mit dem Widerstandskanal (kleiner Innendurchmesser).
      HINWEIS: Die Länge des Widerstandsschlauchs hat einen großen Einfluss auf den im System vorhandenen Druck. Dies sollte weiter untersucht werden, um angemessene Perfusionsbedingungen zu gewährleisten.
   5. Verlängern Sie den Widerstandskanal mit dem Systemschlauch, wodurch ein Rückkanal entsteht und die luminale Zirkulationsschleife durch Anschließen an den Behälter bei R5 geschlossen wird (Abbildung 2C).
   6. Erzeugen Sie einen Überlaufkanal, indem Sie die Reaktionskammer C3 mit dem Reservoir R3 mit einem Systemschlauch verbinden.
   7. Bringen Sie einen Belüftungsfilter durch R2 an.
   8. Erzeugen Sie einen Druckdämpfer, indem Sie eine Spritze mit Luft und Medien an die Reaktionskammer C6 anschließen.
      HINWEIS: Das richtige Luft-zu-Medien-Verhältnis hängt von der erforderlichen Druckdämpfung ab.
4. Grundieren Sie das System mit Perfusionsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium [DMEM] + 10 % [v/v] fötales Kälberserum [FBS] + 1 % [v/v] Penicillin-Streptomycin + 1 % [v/v] Amphotericin B + 30 % [v/v] Dextran; siehe Materialtabelle) durch die Medienaustauschanschlüsse und das Reservoir.
   HINWEIS: Das Ansaugen des Systems reduziert das Risiko von eingeschlossenen Blasen im System und identifiziert potenzielle Leckagen. Das empfohlene Medienvolumen beträgt ca. 100-120 ml. Das verwendete Volumen hängt vom Totvolumen des Schlauchs ab, der für die Experimente verwendet wird.

3. Probenentnahme und -vorbereitung

1. Sammeln Sie die linke und rechte gemeinsame Halsschlagader, um die direkte Handhabung des arteriellen Gewebes zu minimieren¹³.
2. Legen Sie das Gewebe zum Transfer in kalte Transportmedien (DMEM+ 20% [v/v] FBS + 2% [v/v] Penicillin-Streptomycin + 1% [v/v] Amphotericin B, siehe Materialtabelle).
3. Entfernen Sie in einem Laminar-Flow-Schrank das überschüssige Bindegewebe und schneiden Sie die Enden des Gewebes mit einer Skalpellklinge ab. Waschen Sie das Taschentuch zweimal in kalten Transportmedien.
4. Legen Sie das Taschentuch für mindestens 30 Minuten auf einen Orbitalschüttler in Transportmedien und waschen Sie es gründlich aus.
5. Verbinden Sie ein nicht verzweigtes Segment der Arterie mit zwei Luer-Konnektoren mit Widerhaken mit dem Bioreaktorsystem und fixieren Sie es mit einem Gefäßverbund (vaskuläre Silikonbänder; Tabelle 1).
   HINWEIS: Die Behälterbindung sorgt für die richtige Spannung und den richtigen Rückzug, um das Gefäß zu sichern. Der ovale Schnitt beugt Gewebeschäden vor.
6. Fließen Sie das Medium vorsichtig durch die Arterie, um die Durchgängigkeit zu überprüfen.
7. Nachdem Sie die Arterie an dem hergestellten Einsatz befestigt haben, füllen Sie den Reaktionsraum mit Perfusionsmedien (Schritt 2.4). Zum Schluss füllen Sie den luminalen Zirkulationskreislauf vorsichtig mit Medien, um die verbleibende Luft aus dem System zu entfernen.
8. Verbinden Sie den Reaktionsraum mit dem zuvor montierten Perfusionssystem (Abschnitt 2) und vervollständigen Sie den Kreislauf.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, eine immunhistochemische Qualitätskontrolle des verarbeiteten Gewebes durchzuführen. Dadurch werden eventuelle Beschädigungen durch übermäßige Handhabung bei der Zubereitung identifiziert.

4. Perfusionskultur und Medienwandel

1. Platzieren Sie das Perfusionssystem in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % CO₂ und schließen Sie es dann an eine Schlauchpumpe an (siehe Materialtabelle)
2. Schließen Sie zusätzliche (fakultative) Erfassungssysteme, wie z. B. Drucksensoren, an (siehe Materialtabelle).
3. Lassen Sie das System über Nacht mit einer niedrigen Mediendurchflussrate von ~10-15 ml/min ausgleichen.
   HINWEIS: Erste Versuche zur Bestimmung der Pumpeneinstellungen, des Mediendurchflusses, des Systemdrucks und der optimalen Einstellungen der Druckdämpfer/-klemmen sind erforderlich, um sicherzustellen, dass die entsprechenden Bedingungen erfüllt sind.
4. Erhöhen Sie am nächsten Tag den Durchfluss schrittweise (+1 U/min pro Stunde, entspricht einer Erhöhung von ~2,5 ml/min pro Stunde im aktuellen System), bis die endgültige Durchflussrate (35 ml/min) erreicht ist. Überwachen Sie das System regelmäßig auf Leckagen.
   HINWEIS: Um die genaue Durchflussrate basierend auf der Drehzahl der peristaltischen Pumpe zu berechnen, muss der Benutzer zunächst eine angemessene Pumpenkalibrierung^{durchführen 18}. Mit der Formel (1) kann der Volumenstrom (Q) auf der Grundlage des innerhalb einer bestimmten Zeit (t) abgegebenen Volumens (V) berechnet werden. Zur Berechnung der geschätzten Strömungsgeschwindigkeit () können wir die zuvor berechnete Durchflussmenge (Q) und die Fläche des Behälterquerschnitts (A) verwenden, die in Gleichung (2) beschrieben sind.
   (1)
   (2)
5. Tauschen Sie alle 3 Tage 50 % des Mediums (~50 ml) aus, indem Sie eine mit frischem Medium gefüllte Spritze an den Medienwechselanschluss näher an der Pumpe und eine leere Spritze an den Anschluss näher am Reservoir anschließen, um das verbrauchte Medium aufzufangen (Abbildung 2).
   HINWEIS: Die Verwendung von zwei Dreiwegeventilen als Medienaustauschöffnungen erleichtert den kontinuierlichen Betrieb der Perfusion während des Medienwechsels.
6. Am Ende des Experiments wird das Gewebe aus der Reaktionskammer entnommen, indem die mit dem Bioreaktor verbundenen Enden mit einer sterilen chirurgischen Schere abgeschnitten werden.
7. Zerlegen, reinigen und sterilisieren Sie das System für die weitere Verwendung.

5. Analyse der Proben

1. Die entnommene Probe wird über Nacht bei 4 °C in 4%igem Paraformaldehyd (PFA) fixiert.
2. Das Gewebe wird bei optimaler Schnitttemperatur (OCT; siehe Materialtabelle⁾¹⁹ eingebettet und durch Eintauchen in Iso-Pentan, das in flüssigem Stickstoff gekühlt wird, eingefroren.
3. Kryoschnitte mit einer Dicke von 3-5 mm werden mit einem Kryostaten hergestellt.
4. Durchführung von Immunhistochemie (Hämatoxylin und Eosin [H&E]) und/oder Immunfluoreszenz. Befolgen Sie das typische Immunfluoreszenzprotokoll:
   1. Die Scheiben für 1 h bei Raumtemperatur mit 20%igem [v/v] Ziegenserum in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; siehe Materialtabelle) blockieren.
   2. Die Scheiben werden über Nacht bei 4 °C mit einem primären Kaninchen-Antikörper gegen CD31, der 1:50 in PBS verdünnt ist, inkubiert (siehe Materialtabelle).
   3. Dreimal 5 Minuten lang mit PBS waschen.
   4. 1 Stunde lang bei 37 °C mit fluoreszenzmarkiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, der 1:200 in PBS verdünnt ist, und direkt konjugiertem Fluoreszenz-Antikörper aus α-glatter Muskulaturaktin (SMA), der 1:200 in PBS verdünnt ist (siehe Materialtabelle).
   5. Dreimal 5 Minuten lang mit PBS waschen.
   6. Färben Sie die Kerne mit DAPI verdünnt 1:1.000 in PBS für 10 min bei Raumtemperatur.
   7. Inkubieren Sie mit 0,1 % (w/v) Sudan Black (siehe Materialtabelle) in 70 % (v/v) Ethanol für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Autofluoreszenz des Gewebes zu reduzieren.
   8. Waschen Sie das Gewebe mit reichlich deionisiertem Wasser. Montieren Sie die Objektträger im Eindeckmedium.
   9. Bilden Sie die Proben mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ab.

Diskussion

Ex-vivo-Gefäßperfusionssysteme stellen eine einzigartige Plattform dar, um die Funktion und das Verhalten von Gefäßzellen in ihren natürlichen Geweben unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen, was die Analyse komplexer Prozesse wie des Gefäßumbaus nach Verletzungen ermöglicht²². Bei den meisten Bioreaktoren handelt es sich jedoch um intern hergestellte Systeme, die auf maßgeschneiderten Komponenten basieren und oft nur schwer von anderen repliziert werden^{können 23}. Es gibt alternative kommerzielle Lösungen, aber es fehlt ihnen an Flexibilität in der Gestaltung und sie können relativ kostspielig sein²⁴.

Wir haben ein alternatives System entwickelt, das eine einfache, kostengünstige und reproduzierbare Plattform bietet, die mit Open-Source-3D-Drucktechniken hergestellt werden kann¹³. Der vorliegende Artikel beschreibt den Aufbau des Systems, um reproduzierbare Anwendungen durch Endbenutzer zu ermöglichen. Dieser Aufbau ermöglicht die Anwendung physiologischer und pathologischer Bedingungen wie Druck (40-180 mmHg), Flussrate (6-30 ml/min) und in Kombination mit Medien, die die Blutviskosität nachahmen, mit unterschiedlichen Scherspannungen.

Die Reproduzierbarkeit ist ein wesentlicher Aspekt des wissenschaftlichen Prozesses, da sie es den Forschern ermöglicht, die Ergebnisse anderer zu validieren und darauf aufzubauen, um unser Verständnis von Gefäßerkrankungen zu verbessern. Darüber hinaus sind Werkzeuge, die die Zusammenarbeit zwischen Gruppen ermöglichen und fördern, für den Fortschritt wissenschaftlicher Erkenntnisse unerlässlich. EasyFlow ist ein Beispiel für solche zugänglichen Open-Source-Lösungen, die von Laboren, die an einer Vielzahl von Projekten im Bereich der Gefäßwissenschaften und darüber hinaus arbeiten, leicht erstellt und übernommen werden können.

Wir berichten, dass diese Gerätekultur die Lebensfähigkeit des arteriellen Gewebes für mindestens 7 Tage aufrechterhält und verwendet werden kann, um bestimmte Schritte von Gefäßerkrankungen zu modellieren. Damit ließen sich physiologische Flussraten und Druckverhältnisse modellieren¹³. Wichtig ist, dass diese Perfusionskultur aufgrund der niedrigen Produktionskosten und der geringen Menge an Medium, die für den Betrieb des Systems erforderlich ist, kostengünstig ist.

Das 3D-Design kann auch an neue Anwendungen angepasst und neue Materialien für den Druck getestet werden. Auch im aktuellen Format kann der Probenraum leicht an Proben unterschiedlicher Größe angepasst werden, indem die Länge der Anschlüsse oder die Bohrung der Luer-Konnektoren geändert wird. Es ist wichtig zu beachten, dass dieser Bioreaktor aufgrund des modularen Charakters des Geräts und seiner geringen Abmessungen in mehreren Aufbauten verwendet werden kann (Abbildung 5) und auf Multiplexkulturen angewendet werden kann, bei denen mehrere Proben gleichzeitig in separaten Bioreaktoren unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt werden können.

Es ist vorgesehen, die Verwendung des Systems in Zukunft auszuweiten, um die Kultur von Blutgefäßen unterschiedlichen Ursprungs (z. B. verschiedene Spezies) und unterschiedlicher Art (z. B. Venen, Lymphgefäße) zu unterstützen und möglicherweise auf die Kultur anderer Hohlgewebe (z. B. Luftröhre, Darm) anzuwenden. Insbesondere zeigt die Forschung, dass die Kultivierung von Tissue-Engineering-Scaffolds in konstanter Perfusion die homogene Verteilung von Zellen innerhalb des Konstrukts und die Reifung des resultierenden Gewebes unterstützt^25,26. Darüber hinaus trägt die Aussaat von Gefäßtransplantaten in Perfusion dazu bei, im Vergleich zu statischen Methoden ein gleichmäßigeres zellularisiertes Gefäßlumen zu erreichen²⁷. Aus diesem Grund stellen wir uns vor, dass das System auf das Tissue Engineering angewendet wird, um die aktuellen Herausforderungen zu bewältigen und die zukünftige Entwicklung reproduzierbarer synthetischer Blutgefäßersatzstoffe zu ermöglichen²⁸.

Das hier beschriebene Protokoll stellt einige wichtige Schritte vor, die für den Erfolg der Flow-Kultur entscheidend sind. Die Festlegung und Überwachung geeigneter Strömungsbedingungen ist nicht trivial und muss bei der erstmaligen Einrichtung jedes Systems durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Kulturbedingungen physiologisch sind. Der Durchfluss und der Druck wurden mit Hilfe von Drucksensoren und Ultraschall überwacht. Ein weiterer kritischer Punkt ist die Sicherstellung, dass das Gewebe zu Beginn der Kultur lebensfähig und intakt ist. Dies erfordert eine frische Quelle, einen sorgfältigen Umgang und kann durch eine histologische Analyse nachgewiesen werden. Darüber hinaus muss zu Beginn jedes Experiments eine Fehlersuche durchgeführt werden, um potenzielle bakterielle Kontaminationen oder Medienleckquellen zu identifizieren.

Es ist wichtig hervorzuheben, dass das beschriebene Perfusionssystem zwar physiologische Druck- und Strömungsbedingungen liefert, aber nicht in der Lage ist, die komplexen Druckwellenmuster, die in vivo aufgezeichnet werden, vollständig nachzuahmen. Diese Einschränkung ist auf die Verwendung einer Peristaltikpumpe zurückzuführen und kann mit spezialisierteren Geräten zur Reproduktion fortgeschrittener hämodynamischer Bedingungen behoben werden. Die Kultur von Blutgefäßen in einem Bioreaktor ist auch nicht in der Lage, Studien zu behandeln, bei denen das Immunsystem oder die Interaktion mit anderen Organen entscheidend ist.

Abschließend wird ein einfaches 3D-gedrucktes Perfusionssystem vorgestellt, das die physiologische hämodynamische Umgebung nachahmen kann, von dem erwartet wird, dass es zur Standardisierung von ex vivo Blutgefäßkulturen beiträgt. Sein Potenzial für die Anpassung und Anwendung auf Langzeitkulturen macht es zu einem unverzichtbaren Werkzeug, um das Verständnis dieser komplexen biologischen Systeme in physiologischer und pathologischer Hinsicht zu verbessern.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasyFlow	-	-	3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs
PA12 - 3D printing	Protolabs	-	-
Peristaltic pump	Heidolph	PD5201
Culture media components:
Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water	Sigma-Aldrich	A2942-20ML
Dextran  from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D8802-25ML
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D6429-6X500ML
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F9665
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Immunostaining materials:
Cryostat	LEICA	CM3050 S
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-10MG
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-10ML
Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11008
Invitrogen eBioscience Fluoromount G	Thermo Fisher Scientific	50-187-88
MX35 Premier + Microtome Blade	Thermo Scientific	3052835
Optimal Cooling Tempearure Compound - OCT	Agar Scientific	AGR1180
Rabbit α-CD31 antibody	Abcam	ab28364
Sudan Black B	Santa Cruz Biotechnology	SC-203760
X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box	Fisher Scientific	J1800AMNZ
α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody	R&D Systems	IC1420R
Material for laser cutting of components:
Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of  washers)	RS Components	258-6590
RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of  silicone seals)	RS Components	840-5541
Optional pressure monitors:
Pressure sensor	Parker Hannifin	080-699PSX-3P-5
SciPres Pressure Monitor	Parker Hannifin	206-200-M
Pre-sterilized single use plasticware:
0.2 um filter	Sarstedt	70.1114.210
20 mL Sterile syringe	IMS Euro	40004
50 mL Centrifuge Tube	Thermo Fisher Scientific	Sarstedt - 62.547.254
Small components:
Cable ties	-	-
Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb	Cole-Parmer	WZ-30800-10	Barb Adaptor
Masterflex Polycarbonate Luer Fittings	Cole-Parmer	AU-45504-84
Nylon Miniature Check Valve	Cole-Parmer	98553-00
RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of  silicone seals)	RS Components	840-5541
Stainless Steel M2 Hex Nuts	RS Components	527-218
Stainless Steel M2 x 6 mm Screws	RS Components	418-7426
Stainless Steel M5 Hex Nuts	RS Components	189-585
Surgical vessel loop	Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies	10-1003
Three-way valves	IMS Euro	91000
Surgical Equipment
Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07	International Medical Supplies	SKU: BD-07
Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm	International Medical Supplies	SKU: BD-361
Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm	International Medical Supplies	SKU: FD-12
Troge Surgical Scalpels - Size 23 - Box of 100	International Medical Supplies	63114
Tubing:
Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm)	Eppendorf	M0740-2396	System tubing
Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing	ISMATEC	95714-48	Soft wall tubing (for clamp)
RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone	RS Components	667-8432	Resistance tubing (small inner diameter)
Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm)	Heidolph	525-30027-00-0	One way valve tube
Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene	RS Components	125-4042	Pump Tubing