Microdiálisis intradérmica: un enfoque para investigar nuevos mecanismos de disfunción microvascular en humanos

Resumen

La microdiálisis intradérmica es una técnica mínimamente invasiva que se utiliza para investigar la función microvascular en la salud y la enfermedad. Tanto los protocolos dosis-respuesta como los de calentamiento local se pueden utilizar para esta técnica para explorar los mecanismos de vasodilatación y vasoconstricción en la circulación cutánea.

Resumen

La vasculatura cutánea es un tejido accesible que se puede utilizar para evaluar la función microvascular en humanos. La microdiálisis intradérmica es una técnica mínimamente invasiva que se utiliza para investigar los mecanismos del músculo liso vascular y la función endotelial en la circulación cutánea. Esta técnica permite la disección farmacológica de la fisiopatología de la disfunción endotelial microvascular indexada por la disminución de la vasodilatación mediada por óxido nítrico, un indicador del riesgo de desarrollo de enfermedades cardiovasculares. En esta técnica, se coloca una sonda de microdiálisis en la capa dérmica de la piel y se coloca una unidad de calentamiento local con una sonda de flujometría láser Doppler sobre la sonda para medir el flujo de glóbulos rojos. La temperatura local de la piel se restringe o estimula con la aplicación directa de calor, y los agentes farmacológicos se perfunden a través de la sonda para estimular o inhibir las vías de señalización intracelular con el fin de inducir vasodilatación o vasoconstricción o para interrogar mecanismos de interés (cofactores, antioxidantes, etc.). Se cuantifica la conductancia vascular cutánea y se pueden delinear los mecanismos de disfunción endotelial en estados patológicos.

Introducción

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte en^{los Estados Unidos}. La hipertensión arterial (HTA) es un factor de riesgo independiente para el accidente cerebrovascular, la enfermedad coronaria y la insuficiencia cardíaca y se estima que afecta a más del ~ 50% de la población de los Estados Unidos². La HTA puede desarrollarse como una ECV independiente (HTA primaria) o como resultado de otra afección, como la enfermedad renal poliquística y/o los trastornos endocrinos (HTA secundaria). La amplitud de las etiologías de la HTA complica las investigaciones sobre los mecanismos subyacentes y el daño a los órganos terminales observado con la HTA. Se necesitan enfoques de investigación diversos y novedosos sobre la fisiopatología del daño a los órganos terminales asociado con la HTA.

Uno de los primeros signos patológicos de ECV es la disfunción endotelial, caracterizada por una vasodilatación mediada por óxido nítrico (NO)^{alterada 3,4,5}. La dilatación mediada por flujo es un enfoque común utilizado para cuantificar la disfunción endotelial asociada con la ECV, pero la disfunción endotelial en los lechos microvasculares puede ser independiente y precursora de la de las grandes arterias de los conductos ^6,7,8. Además, las arteriolas de resistencia actúan más directamente sobre el tejido local que las arterias conducto y tienen un control más inmediato sobre el suministro de sangre rica en oxígeno. La función microvascular es predictiva de supervivencia libre de eventos cardiovasculares adversos ^9,10,11. La microvasculatura cutánea es un lecho vascular accesible que se puede utilizar para examinar las respuestas a estímulos vasoconstrictores o vasodilatadores fisiológicos y farmacológicos. La microdiálisis intradérmica es una técnica mínimamente invasiva, cuyo objetivo es investigar los mecanismos de la función vascular del músculo liso y endotelial en la microvasculatura cutánea con disección farmacológica dirigida. Este método contrasta con otras técnicas, como la hiperemia reactiva post-oclusiva, que no permite la disección farmacológica, y la iontoforesis, que permite la administración farmacológica pero es menos precisa en su mecanismo de acción (revisado en profundidad en otro lugar¹²).

La justificación del desarrollo y uso de esta técnica se examina ampliamente en otro lugar¹³. Este enfoque se desarrolló originalmente para su uso en la investigación neurológica en roedores y luego se aplicó por primera vez a los humanos para investigar los mecanismos subyacentes a la vasodilatación activa desde un punto de vista termorregulador. A finales de la década de 1990, este método se utilizó para examinar los mecanismos neurales y endoteliales con respecto al calentamiento local de la piel. Desde entonces, la técnica se ha utilizado para investigar una serie de mecanismos de señalización neurovascular en la piel.

Utilizando esta técnica, nuestro grupo y otros han interrogado los mecanismos de la disfunción endotelial en la microvasculatura de varias poblaciones clínicas, incluyendo, entre otras, dislipidemia, envejecimiento primario, diabetes, enfermedad renal crónica, síndrome de ovario poliquístico, preeclampsia, trastorno depresivo mayor 14,15,16,17,18,19 e hipertensión ^20,21,22,23,24. Por ejemplo, un estudio previo encontró que las mujeres normotensas con antecedentes de preeclampsia, que tienen un mayor riesgo de ECV, tenían una vasodilatación mediada por NO reducida en la circulación cutánea en comparación con las mujeres con antecedentes de embarazo normotenso²⁰. En otro estudio, los adultos diagnosticados con HTA primaria demostraron una mayor sensibilidad a la angiotensina II en la microvasculatura en comparación con los controles sanos²¹, y se ha demostrado que la farmacoterapia antihipertensiva con donación crónica de sulfhidrilo en pacientes con HTA primaria disminuye la presión arterial y mejora tanto la vasodilatación mediada por sulfuro de hidrógeno como por NO²². Wong et ^al.23 encontraron una vasodilatación sensitiva y mediada por NO en adultos prehipertensos, coincidiendo con nuestro hallazgo de una progresión de la disfunción endotelial con el aumento de los estadios de HTA, según la categorización de las guías de la Asociación Americana del Corazón y el Colegio Americano de Cardiología de 2017²⁴.

La técnica de microdiálisis intradérmica permite realizar investigaciones mecanicistas estrictamente controladas sobre la función microvascular en estados de salud y enfermedad. Por lo tanto, este trabajo tiene como objetivo describir la técnica de microdiálisis intradérmica aplicada por nuestro grupo y otros. Detallamos los procedimientos tanto para la estimulación farmacológica del endotelio con acetilcolina (ACh) para examinar la relación dosis-respuesta como para la estimulación fisiológica de la producción endógena de NO con un protocolo de estímulo de calentamiento local a 39 °C o 42 °C. Presentamos resultados representativos para cada abordaje y discutimos las implicaciones clínicas de los hallazgos que han surgido de esta técnica.

Protocolo

Todos los procedimientos son aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Estatal de Pensilvania antes del reclutamiento de los participantes.

1. Configuración del equipo

1. Encienda la unidad de calefacción local y el caudalímetro láser Doppler.
   NOTA: Ambos deben calibrarse antes de la recopilación de datos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El caudalímetro láser Doppler debe conectarse a un hardware de adquisición de datos con muestreo a 100 Hz (100 muestras/min) y registro continuo en un software de adquisición de datos. Si bien se puede utilizar otro hardware y software de adquisición de datos, para simplificar, las instrucciones restantes reflejan el hardware de PowerLab y las capacidades del software LabChart.
2. Abra un archivo de software LabChart.
   NOTA: Se debe crear de antemano un archivo de referencia con la entrada de datos deseada y las capacidades de recopilación continua de datos. Debe haber un panel para cada láser Doppler y calentador local que corresponda a cada sitio de microdiálisis, y los paneles deben corresponder a las entradas de canal apropiadas en la unidad de hardware de adquisición de datos.

2. Colocación de fibras de microdiálisis

1. Identifique los vasos sanguíneos grandes y visibles de la piel en la cara ventral del antebrazo e indíquelos con un marcador permanente (utilice un torniquete para visualizar los vasos si es necesario; la identificación de vasos en la piel de pigmentación oscura puede requerir una mayor dependencia de la palpación).
2. Frote el área que abarca las marcas y una porción generosa del área circundante con hisopos de betadine. Limpie el betadine con hisopos con alcohol. Cubra el área esterilizada de la piel con un paño estéril y aplique hielo durante ~ 5 minutos para adormecer el área.
3. Retire el hielo e inserte una aguja introductora (23 G, 25 mm de longitud), biselada hacia arriba, en la capa dérmica de la piel a una profundidad de 2-3 mm (dependiendo del grosor de la piel individual). Avance la aguja, teniendo cuidado de permanecer en la capa dérmica, y salga de la piel ~ 20 mm desde el punto de inserción.
   NOTA: Para confirmar la profundidad adecuada de colocación en la piel, la forma de la aguja debe ser visible y fácilmente palpable, pero el color de la aguja debe estar oculto. Si se requiere más de una sonda de microdiálisis para el experimento, será necesario colocar dos agujas introductoras a una distancia de ≥2,5 cm y colocarlas antes de la inserción de la sonda de microdiálisis. Las sondas no deben colocarse a lo largo del mismo recipiente principal.
4. Dejando la aguja en su lugar, conecte la sonda (a través del bloqueo Luer) a una jeringa que contenga solución de Ringer lactato. Pase el extremo opuesto de la sonda a través de la aguja introductora hasta que la membrana semipermeable de la sonda esté cerca pero aún fuera de la abertura de la aguja introductora. Perfundir lentamente una pequeña cantidad de solución de Ringer a través de la fibra hasta que la solución se perfunda visiblemente a través de los poros de la membrana para confirmar la integridad de la membrana.
5. Si utiliza una sonda de microdiálisis de Harvard Bioscience y una aguja introductora, siga los pasos 2.5.1-2.5.2.
   1. Una vez confirmada la función de la sonda, pase la sonda a través de la aguja introductora hasta que la membrana esté completamente contenida en la capa dérmica de la piel dentro de la aguja introductora.
   2. Con un dedo, asegure la sonda en su lugar proximal a la aguja y retire la aguja en la dirección opuesta a la inserción. Coloque cinta adhesiva en la parte externa de la fibra en su lugar sobre la piel para evitar el desplazamiento de la membrana semipermeable durante el experimento.
6. Si utiliza una sonda de microdiálisis de Bioanalytical Systems y una aguja introductora, siga los pasos 2.6.1-2.6.2.
   1. Una vez confirmada la función de la sonda, tome el cubo de la aguja introductora y la parte distal de la sonda de microdiálisis con una mano y, simultáneamente, retire la aguja opuesta a la dirección de inserción, moviendo la sonda de microdiálisis a su lugar.
   2. Ajuste la sonda según sea necesario para asegurarse de que la membrana semipermeable esté enterrada completamente en la piel. Coloque cinta adhesiva con cinta adhesiva la fibra externa en su lugar sobre la piel para evitar el desplazamiento de la membrana semipermeable durante el experimento.

3. Hiperemia

1. Mientras espera a que disminuya la respuesta hiperémica a la inserción de la aguja (~60-90 min), coloque la jeringa de un solo uso en la bandeja portajeringas de las bombas de microinfusión. Perfundir solución de Ringer, solución salina o solución vehicular lactato (la solución en la que se disuelve el agente farmacológico experimental; 2 μL/min) durante la fase de hiperemia.
   NOTA: Si bien las sondas de microdiálisis no se pueden quitar durante esta fase de ~ 60-90 minutos, el participante puede ajustar la posición de su cuerpo o mover la mano, o el bloqueo Luer de la sonda se puede quitar de la jeringa y asegurar con cinta adhesiva al brazo del participante para permitirle un rango de movimiento libre para pararse brevemente. Una vez instrumentadas con calentadores locales y sondas de flujo Doppler láser (LDF) y una vez que ha comenzado la recopilación de datos, las sondas LDF no se pueden mover.
2. Cuando el enrojecimiento de la piel, que es un indicador de la respuesta hiperémica al traumatismo con aguja, haya disminuido, conecte la unidad de calentamiento local a la piel que cubre la membrana semipermeable a través del disco adhesivo de la sonda, asegurándose de que el centro del calentador se alinee con la trayectoria de la sonda de microdiálisis.
3. Coloque la sonda LDF en la abertura en el centro del calentador local de modo que el láser quede directamente perpendicular a la superficie de la piel. Una vez colocadas y aseguradas las sondas LDF, haga clic en iniciar en el software de adquisición de datos para registrar y mostrar continuamente los valores de flujo de glóbulos rojos (flujo de glóbulos rojos; unidades de perfusión, PU). Si la hiperemia ha disminuido por completo, el flujo de glóbulos rojos será estable en ~5-20 PU (la pulsatilidad de los vasos debajo de la sonda LDF puede reflejarse por ligeras elevaciones en la PU que coinciden con los latidos del corazón).
4. Coloque un manguito automático de presión arterial en el brazo de un sujeto que no haya sido instrumentado.
5. Ajuste los calentadores locales a 33 °C para mantener la temperatura de la piel dentro de un rango termoneutro^{de 25}, eliminando así cualquier variación en la influencia de los estímulos térmicos. Para agregar un comentario a la grabación continua en el software de adquisición de datos para denotar eventos en el experimento, haga clic en el cuadro de texto en la esquina superior derecha de la pantalla, escriba un comentario, seleccione qué canales deben recibir el comentario y haga clic en agregar.

4. Protocolo dosis-respuesta acetilcolina

1. Una vez que el flujo de glóbulos rojos se haya estabilizado en respuesta al calor local de 33 °C, comience la recopilación de datos de referencia, que se distingue en el archivo de software de adquisición de datos mediante un comentario de inicio de línea de base. Se requiere al menos un mínimo de 5-10 minutos de línea de base estable para el análisis de datos; reinicie la línea de base en cualquier momento durante este punto de la recopilación de datos si es necesario, y márquelo en el archivo LabChart. En el último minuto de la línea de base, recopile una medición de la presión arterial e ingrese los valores en un comentario en el archivo LabChart.
2. Al final de los 5-10 minutos de la recopilación de datos de referencia, mida y registre la presión arterial de referencia e ingrese el comentario final de la línea de base en el software de adquisición de datos.
3. Apague las bombas de microinfusión y cambie las jeringas llenas de solución de Ringer lactato por la jeringa llena con la concentración más baja de ACh (10⁻¹⁰ M).
4. Asegure las jeringas nuevas en su lugar y confirme la perfusión del líquido a través del extremo de la sonda antes de volver a encender las bombas de microinfusión. Introduzca el comentario begin −10 en la grabación del software de adquisición de datos.
5. Cada concentración de ACh se perfundirá durante 5-10 min a 2 μL/min. En el último minuto de perfusión, para cada concentración, mida y registre la presión arterial. Una vez finalizado el tiempo de perfusión para una concentración dada, sustituya la jeringa por la siguiente concentración más alta (por ejemplo, se cambia la solución de 10⁻¹⁰ M ACh por una solución de 10⁻⁹ M de ACh), como se describe en los pasos 4.2-4.4.
6. Inmediatamente después de perfundir la concentración final de ACh (10⁻¹ M), sustituya la jeringa de ACh por una que contenga solución de Ringer y aumente la temperatura del calentador local a 43 °C. Una vez que el flujo de glóbulos rojos se haya estabilizado, reemplace la solución de Ringer con nitroprusiato de sodio (28 mM) para producir una vasodilatación local máxima inducida por calor e inducida farmacológicamente. Mida y registre la presión arterial cada ~3 minutos durante esta fase de vasodilatación máxima.
7. Una vez que se haya producido una meseta máxima de flujo de glóbulos rojos (~5 min de PU estable), finalice el experimento. Seleccione detener en la esquina inferior derecha del software de adquisición de datos para finalizar la recopilación continua de datos.

5. Protocolo de calefacción local

1. Una vez que el flujo de glóbulos rojos se haya estabilizado después de la hiperemia, comience la recopilación de datos de referencia e indíquelo en el archivo del software de adquisición de datos con un comentario. En el último minuto de la línea de base, recopile una medición de la presión arterial e ingrese los valores en un comentario en el archivo de software de adquisición de datos.
2. Aumente los calentadores locales a 39 °C o 42 °C, según las necesidades del protocolo (explicado en la sección de discusión).
3. Una vez que el flujo de glóbulos rojos se ha estabilizado en respuesta a la aplicación de calor local (~40-60 min de calentamiento), perfundir N G-nitro-l-arginina éster metílico (L-NAME; 15 mM disuelto en la solución de Ringer; 2 μL/min; un inhibidor de la NO sintasa) a través de la(s) sonda(s) de microdiálisis.
4. Una vez que el flujo de glóbulos rojos se haya estabilizado en respuesta a L-NAME (~15-25 min de perfusión), aumente los calentadores locales a 43 °C.
5. Una vez que el flujo de glóbulos rojos se ha estabilizado en respuesta a 43 °C (se produce una meseta de ~2-5 min después de ~20-45 min de calentamiento), perfundir nitroprusiato de sodio (28 mM disueltos en la solución de Ringer) a través de la(s) sonda(s) de microdiálisis.
6. Una vez que se haya producido una meseta máxima de flujo de glóbulos rojos (~5 min de PU estable), finalice el experimento. Seleccione detener en la esquina inferior derecha del software de adquisición de datos para finalizar la recopilación de datos.

6. Extracción de las sondas de microdiálisis

1. Una vez finalizado el experimento, utilice unas tijeras quirúrgicas para cortar las sondas de microdiálisis. Retire con cuidado las sondas LDF de los calentadores y retire los calentadores de la piel. Retire con cuidado la cinta que sujeta las sondas en su lugar sobre la piel.
2. Identifique visualmente qué sitio de punción a cada lado de la sonda ha formado el coágulo de sangre más pequeño. Corte la parte de la sonda cerca del sitio con el coágulo más pequeño, dejando ~ 1 pulgada de la sonda fuera de la piel sin cortar.
3. Limpie la parte de la piel que rodea los sitios de entrada y salida de la sonda con un hisopo con alcohol, así como la longitud de ~ 1 de la sonda que queda en el sitio menos coagulado.
4. Deja que el alcohol se seque en la piel. Luego, agarre la parte de la sonda que se extiende desde el sitio de punción con el coágulo mayor, opuesta a la porción de ~ 1 en el extremo menos coagulado. Tire lentamente de la sonda hacia el coágulo de sangre más grande.
5. Coloque una gasa estéril sobre cualquier sangrado que resulte de la extracción de la sonda y aplique presión.

Resultados

Protocolo dosis-respuesta acetilcolina

La Figura 1A muestra un esquema que detalla el protocolo dosis-respuesta de ACh. La Figura 1B ilustra los trazados representativos de los valores de flujo de glóbulos rojos (unidades de perfusión, PU; promedios de 30 s) del protocolo estandarizado de dosis-respuesta de ACh para un sujeto a lo largo del tiempo. La Figura 1C ilustra un archivo de dat...

Discusión

La técnica de microdiálisis intradérmica es una herramienta versátil en la investigación vascular humana. Los investigadores pueden modificar el protocolo para diversificar aún más sus aplicaciones. Por ejemplo, describimos un protocolo dosis-respuesta de ACh, pero otras investigaciones sobre los mecanismos de vasoconstricción o tono vasomotor, en lugar de la vasodilatación sola, han utilizado enfoques dosis-respuesta de norepinefrina o nitroprusiato sódico 26,27,28,29,30,31.<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD Syringes	302100
Acetlycholine	United States Pharmacopeia	1424511	Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator
Alcohol swabs	Mckesson	191089
Baby Bee Syringe Drive	Bioanalytical Systems, Incorporated	MD-1001	In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized
CMA 30 Linear Microdialysis Probes	Harvard Apparatus	CMA8010460
Connex Spot Monitor	WelchAllyn	74CT-B	automated blood pressure monitor
Hive Syringe Pump Controller	Bioanalytical Systems, Incorporated	MD-1020	Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives
LabChart 8	AD Instruments		**PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions
Lactated Ringer's Solution	Avantor (VWR)	76313-478
Laser Doppler Blood FlowMeter	Moor Instruments	MoorVMS-LDF
Laser Doppler probe calibration kit	Moor Instruments	CAL
Laser Doppler VP12 probe	Moor Instruments	VP12
Linear Microdialysis Probes	Bioanalytical Systems, Inc.	MD-2000
NG-nitro-l-arginine methyl ester	Sigma Aldrich	483125-M	L-NAME
Povidone-iodine / betadine	Dynarex	1202
PowerLab C Data Acquisition Device	AD Instruments	PLC01	**
PowerLab C Instrument Interface	AD Instruments	PLCI1	**
Probe adhesive discs	Moor Instruments		attach local heating unit to skin
Skin Heater Controller	Moor Instruments	moorVMS-HEAT 1.3
Small heating probe	Moor Instruments	VHP2
Sterile drapes	Halyard	89731
Sterile gauze	Dukal Corporation	2085
Sterile surgical gloves	Esteem Cardinal Health	8856N	catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium)
Surgical scissors	Cole-Parmer	UX-06287-26