피내 미세투석: 인간의 미세혈관 기능 장애의 새로운 메커니즘을 조사하기 위한 접근 방식

요약

피내 미세투석은 건강과 질병의 미세혈관 기능을 조사하는 데 사용되는 최소 침습 기술입니다. 용량 반응 및 국소 가열 프로토콜은 모두 피부 순환에서 혈관 확장 및 혈관 수축의 메커니즘을 탐구하기 위해 이 기술에 활용될 수 있습니다.

초록

피부 혈관은 인간의 미세혈관 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 접근 가능한 조직입니다. 피내 미세투석은 피부 순환에서 혈관 평활근과 내피 기능의 메커니즘을 조사하는 데 사용되는 최소 침습 기술입니다. 이 기술은 심혈관 질환 발병 위험의 지표인 산화질소 매개 혈관 확장 감소로 지수화된 미세혈관 내피 기능 장애의 병태생리학을 약리학적으로 해부할 수 있습니다. 이 기술에서는 미세 투석 프로브를 피부의 진피층에 배치하고 레이저 도플러 유량 측정 프로브가 있는 국소 가열 장치를 프로브 위에 배치하여 적혈구 플럭스를 측정합니다. 국소 피부 온도를 직접 열 가하여 고정하거나 자극하고, 혈관 확장 또는 혈관 수축을 유도하거나 관심 기전(보조 인자, 항산화제 등)을 조사하기 위해 세포 내 신호 전달 경로를 자극 또는 억제하기 위해 약리학적 제제를 프로브를 통해 관류합니다. 피부 혈관전도도를 정량화하고, 질병 상태에서 내피 기능 장애의 기전을 규명할 수 있습니다.

서문

심혈관 질환(CVD)은 미국의 주요 사망 원인입니다¹. 고혈압(HTN)은 뇌졸중, 관상 동맥 심장 질환 및 심부전의 독립적인 위험 요인이며 미국 인구의 ~50% 이상에 영향을 미치는 것으로 추정됩니다². HTN은 독립적인 CVD(원발성 HTN) 또는 다낭성 신장 질환 및/또는 내분비 장애(이차성 HTN)와 같은 다른 상태의 결과로 발생할 수 있습니다. HTN의 광범위한 병인은 HTN에서 관찰되는 기저 메커니즘 및 말단 장기 손상에 대한 조사를 복잡하게 만듭니다. HTN과 관련된 말단 장기 손상의 병태생리학에 대한 다양하고 새로운 연구 접근이 필요합니다.

CVD의 초기 병리학적 징후 중 하나는 내피 기능 장애로, 산화질소(NO) 매개 혈관 확장 장애를 특징으로 한다 ^3,4,5. 유동 매개 확장은 CVD와 관련된 내피 기능 장애를 정량화하는 데 사용되는 일반적인 접근법이지만, 미세혈관 침대의 내피 기능 장애는 큰 도관 동맥의 기능 장애와 무관하거나 전조일 수 있습니다 ^6,7,8. 더욱이, 저항성 세동맥은 도관 동맥보다 국소 조직에 의해 더 직접적으로 작용하며, 산소가 풍부한 혈액의 전달을 더 즉각적으로 통제할 수 있습니다. 미세혈관 기능은 심혈관 무사건 생존율(9,10,11)을 예측한다. 피부 미세혈관은 생리학적 및 약리학적 혈관 수축 또는 혈관 확장 자극에 대한 반응을 검사하는 데 사용할 수 있는 접근 가능한 혈관 침대입니다. 피내 미세투석은 최소 침습 기술로, 표적 약리학적 해부를 통해 피부 미세혈관에서 혈관 평활근과 내피 기능의 메커니즘을 조사하는 것이 목표입니다. 이 방법은 약리학적 해부를 허용하지 않는 폐색 후 반응성 충혈 및 약리학적 전달을 허용하지만 작용 기전이 덜 정확한 이온토포레시스와 같은 다른 기술과 대조된다(다른 곳에서 자세히 검토됨¹²).

이 기술의 개발 및 사용에 대한 이론적 근거는 다른 곳에서 광범위하게 검토됩니다¹³. 이 접근법은 원래 설치류의 신경학 연구에 사용하기 위해 개발되었으며 체온 조절 관점에서 활성 혈관 확장의 기저를 조사하기 위해 인간에게 처음 적용되었습니다. 1990년대 후반에 이 방법은 피부의 국소 가열과 관련하여 신경 및 내피 메커니즘을 모두 검사하는 데 사용되었습니다. 그 이후로 이 기술은 피부의 여러 신경 혈관 신호 메커니즘을 조사하는 데 활용되었습니다.

이 기술을 사용하여 우리 연구팀과 다른 연구자들은 이상지질혈증, 원발성 노화, 당뇨병, 만성 신장 질환, 다낭성 난소 증후군, 자간전증, 주요 우울 장애 14,15,16,17,18,19 및 고혈압^20,21을 포함하되 이에 국한되지 않는 여러 임상 집단의 미세혈관에서 내피 기능 장애의 메커니즘을 조사했습니다 ^,22,23,24입니다. 예를 들어, 이전 연구에서는 CVD의 위험이 높은 자간전증 병력이 있는 정상 혈압 여성이 정상 혈압 임신 이력이 있는 여성에 비해 피부 순환계에서 NO-매개 혈관 확장이 감소한 것으로 나타났다²⁰. 또 다른 연구에서는 원발성 HTN 진단을 받은 성인이 건강한 대조군에 비해 미세혈관에서 안지오텐신 II 감수성이 증가한 것으로 나타났으며²¹ 원발성 HTN 환자에서 만성 설프하이드릴 기증 항고혈압 약물 요법은 혈압을 낮추고 황화수소 및 NO 매개 혈관 확장을 모두 개선하는 것으로 나타났다²². Wong 등[²³]은 2017년 미국심장협회(American Heart Association) 및 미국심장학회(American College of Cardiology) 가이드라인²⁴에서 분류한 바와 같이 HTN 병기 증가와 함께 내피 기능 장애가 진행된다는 연구 결과와 일치하는 고혈압 전단계 성인의 감각 매개 혈관 확장 장애 및 NO 매개 혈관 확장 장애를 발견했습니다.

피내 미세투석 기술을 사용하면 건강 및 질병 상태의 미세혈관 기능에 대한 엄격하게 제어되는 기계론적 조사가 가능합니다. 따라서 본 논문은 본 연구진과 다른 연구자들이 적용하고 있는 피내 미세투석 기법을 기술하고자 한다. 용량-반응 관계를 조사하기 위해 아세틸콜린(ACh)을 사용한 내피의 약리학적 자극과 39°C 또는 42°C 국소 가열 자극 프로토콜을 사용한 내인성 NO 생성의 생리학적 자극에 대한 절차를 자세히 설명합니다. 각 접근법에 대한 대표적인 결과를 제시하고 이 기법에서 도출된 결과의 임상적 의미에 대해 논의합니다.

프로토콜

모든 절차는 참가자 모집 전에 펜실베니아 주립 대학의 기관 검토 위원회의 승인을 받습니다.

1. 장비 설정

1. 국부 가열 장치와 레이저 도플러 유량계를 켭니다.
   알림: 둘 다 제조업체의 지침에 따라 데이터를 수집하기 전에 보정해야 합니다. 레이저 도플러 유량계는 100 Hz (100 샘플/분)에서 샘플링하고 데이터 수집 소프트웨어에서 연속 기록을 통해 데이터 수집 하드웨어에 연결해야 합니다. 다른 데이터 수집 하드웨어 및 소프트웨어를 사용할 수 있지만, 단순화를 위해 나머지 지침은 PowerLab 하드웨어 및 LabChart 소프트웨어 기능을 반영합니다.
2. LabChart 소프트웨어 파일을 엽니다.
   알림: 원하는 데이터 입력 및 지속적인 데이터 수집 기능이 있는 참조 파일을 미리 만들어야 합니다. 각 레이저 도플러 및 각 미세 투석 부위에 해당하는 로컬 히터에 대해 하나의 패널이 있어야 하며, 패널은 데이터 수집 하드웨어 장치의 적절한 채널 입력에 해당해야 합니다.

2. 미세 투석 섬유 배치

1. 팔뚝의 복부 측면에 있는 피부의 크고 눈에 띄는 혈관을 식별하고 영구적인 마커로 표시합니다(필요한 경우 지혈대를 사용하여 혈관을 시각화합니다. 어두운 색소가 있는 피부에서 혈관을 식별하려면 촉진에 더 많이 의존해야 할 수 있음).
2. 베타딘 면봉을 사용하여 자국을 둘러싸고 있는 부분과 주변 영역의 넉넉한 부분을 면봉으로 닦습니다. 알코올 면봉으로 베타딘을 닦아냅니다. 멸균된 피부 부위를 멸균 드레이프로 덮고 얼음을 ~5분 동안 발라 해당 부위를 마비시킵니다.
3. 얼음을 제거하고 유도 바늘 (23G, 길이 25mm)을 위쪽을 향한 경사로 2-3mm 깊이의 피부 진피층에 삽입합니다 (개별 피부 두께에 따라 다름). 진피층에 남아 있도록 주의하면서 바늘을 전진시키고 삽입 지점에서 ~20mm 피부를 빠져나갑니다.
   알림: 피부의 적절한 위치 깊이를 확인하려면 바늘 모양이 보이고 쉽게 만져질 수 있어야 하지만 바늘의 색상은 숨겨야 합니다. 실험에 두 개 이상의 미세투석 프로브가 필요한 경우 미세투석 프로브를 삽입하기 전에 두 개의 유도 바늘을 ≥2.5cm 간격으로 배치해야 합니다. 프로브는 동일한 주요 선박을 따라 배치해서는 안 됩니다.
4. 바늘을 제자리에 두고 프로브(Luer 잠금 장치를 통해 )를 젖산 링거 용액이 들어 있는 주사기에 연결합니다. 프로브의 반투과성 멤브레인이 유도 바늘의 입구 근처에 있지만 여전히 바깥쪽에 있을 때까지 유도기 바늘을 통해 프로브의 반대쪽 끝을 공급합니다. 용액이 멤브레인의 기공을 통해 눈에 띄게 관류될 때까지 섬유를 통해 소량의 링거 용액을 천천히 관류하여 멤브레인의 무결성을 확인합니다.
5. Harvard Bioscience 미세 투석 프로브와 유도 바늘을 사용하는 경우 2.5.1-2.5.2단계를 따르십시오.
   1. 프로브 기능이 확인되면 멤브레인이 유도 바늘 내 피부의 진피층에 완전히 포함될 때까지 유도 바늘을 통해 프로브를 추가로 공급합니다.
   2. 손가락을 사용하여 바늘에 근접한 위치에 프로브를 고정하고 삽입 반대 방향으로 바늘을 빼냅니다. 실험 중 반투과성 막의 변위를 방지하기 위해 섬유의 외부 부분을 피부에 테이프로 붙입니다.
6. Bioanalytical Systems 미세 투석 프로브와 유도 바늘을 사용하는 경우 2.6.1-2.6.2 단계를 따르십시오.
   1. 프로브 기능이 확인되면 도입 바늘의 허브와 미세 투석 프로브의 말단 부분을 한 손으로 잡고 동시에 바늘을 삽입 방향과 반대 방향으로 당겨 미세 투석 프로브를 제자리로 이동합니다.
   2. 반투과성 멤브레인이 피부에 완전히 묻히도록 필요에 따라 프로브를 조정합니다. 실험 중 반투과성 멤브레인의 변위를 방지하기 위해 외부 섬유를 피부에 테이프로 붙입니다.

3. 충혈

1. 바늘 삽입에 대한 충혈 반응이 가라앉을 때까지 기다리는 동안(~60-90분) 일회용 주사기를 미세주입 펌프의 주사기 홀더 트레이에 넣습니다. 충혈 단계에서 수유 링거 용액, 식염수 또는 차량 용액(실험 약리학적 제제가 용해된 용액, 2μL/분)을 관류했습니다.
   알림: 이 ~60-90분 단계에서는 미세 투석 프로브를 제거할 수 없지만 참가자는 신체 위치를 조정하거나 손을 움직이거나 프로브의 루어 잠금 장치를 주사기에서 제거하고 참가자의 팔에 테이프로 고정하여 자유롭게 움직일 수 있습니다. 국부 히터 및 레이저 도플러 유량계(LDF) 프로브로 계측하고 데이터 수집이 시작되면 LDF 프로브를 이동할 수 없습니다.
2. 바늘 외상에 대한 충혈 반응의 지표인 피부 발적이 가라앉으면 프로브 접착 디스크를 통해 반투과성 멤브레인을 덮고 있는 피부에 국소 가열 장치를 부착하여 히터의 중심이 미세 투석 프로브의 경로와 정렬되도록 합니다.
3. LDF 프로브를 국부 히터 중앙의 구멍에 놓아 레이저가 피부 표면에 직접 수직이 되도록 합니다. LDF 프로브를 배치하고 고정한 후 데이터 수집 소프트웨어에서 시작 을 클릭하여 적혈구 플럭스 값(RBC 플럭스, 관류 단위, PU)을 지속적으로 기록하고 표시합니다. 충혈이 완전히 가라앉으면 RBC 플럭스는 ~5-20 PU에서 안정적입니다(LDF 프로브 아래 혈관의 맥박성은 심장 박동과 일치하는 PU의 약간의 상승에 의해 반사될 수 있음).
4. 기구를 사용하지 않은 피험자의 팔에 자동 혈압 커프를 놓습니다.
5. 국부 히터를 33°C로 설정하여 피부 온도를 열중성 범위²⁵ 이내로 설정하여 열 자극의 영향 변화를 제거합니다. 실험의 이벤트를 나타내기 위해 데이터 수집 소프트웨어의 연속 기록에 주석을 추가하려면 화면 오른쪽 상단 모서리에 있는 텍스트 상자를 클릭하고 주석을 입력하고 주석을 수신할 채널을 선택한 다음 추가를 클릭합니다.

4. 아세틸콜린 용량-반응 프로토콜

1. RBC 플럭스가 33°C의 국부 열에 반응하여 안정화되면 데이터 수집 소프트웨어 파일에서 코멘트 begin baseline으로 구분되는 기준선 데이터 수집을 시작합니다. 데이터 분석을 위해서는 최소 5-10분의 안정적인 기준이 필요합니다. 필요한 경우 데이터 수집의 이 시점 동안 언제든지 기준선을 다시 시작하고 LabChart 파일에 표시합니다. 기준선의 마지막 순간에 혈압 측정값을 수집하고 LabChart 파일의 주석에 값을 입력합니다.
2. 5-10분의 기준선 데이터 수집이 끝나면 기준선 혈압을 측정 및 기록하고 데이터 수집 소프트웨어에 코멘트 종료 기준선을 입력합니다.
3. 마이크로 주입 펌프를 끄고 젖산 링거 용액으로 가득 찬 주사기를 가장 낮은 농도의 ACh(^10-10M )로 채워진 주사기로 교체합니다.
4. 새 주사기를 제자리에 고정하고 마이크로 주입 펌프를 다시 켜기 전에 프로브 끝을 통해 유체의 관류를 확인합니다. 데이터 수집 소프트웨어 기록에 begin -10 주석을 입력합니다.
5. ACh의 각 농도는 2μL/min에서 5-10분 동안 관류됩니다. 관류의 마지막 순간에 모든 농도에 대해 혈압을 측정하고 기록합니다. 주어진 농도에 대한 관류 시간이 끝나면 4.2-4.4단계에 설명된 대로 주사기를 다음으로 높은 농도로 교체합니다(예: 10^−10M ACh 용액을 10^−9M ACh 용액으로 교체).
6. ACh(10^−1M )의 최종 농도를 관류한 직후 ACh 주사기를 링거 용액이 포함된 주사기로 교체하고 국부 히터 온도를 43°C로 높입니다. 적혈구 플럭스가 안정화되면 링거 용액을 니트로프러스사이드 나트륨(28mM)으로 대체하여 열 유도 및 약리학적으로 유도된 최대 국소 혈관 확장을 생성합니다. 이 최대 혈관 확장 단계 동안 ~3분마다 혈압을 측정하고 기록합니다.
7. 최대 RBC 플럭스 정체기가 발생하면(~5분 안정 PU) 실험을 종료합니다. 데이터 수집 소프트웨어의 오른쪽 하단 모서리에 있는 중지 를 선택하여 연속 데이터 수집을 종료합니다.

5. 지역 난방 프로토콜

1. 충혈 후 적혈구 플럭스가 안정화되면 기준선 데이터 수집을 시작하고 데이터 수집 소프트웨어 파일에 주석과 함께 이를 표시합니다. 기준선의 마지막 순간에 혈압 측정값을 수집하고 데이터 수집 소프트웨어 파일에 주석의 값을 입력합니다.
2. 프로토콜의 요구 사항에 따라 로컬 히터를 39°C 또는 42°C로 늘립니다(토론 섹션에서 설명).
3. RBC 플럭스가 국소 열 적용(~40-60분 가열)에 반응하여 안정되면 미세 투석 프로브를 통해 N^G-니트로-l-아르기닌 메틸 에스테르(L-NAME, 링거 용액에 용해 15mM, 2μL/분, NO 합성 효소 억제제)를 관류합니다.
4. L-NAME에 대한 반응으로 RBC 플럭스가 안정되면(~15-25분의 관류) 국부 히터를 43°C로 높입니다.
5. RBC 플럭스가 43°C에 반응하여 안정되면(~20-45분 가열 후 ~2-5분 정체가 발생함) 미세 투석 프로브를 통해 니트로프러스사이드 나트륨(링거 용액에 용해된 28mM)을 관류합니다.
6. 최대 RBC 플럭스 정체기가 발생하면(~5분 안정 PU) 실험을 종료합니다. 데이터 수집 소프트웨어의 오른쪽 하단에 있는 중지 를 선택하여 데이터 수집을 종료합니다.

6. 미세 투석 프로브 제거

1. 실험이 종료된 후 수술용 가위를 사용하여 미세 투석 프로브를 자릅니다. 히터에서 LDF 프로브를 조심스럽게 제거하고 피부에서 히터를 제거합니다. 프로브를 피부에 고정하고 있는 테이프를 부드럽게 제거합니다.
2. 프로브의 양쪽에 있는 어떤 천공 부위가 가장 작은 혈전을 형성했는지 육안으로 식별합니다. 더 작은 응고가 있는 부위 근처의 프로브 부분을 자르고 피부 외부의 프로브 ~1인치를 절단하지 않고 남겨둡니다.
3. 알코올 면봉으로 프로브의 입구 및 출구 부위를 둘러싼 피부 부분과 응고가 덜한 부위에 남아 있는 ~1 길이의 프로브를 청소합니다.
4. 알코올이 피부에서 건조되도록 하십시오. 그런 다음 구멍이 뚫린 부위에서 더 큰 응고가 있는 프로브 부분, 덜 응고된 끝의 ~1인치 부분 반대쪽을 잡습니다. 프로브를 더 큰 혈전 쪽으로 천천히 당깁니다.
5. 프로브 제거로 인한 출혈 위에 멸균 거즈를 놓고 압력을 가합니다.

결과

아세틸콜린 용량-반응 프로토콜

그림 1A 는 ACh 용량-반응 프로토콜을 자세히 설명하는 회로도를 보여줍니다. 그림 1B 는 시간 경과에 따른 한 피험자에 대한 표준화된 ACh 용량-반응 프로토콜의 RBC 플럭스 값(관류 단위, PU, 30초 평균)의 대표적인 추적을 보여줍니다. 그림 1C 는 ACh 용량-반응 프로토콜...

토론

피내 미세투석 기술은 인간 혈관 연구에서 다재다능한 도구입니다. 연구자는 응용 프로그램을 더욱 다양화하기 위해 프로토콜을 변경할 수 있습니다. 예를 들어, ACh 용량-반응 프로토콜을 설명하지만, 혈관 확장 단독보다는 혈관 수축 또는 혈관 운동 긴장도의 메커니즘에 대한 다른 연구에서는 노르에피네프린 또는 니트로프로스사이드 나트륨 용량-반응 접근법을 활용했습니다 26,27,28,29,30,31.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringes	BD Syringes	302100
Acetlycholine	United States Pharmacopeia	1424511	Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator
Alcohol swabs	Mckesson	191089
Baby Bee Syringe Drive	Bioanalytical Systems, Incorporated	MD-1001	In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized
CMA 30 Linear Microdialysis Probes	Harvard Apparatus	CMA8010460
Connex Spot Monitor	WelchAllyn	74CT-B	automated blood pressure monitor
Hive Syringe Pump Controller	Bioanalytical Systems, Incorporated	MD-1020	Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives
LabChart 8	AD Instruments		**PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions
Lactated Ringer's Solution	Avantor (VWR)	76313-478
Laser Doppler Blood FlowMeter	Moor Instruments	MoorVMS-LDF
Laser Doppler probe calibration kit	Moor Instruments	CAL
Laser Doppler VP12 probe	Moor Instruments	VP12
Linear Microdialysis Probes	Bioanalytical Systems, Inc.	MD-2000
NG-nitro-l-arginine methyl ester	Sigma Aldrich	483125-M	L-NAME
Povidone-iodine / betadine	Dynarex	1202
PowerLab C Data Acquisition Device	AD Instruments	PLC01	**
PowerLab C Instrument Interface	AD Instruments	PLCI1	**
Probe adhesive discs	Moor Instruments		attach local heating unit to skin
Skin Heater Controller	Moor Instruments	moorVMS-HEAT 1.3
Small heating probe	Moor Instruments	VHP2
Sterile drapes	Halyard	89731
Sterile gauze	Dukal Corporation	2085
Sterile surgical gloves	Esteem Cardinal Health	8856N	catalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium)
Surgical scissors	Cole-Parmer	UX-06287-26