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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La microdialisi intradermica è una tecnica minimamente invasiva utilizzata per studiare la funzione microvascolare in salute e malattia. Sia i protocolli dose-risposta che quelli di riscaldamento locale possono essere utilizzati per questa tecnica per esplorare i meccanismi di vasodilatazione e vasocostrizione nella circolazione cutanea.

Abstract

La vascolarizzazione cutanea è un tessuto accessibile che può essere utilizzato per valutare la funzione microvascolare nell'uomo. La microdialisi intradermica è una tecnica mini-invasiva utilizzata per studiare i meccanismi della muscolatura liscia vascolare e della funzione endoteliale nel circolo cutaneo. Questa tecnica consente la dissezione farmacologica della fisiopatologia della disfunzione endoteliale microvascolare come indicizzata dalla diminuzione della vasodilatazione mediata dall'ossido nitrico, un indicatore del rischio di sviluppo di malattie cardiovascolari. In questa tecnica, una sonda per microdialisi viene posizionata nello strato dermico della pelle e un'unità di riscaldamento locale con una sonda di flusso laser Doppler viene posizionata sopra la sonda per misurare il flusso di globuli rossi. La temperatura cutanea locale viene bloccata o stimolata con l'applicazione diretta di calore e gli agenti farmacologici vengono perfusi attraverso la sonda per stimolare o inibire le vie di segnalazione intracellulari al fine di indurre vasodilatazione o vasocostrizione o per interrogare meccanismi di interesse (cofattori, antiossidanti, ecc.). Viene quantificata la conduttanza vascolare cutanea e possono essere delineati i meccanismi di disfunzione endoteliale negli stati patologici.

Introduzione

Le malattie cardiovascolari (CVD) sono la principale causa di morte negli Stati Uniti1. L'ipertensione (HTN) è un fattore di rischio indipendente per ictus, malattia coronarica e insufficienza cardiaca e si stima che colpisca fino a ~ 50% della popolazione degli Stati Uniti2. L'HTN può svilupparsi come CVD indipendente (HTN primaria) o come risultato di un'altra condizione, come la malattia del rene policistico e/o disturbi endocrini (HTN secondario). L'ampiezza delle eziologie dell'HTN complica le indagini sui meccanismi sottostanti e sul danno d'organo terminale osservato con l'HTN. Sono necessari approcci di ricerca diversi e nuovi nella fisiopatologia del danno d'organo terminale associato all'HTN.

Uno dei primi segni patologici di CVD è la disfunzione endoteliale, caratterizzata da una compromissione della vasodilatazione mediata dall'ossido nitrico (NO) 3,4,5. La dilatazione flusso-mediata è un approccio comune utilizzato per quantificare la disfunzione endoteliale associata a CVD, ma la disfunzione endoteliale nei letti microvascolari può essere sia indipendente che precursore di quella delle grandi arterie del condotto 6,7,8. Inoltre, le arteriole di resistenza sono più direttamente influenzate dal tessuto locale rispetto alle arterie del condotto e hanno un controllo più immediato sulla consegna di sangue ricco di ossigeno. La funzione microvascolare è predittiva della sopravvivenza libera da eventi cardiovascolariavversi 9,10,11. La microvascolarizzazione cutanea è un letto vascolare accessibile che può essere utilizzato per esaminare le risposte a stimoli fisiologici e farmacologici vasocostrittori o vasodilatatori. La microdialisi intradermica è una tecnica mini-invasiva, il cui obiettivo è quello di indagare i meccanismi sia della muscolatura liscia vascolare che della funzione endoteliale nella microvascolarizzazione cutanea con dissezione farmacologica mirata. Questo metodo contrasta con altre tecniche, come l'iperemia reattiva post-occlusiva, che non consente la dissezione farmacologica, e la ionoforesi, che consente la veicolazione farmacologica ma è meno precisa nel suo meccanismo d'azione (esaminata in modo approfondito altrove12).

La logica alla base dello sviluppo e dell'uso di questa tecnica è ampiamente esaminata altrove13. Questo approccio è stato originariamente sviluppato per l'uso nella ricerca neurologica nei roditori e poi è stato applicato per la prima volta all'uomo per studiare i meccanismi alla base della vasodilatazione attiva da un punto di vista termoregolatorio. Alla fine degli anni '90, questo metodo è stato utilizzato per esaminare sia i meccanismi neurali che quelli endoteliali per quanto riguarda il riscaldamento locale della pelle. Da quel momento, la tecnica è stata utilizzata per studiare una serie di meccanismi di segnalazione neurovascolare nella pelle.

Utilizzando questa tecnica, il nostro gruppo e altri hanno interrogato i meccanismi della disfunzione endoteliale nella microvascolarizzazione di diverse popolazioni cliniche, tra cui, ma non solo, dislipidemia, invecchiamento primario, diabete, malattia renale cronica, sindrome dell'ovaio policistico, preeclampsia, disturbo depressivo maggiore 14,15,16,17,18,19 e ipertensione 20,21,22,23,24. Ad esempio, uno studio precedente ha rilevato che le donne normotese con una storia di preeclampsia, che sono a maggior rischio di CVD, avevano una riduzione della vasodilatazione NO-mediata nella circolazione cutanea rispetto alle donne con una storia di gravidanza normotesa20. In un altro studio, gli adulti con diagnosi di HTN primaria hanno dimostrato una maggiore sensibilità all'angiotensina II nella microvascolarizzazione rispetto ai controlli sani21 e la farmacoterapia antipertensiva cronica donatrice di sulfidrile nei pazienti HTN primari ha dimostrato di ridurre la pressione sanguigna e migliorare sia la vasodilatazione mediata da idrogeno solfuro che quella mediata da NO22. Wong et al.23 hanno riscontrato una compromissione della vasodilatazione mediata sensorialmente e NO-mediata negli adulti preipertesi, in coincidenza con la nostra scoperta di una progressione della disfunzione endoteliale con l'aumento degli stadi HTN, come classificato dalle linee guida 2017 dell'American Heart Association e dell'American College of Cardiology24.

La tecnica di microdialisi intradermica consente indagini meccanicistiche strettamente controllate sulla funzione microvascolare in condizioni di salute e malattia. Pertanto, questo articolo si propone di descrivere la tecnica di microdialisi intradermica applicata dal nostro gruppo e da altri. Descriviamo in dettaglio le procedure sia per la stimolazione farmacologica dell'endotelio con acetilcolina (ACh) per esaminare la relazione dose-risposta che per la stimolazione fisiologica della produzione endogena di NO con un protocollo di stimolo di riscaldamento locale a 39 °C o 42 °C. Presentiamo i risultati rappresentativi per ogni approccio e discutiamo le implicazioni cliniche dei risultati che sono emersi da questa tecnica.

Protocollo

Tutte le procedure sono approvate dall'Institutional Review Board della Pennsylvania State University prima del reclutamento dei partecipanti.

1. Configurazione dell'attrezzatura

  1. Accendere l'unità di riscaldamento locale e il misuratore di portata laser Doppler.
    NOTA: Entrambi devono essere calibrati prima della raccolta dei dati secondo le istruzioni del produttore. Il misuratore di portata laser Doppler deve essere collegato all'hardware di acquisizione dati con campionamento a 100 Hz (100 campioni/min) e registrazione continua in un software di acquisizione dati. Sebbene sia possibile utilizzare altro hardware e software per l'acquisizione dei dati, per semplicità, le istruzioni rimanenti riflettono le funzionalità dell'hardware PowerLab e del software LabChart.
  2. Aprire un file del software LabChart.
    NOTA: È necessario creare in anticipo un file di riferimento con l'immissione dei dati desiderata e le capacità di raccolta continua dei dati. Dovrebbe esserci un pannello per ogni laser Doppler e riscaldatore locale che corrisponde a ciascun sito di microdialisi e i pannelli dovrebbero corrispondere agli ingressi del canale appropriati nell'unità hardware di acquisizione dati.

2. Posizionamento delle fibre per microdialisi

  1. Identifica i vasi sanguigni grandi e visibili della pelle nell'aspetto ventrale dell'avambraccio e indicali con un pennarello indelebile (utilizzare un laccio emostatico per visualizzare i vasi, se necessario; identificare i vasi nella pelle pigmentata scura può richiedere un maggiore affidamento sulla palpazione).
  2. Tamponare l'area che comprende i segni e una generosa porzione dell'area circostante utilizzando tamponi betadine. Pulisci il betadine con tamponi imbevuti di alcol. Coprire l'area sterilizzata della pelle con un telo sterile e applicare del ghiaccio per ~5 minuti per intorpidire l'area.
  3. Rimuovere il ghiaccio e inserire un ago introduttore (23 G, lunghezza 25 mm), con lo smusso rivolto verso l'alto, nello strato dermico della pelle a una profondità di 2-3 mm (a seconda dello spessore della pelle). Far avanzare l'ago, facendo attenzione a rimanere nello strato dermico, ed uscire dalla pelle ~20 mm dal punto di inserimento.
    NOTA: Per confermare la corretta profondità di posizionamento nella pelle, la forma dell'ago deve essere visibile e facilmente palpabile, ma il colore dell'ago deve essere nascosto. Se per l'esperimento è necessaria più di una sonda per microdialisi, è necessario posizionare due aghi introduttori a ≥2,5 cm di distanza l'uno dall'altro e posizionarli prima dell'inserimento della sonda per microdialisi. Le sonde non devono essere posizionate lungo lo stesso recipiente principale.
  4. Lasciando l'ago in posizione, collegare la sonda (tramite il Luer lock) a una siringa contenente la soluzione di Ringer lattato. Far passare l'estremità opposta della sonda attraverso l'ago introduttore fino a quando la membrana semipermeabile della sonda non è vicina ma ancora al di fuori dell'apertura dell'ago introduttore. Perfondere lentamente una piccola quantità di soluzione di Ringer attraverso la fibra fino a quando la soluzione non è visibilmente perfusa attraverso i pori della membrana per confermare l'integrità della membrana.
  5. Se si utilizza una sonda per microdialisi e un ago introduttore di Harvard Bioscience, seguire i passaggi 2.5.1-2.5.2.
    1. Dopo aver confermato la funzione della sonda, alimentare ulteriormente la sonda attraverso l'ago introduttore fino a quando la membrana non è completamente contenuta nello strato dermico della pelle all'interno dell'ago introduttore.
    2. Usando un dito, fissare la sonda in posizione prossimale all'ago ed estrarre l'ago nella direzione opposta all'inserimento. Fissare la parte esterna della fibra sulla pelle per evitare lo spostamento della membrana semipermeabile durante l'esperimento.
  6. Se si utilizza una sonda per microdialisi Bioanalytical Systems e un ago introduttore, seguire i passaggi 2.6.1-2.6.2.
    1. Alla conferma della funzione della sonda, afferrare il mozzo dell'ago introduttore e la porzione distale della sonda per microdialisi in una mano e contemporaneamente estrarre l'ago nella direzione opposta alla direzione di inserimento, spostando la sonda per microdialisi in posizione.
    2. Regolare la sonda secondo necessità per assicurarsi che la membrana semipermeabile sia completamente sepolta nella pelle. Fissare la fibra esterna sulla pelle con del nastro adesivo per evitare lo spostamento della membrana semipermeabile durante l'esperimento.

3. Iperemia

  1. In attesa che la risposta iperemica all'inserimento dell'ago diminuisca (~60-90 min), posizionare la siringa monouso nel vassoio portasiringhe delle pompe per microinfusione. Perfuse la soluzione latta di Ringer, la soluzione salina o la soluzione veicolo (la soluzione in cui è disciolto l'agente farmacologico sperimentale; 2 μL/min) durante la fase di iperemia.
    NOTA: Mentre le sonde per microdialisi non possono essere rimosse durante questa fase di ~60-90 minuti, il partecipante può regolare la posizione del corpo o muovere la mano, oppure il blocco Luer della sonda può essere rimosso dalla siringa e fissato con nastro adesivo al braccio del partecipante per consentire loro di stare in piedi brevemente. Una volta strumentate con riscaldatori locali e sonde di flusso laser Doppler (LDF) e una volta iniziata la raccolta dei dati, le sonde LDF non possono essere spostate.
  2. Quando l'arrossamento della pelle, che è un indicatore della risposta iperemica al trauma dell'ago, si è attenuato, collegare l'unità di riscaldamento locale alla pelle che copre la membrana semipermeabile tramite il disco adesivo della sonda, assicurandosi che il centro del riscaldatore sia allineato con il percorso della sonda per microdialisi.
  3. Posizionare la sonda LDF nell'apertura al centro del riscaldatore locale in modo che il laser sia direttamente perpendicolare alla superficie della pelle. Una volta posizionate e fissate le sonde LDF, fare clic su start sul software di acquisizione dati per registrare e visualizzare continuamente i valori di flusso dei globuli rossi (flusso di globuli rossi; unità di perfusione, PU). Se l'iperemia si è completamente attenuata, il flusso dei globuli rossi sarà stabile a ~5-20 PU (la pulsatilità dei vasi al di sotto della sonda LDF può essere riflessa da lievi aumenti nell'UD che coincidono con i battiti cardiaci).
  4. Posizionare un bracciale automatico per la pressione sanguigna sul braccio di un soggetto che non è stato strumentato.
  5. Impostare i riscaldatori locali a 33 °C per bloccare la temperatura della pelle entro un intervallo termoneutro25, eliminando così qualsiasi variazione nell'influenza degli stimoli termici. Per aggiungere un commento alla registrazione continua nel software di acquisizione dati per indicare gli eventi dell'esperimento, fare clic sulla casella di testo nell'angolo in alto a destra dello schermo, digitare un commento, selezionare i canali che devono ricevere il commento e fare clic su Aggiungi.

4. Protocollo dose-risposta dell'acetilcolina

  1. Una volta che il flusso di globuli rossi si è stabilizzato in risposta al calore locale di 33 °C, iniziare la raccolta dei dati di base, distinti nel file del software di acquisizione dati da un commento di inizio linea di base. Per l'analisi dei dati è necessario almeno un minimo di 5-10 minuti di linea di base stabile; riavviare la linea di base in qualsiasi momento durante questo punto della raccolta dei dati, se necessario, e contrassegnarla nel file LabChart. Nell'ultimo minuto del basale, raccogliere una misurazione della pressione sanguigna e inserire i valori in un commento nel file LabChart.
  2. Alla fine dei 5-10 minuti di raccolta dei dati di base, misurare e registrare la pressione sanguigna basale e inserire la linea di base finale del commento nel software di acquisizione dati.
  3. Spegnere le pompe per microinfusione e sostituire le siringhe piene di soluzione di Ringer lattato con la siringa riempita con la concentrazione più bassa di ACh (10−10 M).
  4. Fissare le nuove siringhe in posizione e confermare la perfusione del fluido attraverso l'estremità della sonda prima di riaccendere le pompe per microinfusione. Inserire l'inizio del commento −10 nella registrazione del software di acquisizione dati.
  5. Ogni concentrazione di ACh sarà perfusa per 5-10 minuti a 2 μL/min. Nell'ultimo minuto di perfusione, per ogni concentrazione, misurare e registrare la pressione arteriosa. Una volta terminato il tempo di perfusione per una data concentrazione, sostituire la siringa con la successiva concentrazione più alta (ad esempio, la soluzione di 10−10 M ACh viene sostituita con una soluzione di 10−9 M ACh), come descritto nei passaggi 4.2-4.4.
  6. Immediatamente dopo aver perfuso la concentrazione finale di ACh (10−1 M), sostituire la siringa di ACh con una contenente la soluzione di Ringer e aumentare la temperatura del riscaldatore locale a 43 °C. Una volta che il flusso dei globuli rossi si è stabilizzato, sostituire la soluzione di Ringer con nitroprussiato di sodio (28 mM) per produrre una vasodilatazione locale massima indotta dal calore e farmacologicamente indotta. Misurare e registrare la pressione sanguigna ogni ~3 minuti durante questa fase di vasodilatazione massimale.
  7. Una volta che si è verificato un plateau di flusso massimo di globuli rossi (~5 min PU stabile), terminare l'esperimento. Selezionare Stop nell'angolo in basso a destra del software di acquisizione dati per terminare la raccolta continua dei dati.

5. Protocollo di riscaldamento locale

  1. Una volta che il flusso dei globuli rossi si è stabilizzato dopo l'iperemia, iniziare la raccolta dei dati di base e indicarlo nel file del software di acquisizione dati con un commento. Nell'ultimo minuto del basale, raccogliere una misurazione della pressione sanguigna e inserire i valori in un commento nel file del software di acquisizione dati.
  2. Aumentare i riscaldatori locali a 39 °C o 42 °C, a seconda delle esigenze del protocollo (spiegato nella sezione di discussione).
  3. Una volta che il flusso dei globuli rossi si è stabilizzato in risposta all'applicazione di calore locale (~40-60 min di riscaldamento), perfondere l'estere metilico di N G-nitro-l-arginina (L-NAME; 15 mM disciolti nella soluzione di Ringer; 2 μL/min; un inibitore della NO sintasi) attraverso le sonde di microdialisi.
  4. Una volta che il flusso di globuli rossi si è stabilizzato in risposta a L-NAME (~15-25 min di perfusione), aumentare i riscaldatori locali a 43 °C.
  5. Una volta che il flusso di globuli rossi si è stabilizzato in risposta a 43 °C (un plateau di ~2-5 minuti si verifica dopo ~20-45 minuti di riscaldamento), perfondere il nitroprussiato di sodio (28 mM disciolto nella soluzione di Ringer) attraverso la/e sonda/e di microdialisi.
  6. Una volta che si è verificato un plateau di flusso massimo di globuli rossi (~5 min PU stabile), terminare l'esperimento. Selezionare Stop nell'angolo in basso a destra del software di acquisizione dati per terminare la raccolta dei dati.

6. Rimozione delle sonde per microdialisi

  1. Al termine dell'esperimento, utilizzare un paio di forbici chirurgiche per tagliare le sonde di microdialisi. Rimuovere con cautela le sonde LDF dai riscaldatori e rimuovere i riscaldatori dalla pelle. Rimuovere delicatamente il nastro che tiene le sonde in posizione sulla pelle.
  2. Identificare visivamente quale sito di puntura su entrambi i lati della sonda ha formato il coagulo di sangue più piccolo. Tagliare la porzione della sonda vicino al sito con il coagulo più piccolo, lasciando ~ 1 pollice della sonda al di fuori della pelle non tagliata.
  3. Pulire la porzione di pelle che circonda i siti di ingresso e di uscita della sonda con un tampone imbevuto di alcol, nonché la lunghezza di ~1 della sonda lasciata sul sito meno coagulato.
  4. Lasciare asciugare l'alcol sulla pelle. Quindi, afferrare la porzione della sonda che si estende dal sito di puntura con il coagulo maggiore, opposto alla porzione ~1 sull'estremità meno coagulata. Tirare lentamente la sonda verso il coagulo di sangue più grande.
  5. Posizionare una garza sterile su eventuali emorragie derivanti dalla rimozione della sonda e applicare pressione.

Risultati

Protocollo dose-risposta dell'acetilcolina

La Figura 1A illustra uno schema che descrive in dettaglio il protocollo dose-risposta dell'ACh. La Figura 1B illustra i tracciati rappresentativi dei valori di flusso dei globuli rossi (unità di perfusione, PU; medie di 30 s) dal protocollo standardizzato di ACh dose-risposta per un soggetto nel tempo. La Figura 1C illustra un file di dati grez...

Discussione

La tecnica di microdialisi intradermica è uno strumento versatile nella ricerca vascolare umana. Gli investigatori possono modificare il protocollo per diversificarne ulteriormente le applicazioni. Ad esempio, descriviamo un protocollo dose-risposta ACh, ma altre indagini sui meccanismi di vasocostrizione o tono vasomotorio, piuttosto che sulla sola vasodilatazione, hanno utilizzato approcci dose-risposta alla noradrenalina o al nitroprussiato di sodio 26,27,28,29,30,31.

Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse e nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Nessuno.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringesBD Syringes302100
AcetlycholineUnited States Pharmacopeia1424511Pilot data collected in our lab indicate drying acetylcholine increases variability of CVC response; do not dry, store in desiccator
Alcohol swabsMckesson191089
Baby Bee Syringe DriveBioanalytical Systems, IncorporatedMD-1001In this study the optional 3-syringe bracket (catalg number MD-1002) was utilized
CMA 30 Linear Microdialysis ProbesHarvard ApparatusCMA8010460
Connex Spot MonitorWelchAllyn74CT-Bautomated blood pressure monitor
Hive Syringe Pump ControllerBioanalytical Systems, IncorporatedMD-1020Controls up to 4 Baby Bee Syringe Drives
LabChart 8AD Instruments**PowerLab hardware and LabChart software must be compatible versions
Lactated Ringer's SolutionAvantor (VWR)76313-478
Laser Doppler Blood FlowMeterMoor InstrumentsMoorVMS-LDF
Laser Doppler probe calibration kitMoor InstrumentsCAL
Laser Doppler VP12 probeMoor InstrumentsVP12
Linear Microdialysis ProbesBioanalytical Systems, Inc.MD-2000
NG-nitro-l-arginine methyl esterSigma Aldrich483125-ML-NAME
Povidone-iodine / betadineDynarex1202
PowerLab C Data Acquisition DeviceAD InstrumentsPLC01**
PowerLab C Instrument InterfaceAD InstrumentsPLCI1**
Probe adhesive discsMoor Instrumentsattach local heating unit to skin
Skin Heater ControllerMoor InstrumentsmoorVMS-HEAT 1.3
Small heating probeMoor InstrumentsVHP2
Sterile drapesHalyard89731
Sterile gauzeDukal Corporation2085
Sterile surgical glovesEsteem Cardinal Health8856Ncatalogue number followed by the initials of the glove size, then the letter "B" (e.g., 8856NMB for medium)
Surgical scissorsCole-ParmerUX-06287-26

Riferimenti

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