Operación de electroacupuntura a granel para ratones o ratas jóvenes

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la electroacupuntura (EA) eficiente y rápida en ratones o ratas jóvenes utilizando un soporte impreso tridimensional (3D). Esta técnica permite la operación simultánea en múltiples animales, ahorrando tiempo y aumentando la eficiencia experimental.

Resumen

La electroacupuntura (EA) se usa ampliamente para tratar diversas afecciones de salud. Sin embargo, el mecanismo subyacente del tratamiento con EA sigue sin estar claro, lo que dificulta su promoción. El estudio mecanicista requiere modelos de ratón o rata para abordar este problema. Sin embargo, estos animales no son obedientes al proceso experimental, que lleva mucho tiempo. Para resolver estos problemas, diseñamos un fijador de masa corporal de animales pequeños impreso en 3D para mejorar la eficiencia de los experimentos con animales de EA. Este video muestra en detalle cómo usar el fijador para realizar EA a granel en ratones o ratas jóvenes. Para la selección de los puntos de acupuntura, se eligieron la línea oblicua anterior del vértice temporal (cabeza MS6) y el punto Tianshu (vientre ST25) para verificar el efecto del dispositivo de fijación con el posicionamiento en decúbito prono y en decúbito supino. El uso del soporte para animales pequeños impreso en 3D permite inmovilizar y tratar simultáneamente a varios roedores, lo que reduce el tiempo y los recursos necesarios para el experimento. Esta técnica podría aplicarse a otros modelos animales mediante la impresión 3D de diferentes tamaños y podría utilizarse para diversas condiciones de fijación. El dispositivo es beneficioso para la promoción de la investigación científica experimental en EA.

Introducción

La terapia de electroacupuntura (EA) es un método único en el que se insertan agujas de acupuntura en el cuero cabelludo y se conectan a una máquina eléctrica para^{estimular puntos específicos}. A diferencia de la estimulación manual, la EA permite un mejor control de la estimulación mediante la estabilización de frecuencias y formas de onda específicas para lograr efectos terapéuticos óptimos². Según una encuesta, el 81,2% de las instituciones médicas en China utilizan la EA o acupuntura manual para tratar la parálisis cerebral, la neuralgia, la parálisis facial y otras afecciones. A pesar de su popularidad, aún se desconoce el mecanismo específico de eficacia de la EA, lo que ha dificultado su promoción y aplicación en el tratamiento rehabilitador de enfermedades neurológicas ^1,2,3. Se necesita más investigación para comprender completamente el mecanismo de la efectividad de la EA y promover su uso en el tratamiento de rehabilitación de enfermedades neurológicas.

A medida que la influencia de la acupuntura se expande en todo el mundo, muchos estudios ya han investigado los mecanismos de la EA realizados en modelos de roedores, como modelos de ratas o ratones ^1,2,3. A menudo se encuentran varios problemas en los experimentos con roedores de EA. La primera es cómo inmovilizar roedores sin anestesia, ya que la acupuntura realizada en sujetos despiertos refleja más la práctica clínica. Además, algunos experimentos requieren que los animales estén despiertos para observar los efectos del tratamiento ^2,3. Otro desafío es localizar con precisión los puntos de acupuntura en ratones o ratas que corresponden a los de los humanos. La localización precisa de los puntos de acupuntura en roedores experimentales está siendo estudiada actualmente por muchos estudiosos ^4,5. En este protocolo se seleccionaron MS6 y ST25, las cuales han sido claramente definidas en roedores por la transformación de la localización anatómica humana. La MS6 se usa comúnmente para el tratamiento de algunas enfermedades cerebrales, como la enfermedad de Parkinson⁶. ST25 se utiliza generalmente para tratar problemas gastrointestinales, como la diarrea⁷. Estos dos puntos de acupuntura se eligieron principalmente para demostrar cómo los roedores pueden inmovilizarse de manera efectiva tanto en decúbito supino como en decúbito prono. Además, estos puntos de acupuntura han sido ampliamente estudiados y ofrecen información significativa para fines de investigación ^6,7.

El método anterior de inmovilizar a una sola rata para experimentos no solo requiere mucho tiempo, sino que también es difícil de manejar por una sola persona⁸. Además, debido a la falta de cooperación de los animales, la tasa de éxito es relativamente baja en la práctica. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de crear un modelo animal fácilmente establecido con características estables para mejorar la eficiencia del experimento. En este artículo, se introdujo un soporte impreso en 3D para animales pequeños que podría inmovilizar fácilmente a varios roedores, lo que provocaría una restricción motora. El objetivo de este trabajo es administrar tratamientos de EA a un lote de ratas o ratones jóvenes, centrándose en las estrategias para la restricción masiva de ratones, la identificación y la estimulación de los puntos de acupuntura MS6 y ST25.

Protocolo

Los experimentos de este estudio cumplen con el principio de las "3R" de ética animal y han sido aprobados por el Comité Étnico y de Bienestar de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica del Ejército (AMUWEC20234543).

1. Preparación del dispositivo de fijación del cuerpo del roedor

1. Diseñe un soporte para animales pequeños basado en la patente de modelo de utilidad chino⁹.
2. Producir el dispositivo a través de la tecnología de impresión 3D.
3. Prepara una cuerda de 2 m de largo y divídela en 6 cuerdas. Pasa estas 6 cuerdas a través de los agujeros del fijador. Utilice la hebilla accionada por resorte para sujetar los extremos de la cuerda, lo que facilita el ajuste del tamaño del lazo.
   NOTA: El fijador puede ser fabricado por cualquier empresa equipada con tecnología de impresión 3D basada en un dibujo de diseño. El dibujo de diseño del dispositivo se muestra en la Figura 1. El fijador utilizado en este estudio fue producido por una impresora 3D mediante un método de impresión llamado modelado por deposición fundida (FDM), también conocido como fabricación de filamentos fundidos (FFF)¹⁰. Este método de fabricación aditiva imprime las partes del diseño capa por capa depositando selectivamente el material en la forma fundida en una ruta predeterminada. El proceso utiliza polímeros termoplásticos que vienen en filamentos para crear la estructura física final. El aparato de inmovilización utilizado en este estudio puede asegurar tres animales simultáneamente, lo que requiere seis cuerdas, y cada animal requiere un par de cuerdas: una para el cuello y otra para el tronco.

2. Preparación de roedores

1. Compra 3 ratas Sprague-Dawley (10-40 g, 7-45 días de edad) y 3 ratones C57 BL/C (5-40 g).
2. Cría animales en una habitación con un ciclo día/noche de 12 h, una temperatura ambiente de 21-23 °C y una humedad del 45%-60%. Desinfecte y ventile el entorno de alimentación con regularidad y permita que los animales coman y beban libremente.

3. Fijación de roedores al fijador (posición prona)

1. Coloque la cabeza del roedor en el orificio en forma de U frente al fijador, con el roedor en posición prona. Pasa el cuerpo del roedor a través de dos bucles de cuerda.
2. Sujete las cuerdas alrededor del cuello y el abdomen del roedor, asegurándose de que no pueda escapar, pero no tan apretadas como para causar dificultad respiratoria y la muerte.
   1. El paso clave es fijar el cuello en su lugar. Deja un espacio de 2-5 mm entre el cuello del roedor y la cuerda. Asegúrese de que la cuerda no esté demasiado apretada para que los animales se estrangulen o demasiado floja para escapar.
3. Fije los otros roedores de la misma manera en el dispositivo.
4. Repita los pasos de fijación anteriores (3.1-3.2) durante 3 días para minimizar la posible respuesta de estrés causada por el procedimiento de fijación. Repita el procedimiento de fijación durante 3 días consecutivos, con una duración de 5 minutos por día cada sesión.
   NOTA: Para asegurarnos de que los roedores no estuvieran sobrecargados durante el procedimiento de fijación, repetimos el procedimiento durante 3 días consecutivos. Cada sesión duró 5 minutos por día, lo que proporcionó tiempo suficiente para que los ratones o ratas se aclimataran al procedimiento y minimizaron cualquier posible molestia.
5. Strat EA desde el día 4.
6. Para evitar la propagación de enfermedades, sumerja un hisopo o una bola de algodón estéril en alcohol al 75% y limpie bien el soporte para limpiarlo y desinfectarlo antes y después de cada uso. Use guantes y otros equipos de protección para evitar posibles riesgos para la salud al manipular roedores.

4. Realización de EA en ratones o ratas jóvenes (MS6)

1. Elija agujas de acupuntura estériles desechables de 0,25 mm x 13 mm.
2. Encuentre los puntos de acupuntura por ubicación anatómica y confirme la profundidad de inserción en el punto de acupuntura.
   NOTA: MS6 se encuentra en el lado lateral de la cabeza. Esta región de la cabeza pasa a través de la conexión entre Shencong (Ex-hn1) y Xuanli (GB6), también conocida como parietal anterior (Du21). MS6 corresponde a la expresión de la circunvolución precentral de la corteza cerebral en el cuero cabelludo. Ex-hn1 se encuentra 0,5 cm detrás del punto medio de la línea media anteroposterior de la cabeza. GB6 se encuentra en el punto medio de la parte frontal de la oreja y en el ángulo final del ojo. En él se distribuyen el nervio supratroclear superior, el nervio supraorbitario, el nervio occipital y el nervio auriculotemporal. La MS6 se utiliza principalmente para tratar accidentes cerebrovasculares y encefalopatías, como trastornos motores.
3. Gire lentamente e inserte agujas estériles bilaterales en MS6 a una profundidad de 3/5 desde el Shenchong anterior (Exhn1) hasta el Xuanli (GB6) a lo largo del subcutáneo en 3 roedores, respectivamente.
4. Conecte un lado del cable de conexión al instrumento EA.
5. Conecte otro lado del cable de conexión que contiene los clips EA positivo y negativo a los vástagos de la aguja de acupuntura en el MS6 izquierdo y derecho.
6. Encienda el instrumento EA.
   1. Gire el botón (Función/Elegir interruptor) para ajustar la frecuencia y el modo de función.
   2. Establezca la frecuencia en 10 Hz y elija un modo de onda continua .
   3. Gire el botón correspondiente (Ajustar intensidad) para establecer la intensidad. Cada botón de ajuste de intensidad controla la intensidad de la corriente de los roedores del cable conectado debajo de él. Ajuste la intensidad de la corriente al rango aceptable de roedores, generalmente 1-2 mA, con una duración de 5 min.
      NOTA: Es importante monitorear la respiración y el comportamiento de los roedores durante el procedimiento para asegurarse de que no experimenten ninguna angustia o molestia. Si la rata parece estar luchando o sintiendo dolor, el procedimiento debe detenerse de inmediato.

5. Fijación de roedores al fijador (posición supina)

1. Coloque las cabezas del roedor en el orificio en forma de U frente al fijador, con el roedor en posición prona. Pasa el cuerpo del roedor a través de dos bucles de cuerda.
2. Sujete la cuerda alrededor del cuello y el abdomen del roedor, asegurándose de que no pueda escapar, pero no tan apretada como para causar dificultad respiratoria y la muerte.
   NOTA: Los puntos que deben anotarse durante la fijación son los mismos que en el paso 3.2.
3. Arregla a los otros roedores de la misma manera.
4. Al igual que en el paso 3.4, repita los pasos de fijación anteriores durante 3 días para reducir la respuesta al estrés de los roedores.
5. Strat EA desde el día 4.
   NOTA: La desinfección se realiza como se menciona en el paso 3.6.

6. Realización de EA (ST25)

1. Elija agujas de acupuntura estériles desechables de 0,25 mm x 13 mm.
2. Encuentre los puntos de acupuntura por ubicación anatómica y confirme la profundidad de inserción en el punto de acupuntura.
   NOTA: ST25 se encuentra a nivel del ombligo. Posicionar este punto en roedores requiere medir primero la longitud de la pata del roedor. ST25 se encuentra a 2/3 de la longitud de la pata junto al ombligo. Por ejemplo, si la pata medida del roedor es de 0,6 cm, entonces ST25 se encuentra a 0,4 cm a la derecha y a la izquierda del ombligo.
3. Gire y penetre lentamente las agujas estériles en ST25 bilateral a una profundidad de 4-8 mm en 3 roedores, respectivamente.
4. Conecte un lado del cable de conexión al instrumento EA.
5. Conecte otro lado del cable de conexión que contiene los clips EA positivo y negativo a los vástagos de la aguja de acupuntura en el ST25 izquierdo y derecho.
6. Encienda el instrumento EA.
   1. Gire el botón (Función/Elegir interruptor) para ajustar la frecuencia y el modo de función.
   2. Establezca la frecuencia en 10 Hz y elija el modo de onda continua.
   3. Gire el botón correspondiente (Ajustar intensidad) para establecer la intensidad. Cada botón de ajuste de intensidad controla la intensidad actual de la rata del cable conectado debajo de él. Ajuste la intensidad de la corriente al rango aceptable de roedores, generalmente 1-2 mA, con una duración de 5 min.
      NOTA: Las observaciones fueron las mismas que en el paso 4.6.

Resultados

El plano de planta del fijador corporal animal que diseñamos se muestra en la Figura 1. Además, se presentó un modelo gráfico en 3D de este fijador para proporcionar una visión completa del diseño (Archivo Suplementario 1). Se trata de un dispositivo que permite inmovilizar a 3 roedores y realizar EA simultáneamente. Las ratas y los ratones se restringieron al fijador en estado de vigilia, y tanto la posición prona como la supina pudieron fijarse firmemente sin causa...

Discusión

La electroacupuntura (EA) es una forma de acupuntura que implica el uso de estimulación eléctrica en agujas de acupuntura¹¹. Esta técnica implica el uso de corrientes de micropulso de intensidad y frecuencia específicas para estimular los puntos de acupuntura y lograr efectos terapéuticos mejorados³. Sin embargo, el mecanismo de la EA para la curación es limitado y requiere una amplia investigación básica para probar ^1,2,3

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printing batch mice fixator	MESH INVENT	Custom made	The fixator produced by 3D printer. The printing method is called fused deposition modeling (FDM), also known as fused filament fabrication (FFF).
Electroacupuncture instrument	Hwato, Suzhou Medical Appliance Factory	SDZ-III	www.Hwato-med.com
Disposable sterile acupuncture needle	Suzhou Medical Appliance Factory	N/A	0.25 mm x 13 mm