Массовая электроакупунктурная операция для мышей или молодых крыс

Резюме

Здесь мы представляем протокол эффективной и быстрой электроакупунктуры (ЭА) на мышах или молодых крысах с использованием трехмерного (3D) напечатанного держателя. Этот метод позволяет одновременно работать на нескольких животных, экономя время и повышая эффективность эксперимента.

Аннотация

Электроакупунктура (ЭА) широко используется для лечения различных заболеваний. Однако основной механизм лечения ЭА остается неясным, что препятствует его продвижению. Механистическое исследование требует использования мышей или крыс для решения этой проблемы. Однако эти животные не послушны экспериментальному процессу, который отнимает много времени. Чтобы решить эти проблемы, мы разработали напечатанный на 3D-принтере фиксатор объема тела мелких животных, чтобы повысить эффективность экспериментов EA на животных. В этом видео подробно показано, как использовать фиксатор для выполнения объемного ЭА на мышах или молодых крысах. Для выбора акупунктурных точек была выбрана передняя косая линия вершины височной (голова MS6) и точка Тяньшу (живот ST25) для проверки эффекта фиксирующего устройства при положении лежа на животе и положении лежа на спине. Использование напечатанного на 3D-принтере держателя для мелких животных позволяет обездвиживать и обрабатывать несколько грызунов одновременно, сокращая время и ресурсы, необходимые для эксперимента. Эта техника может быть применена к другим моделям животных путем 3D-печати различных размеров и потенциально может быть использована для различных условий фиксации. Прибор полезен для продвижения экспериментальных научных исследований в ЭА.

Введение

Электроакупунктурная терапия (ЭА) – это уникальный метод, при котором акупунктурные иглы вводятся в кожу головы и подключаются к электроаппарату для стимуляции определенных точек¹. В отличие от мануальной стимуляции, ЭА позволяет лучше контролировать стимуляцию, стабилизируя определенные частоты и формы волны для достижения оптимального терапевтического эффекта². Согласно опросу, 81,2% медицинских учреждений в Китае используют ЭА или мануальную акупунктуру для лечения ДЦП, невралгии, паралича лицевого нерва и других состояний. Несмотря на свою популярность, специфический механизм эффективности ЭА до сих пор неизвестен, что препятствует ее продвижению и применению в восстановительном лечении неврологических заболеваний ^1,2,3. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы полностью понять механизм эффективности ЭА и способствовать ее использованию в реабилитационном лечении неврологических заболеваний.

По мере того, как влияние иглоукалывания расширяется во всем мире, во многих исследованиях уже изучались механизмы ЭА, выполняемые на моделях грызунов, таких как крысы или мышь ^1,2,3. В экспериментах EA на грызунах часто встречаются некоторые проблемы. Во-первых, как обездвижить грызунов без анестезии, так как иглоукалывание, проводимое на бодрствующих субъектах, больше отражает клиническую практику. Кроме того, некоторые эксперименты требуют, чтобы животные бодрствовали, чтобы наблюдать эффекты лечения ^2,3. Еще одной проблемой является точное определение акупунктурных точек у мышей или крыс, которые соответствуют акупунктурным точкам у людей. Точная локализация акупунктурных точек у подопытных грызунов в настоящее время изучается многими учеными ^4,5. В этом протоколе были выбраны MS6 и ST25, которые были четко определены у грызунов трансформацией анатомической локализации человека. MS6 обычно используется для лечения некоторых заболеваний головного мозга, таких как болезнь Паркинсона⁶. ST25 обычно используется для лечения желудочно-кишечных проблем, таких как диарея⁷. Эти две акупунктурные точки были выбраны в первую очередь для того, чтобы продемонстрировать, как грызуны могут быть эффективно обездвижены как в лежачем положении, так и в положении лежа. Более того, эти акупунктурные точки были тщательно изучены и дают важную информацию для исследовательских целей ^6,7.

Предыдущий метод обездвиживания одной крысы для экспериментов не только отнимал много времени, но и был труден для выполнения^{одним человеком.} Кроме того, из-за отказа животных от сотрудничества вероятность успеха на практике относительно низкая. Поэтому существует острая необходимость в создании легко устанавливаемой животной модели со стабильными характеристиками для повышения эффективности эксперимента. В этой статье был представлен напечатанный на 3D-принтере держатель для мелких животных, который может легко обездвиживать нескольких грызунов, что приводит к ограничению движений. Целью данной работы является введение ЭА-терапии группе молодых крыс или мышей, уделяя особое внимание стратегиям массового ограничения мышей, идентификации и стимуляции акупунктурных точек MS6 и ST25.

протокол

Эксперименты в этом исследовании соответствуют принципу этики животных «3R» и были одобрены Комитетом по благополучию лабораторных животных и этнической принадлежности Армейского медицинского университета (AMUWEC20234543).

1. Подготовка устройства фиксации тела грызуна

1. Разработка держателя для мелких животных на основе китайского патента на полезную модель⁹.
2. Изготовьте устройство с помощью технологии 3D-печати.
3. Подготовьте веревку длиной 2 м и разделите ее на 6 веревок. Проденьте эти 6 веревок через отверстия в фиксаторе. Используйте подпружиненную пряжку для закрепления концов веревки, облегчая регулировку размера петли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксатор может быть изготовлен любой компанией, оснащенной технологией 3D-печати на основе конструкторского чертежа. Конструктивный чертеж устройства показан на рисунке 1. Фиксатор, использованный в этом исследовании, был изготовлен на 3D-принтере методом печати, называемым моделированием методом наплавления (FDM), также известным как изготовление плавленого филамента (FFF)¹⁰. Этот метод аддитивного производства печатает детали дизайна слой за слоем, выборочно осаждая материал в расплавленном виде по заданной траектории. В процессе используются термопластичные полимеры, которые поставляются в виде нитей для создания окончательной физической структуры. Аппарат для иммобилизации, использованный в этом исследовании, может зафиксировать трех животных одновременно, требуя шести веревок, при этом для каждого животного требуется пара веревок: одна для шеи и одна для туловища.

2. Подготовка от грызунов

1. Приобретите 3 крысы Sprague-Dawley (10-40 г, 7-45 дней) и 3 мыши C57 BL/C (5-40 г).
2. Разводят животных в помещении со сменой дня и ночи 12 часов, температурой окружающей среды 21-23 °C и влажностью 45%-60%. Регулярно дезинфицируйте и проветривайте кормовую среду, а также позволяйте животным свободно есть и пить.

3. Фиксация грызунов к фиксатору (положение лежа)

1. Поместите голову грызуна в U-образное отверстие перед фиксатором, при этом грызун находится в положении лежа. Пропустите тело грызуна через две веревочные петли.
2. Закрепите веревки вокруг шеи и брюшка грызуна, следя за тем, чтобы он не мог вырваться, но не настолько туго, чтобы вызвать дыхательную недостаточность и смерть.
   1. Ключевым этапом является фиксация шеи на месте. Оставьте зазор 2-5 мм между шеей грызуна и веревкой. Убедитесь, что веревка не слишком тугая, чтобы животные не задушились, и не слишком свободная, чтобы убежать.
3. Таким же образом зафиксируйте в устройстве остальных грызунов.
4. Повторяйте описанные выше шаги фиксации (3.1-3.2) в течение 3 дней, чтобы свести к минимуму потенциальную реакцию на стресс, вызванную процедурой фиксации. Повторяйте процедуру фиксации в течение 3 дней подряд, при этом каждый сеанс длится 5 минут в день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы грызуны не испытывали перенапряжения во время процедуры фиксации, мы повторяли процедуру в течение 3 дней подряд. Каждый сеанс длился 5 минут в день, предоставляя мышам или крысам достаточно времени, чтобы привыкнуть к процедуре и сводя к минимуму любой потенциальный дискомфорт.
5. Strat EA с 4-го дня.
6. Чтобы предотвратить распространение болезни, погрузите стерильный ватный тампон или шарик в 75% спирт и тщательно протрите держатель, чтобы очистить и продезинфицировать его до и после каждого использования. Используйте перчатки и другие средства защиты, чтобы избежать потенциальных рисков для здоровья при контакте с грызунами.

4. Выполнение ЭА на мышах или молодых крысах (MS6)

1. Выбирайте одноразовые стерильные иглы для акупунктуры размером 0,25 мм х 13 мм.
2. Найдите акупунктурные точки по анатомическому расположению и подтвердите глубину введения в акупунктурной точке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: MS6 расположен на боковой стороне головы. Эта область в голове проходит через соединение между Shencong (Ex-hn1) и Xuanli (GB6), также известное как передняя теменная (Du21). MS6 соответствует экспрессии прецентральной извилины коры головного мозга на волосистой части головы. Ex-hn1 расположен на 0,5 см позади средней точки передне-задней срединной линии головы. GB6 расположен в средней точке передней части уха и в конце угла глаза. В ней распределены верхний надблоковый нерв, надглазничный нерв, затылочный нерв и ушно-височный нерв. MS6 в основном используется для лечения инсульта и энцефалопатии, таких как двигательные расстройства.
3. Медленно скручивают и вводят стерильные иглы двусторонними в MS6 на глубину 3/5 от переднего шэньчуна (Exhn1) до сюаньли (GB6) вдоль подкожной клетчатки у 3 грызунов соответственно.
4. Подсоедините одну сторону соединительного кабеля к прибору EA.
5. Подсоедините другую сторону соединительного кабеля, содержащего положительный и отрицательный зажимы EA, к хвостовикам акупунктурной иглы слева и справа MS6.
6. Включите инструмент советника.
   1. Поверните кнопку (Функция/ Выберите переключатель), чтобы установить частоту и режим работы.
   2. Установите Частоту на 10 Гц и выберите режим Непрерывная волна .
   3. Поверните соответствующую кнопку (Adjust Intensity), чтобы установить интенсивность. Каждая кнопка регулировки интенсивности контролирует силу тока грызунов подключенного под ней провода. Отрегулируйте интенсивность тока до допустимого диапазона грызунов, обычно 1-2 мА, продолжительностью 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно следить за дыханием и поведением грызунов во время процедуры, чтобы убедиться, что они не испытывают никаких страданий или дискомфорта. Если крыса борется или испытывает боль, процедуру следует немедленно прекратить.

5. Фиксация грызунов к фиксатору (положение лежа на спине)

1. Поместите головы грызуна в U-образное отверстие перед фиксатором, при этом грызун находится в положении лежа. Пропустите тело грызуна через две веревочные петли.
2. Закрепите веревку вокруг шеи и брюшка грызуна, следя за тем, чтобы он не мог вырваться, но не настолько туго, чтобы вызвать дыхательную недостаточность и смерть.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Точки, которые необходимо отметить во время фиксации, такие же, как и в шаге 3.2.
3. Таким же образом зафиксируйте и других грызунов.
4. Как и в шаге 3.4, повторяйте описанные выше шаги фиксации в течение 3 дней, чтобы снизить стрессовую реакцию грызунов.
5. Strat EA с 4-го дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дезинфекция выполняется, как указано в шаге 3.6.

6. Работающий советник (ST25)

1. Выбирайте одноразовые стерильные иглы для акупунктуры размером 0,25 мм х 13 мм.
2. Найдите акупунктурные точки по анатомическому расположению и подтвердите глубину введения в акупунктурной точке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ST25 расположен на уровне пупка. Чтобы определить эту точку у грызунов, необходимо сначала измерить длину лапы грызуна. ST25 расположен на 2/3 длины лапы рядом с пупком. Например, если измеренная лапа грызуна составляет 0,6 см, то ST25 располагается по 0,4 см справа и слева от пупка.
3. Медленно скручивают и проталкивают стерильные иглы в ST25 двустороннюю на глубину 4-8 мм на 3 грызуна соответственно.
4. Подсоедините одну сторону соединительного кабеля к прибору EA.
5. Подсоедините другую сторону соединительного кабеля, содержащего положительный и отрицательный зажимы EA, к хвостовикам акупунктурной иглы слева и справа ST25.
6. Включите инструмент советника.
   1. Поверните кнопку (Функция/ Выберите переключатель), чтобы установить частоту и режим работы.
   2. Установите частоту на 10 Гц и выберите режим непрерывной волны.
   3. Поверните соответствующую кнопку (Adjust Intensity), чтобы установить интенсивность. Каждая кнопка регулировки интенсивности управляет силой тока крысы провода, подключенного под ней. Отрегулируйте интенсивность тока до допустимого диапазона грызунов, обычно 1-2 мА, продолжительностью 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдения были такими же, как и на шаге 4.6.

Результаты

План этажа разработанного нами фиксатора тела животного показан на рисунке 1. Кроме того, была представлена 3D-графическая модель этого фиксатора для получения полного представления о конструкции (Дополнительный файл 1). Это устройство, которое позволяет обездв...

Обсуждение

Электроакупунктура (ЭА) - это форма иглоукалывания, которая включает в себя использование электрической стимуляции на акупунктурных иглах¹¹. Данная методика предполагает использование микроимпульсных токов определенной интенсивности и частоты для стимуляции акупунктур?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printing batch mice fixator	MESH INVENT	Custom made	The fixator produced by 3D printer. The printing method is called fused deposition modeling (FDM), also known as fused filament fabrication (FFF).
Electroacupuncture instrument	Hwato, Suzhou Medical Appliance Factory	SDZ-III	www.Hwato-med.com
Disposable sterile acupuncture needle	Suzhou Medical Appliance Factory	N/A	0.25 mm x 13 mm