Operazione di elettroagopuntura di massa per topi o ratti giovani

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per l'elettroagopuntura (EA) efficiente e rapida nei topi o nei ratti giovani utilizzando un supporto tridimensionale (3D) stampato. Questa tecnica consente di operare contemporaneamente su più animali, risparmiando tempo e aumentando l'efficienza sperimentale.

Abstract

L'elettroagopuntura (EA) è ampiamente utilizzata per trattare varie condizioni di salute. Tuttavia, il meccanismo alla base del trattamento con EA rimane poco chiaro, ostacolandone la promozione. Lo studio meccanicistico richiede modelli murini o di ratti per affrontare questo problema. Tuttavia, questi animali non obbediscono al processo sperimentale, che richiede molto tempo. Per risolvere questi problemi, abbiamo progettato un fissatore di massa per il corpo di piccoli animali stampato in 3D per migliorare l'efficienza degli esperimenti sugli animali di EA. Questo video mostra in dettaglio come utilizzare il fissatore per eseguire EA di massa su topi o ratti giovani. Per la selezione dei punti di agopuntura, sono state scelte la linea obliqua anteriore del vertice temporale (testa MS6) e il punto Tianshu (ventre ST25) per verificare l'effetto del dispositivo di fissazione con posizionamento prono e posizionamento supino. L'utilizzo del supporto per piccoli animali stampato in 3D consente di immobilizzare e trattare più roditori contemporaneamente, riducendo il tempo e le risorse necessarie per l'esperimento. Questa tecnica potrebbe essere applicata ad altri modelli animali stampando in 3D diverse dimensioni e potrebbe potenzialmente essere utilizzata per varie condizioni di fissaggio. Il dispositivo è utile per la promozione della ricerca scientifica sperimentale in EA.

Introduzione

La terapia con elettroagopuntura (EA) è un metodo unico in cui gli aghi per agopuntura vengono inseriti nel cuoio capelluto e collegati a un'elettromacchina per stimolare punti specifici¹. A differenza della stimolazione manuale, l'EA consente un migliore controllo della stimolazione stabilizzando frequenze e forme d'onda specifiche per ottenere effetti terapeutici ottimali². Secondo un sondaggio, l'81,2% delle istituzioni mediche in Cina utilizza l'EA o l'agopuntura manuale per trattare paralisi cerebrale, nevralgia, paralisi facciale e altre condizioni. Nonostante la sua popolarità, il meccanismo specifico di efficacia dell'EA è ancora sconosciuto, il che ha ostacolato la sua promozione e applicazione nel trattamento riabilitativo delle malattie neurologiche ^1,2,3. Sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere appieno il meccanismo di efficacia dell'EA e per promuoverne l'uso nel trattamento riabilitativo delle malattie neurologiche.

Mentre l'influenza dell'agopuntura si espande in tutto il mondo, molti studi hanno già indagato i meccanismi dell'EA eseguiti su modelli di roditori, come i modelli di ratto o topo ^1,2,3. Diversi problemi si riscontrano spesso negli esperimenti sui roditori di EA. Il primo è come immobilizzare i roditori senza anestesia, poiché l'agopuntura eseguita su soggetti svegli riflette maggiormente la pratica clinica. Inoltre, alcuni esperimenti richiedono che gli animali siano svegli per osservare gli effetti del trattamento ^2,3. Un'altra sfida è individuare con precisione i punti di agopuntura nei topi o nei ratti che corrispondono a quelli negli esseri umani. La localizzazione precisa dei punti di agopuntura nei roditori sperimentali è attualmente oggetto di studio da parte di molti studiosi ^4,5. In questo protocollo sono stati selezionati MS6 e ST25, che sono stati chiaramente definiti nei roditori dalla trasformazione della localizzazione anatomica umana. MS6 è comunemente usato per il trattamento di alcune malattie cerebrali, come il morbo di Parkinson⁶. ST25 è solitamente usato per trattare problemi gastrointestinali, come la diarrea⁷. Questi due agopunti sono stati scelti principalmente per dimostrare come i roditori possano essere efficacemente immobilizzati sia in posizione supina che prona. Inoltre, questi agopunti sono stati ampiamente studiati e offrono spunti significativi per scopi di ricerca ^6,7.

Il metodo precedente di immobilizzare un singolo ratto per gli esperimenti non è solo dispendioso in termini di tempo, ma anche difficile da gestire da parte di una sola persona⁸. Inoltre, a causa della mancata collaborazione degli animali, il tasso di successo è relativamente basso nella pratica. Pertanto, c'è una necessità critica di creare un modello animale facilmente stabilibile con caratteristiche stabili per migliorare l'efficienza dell'esperimento. In questo articolo, è stato introdotto un supporto stampato in 3D per piccoli animali che potrebbe facilmente immobilizzare più roditori, portando a una restrizione motoria. Lo scopo di questo lavoro è quello di somministrare trattamenti EA a un gruppo di giovani ratti o topi, concentrandosi sulle strategie per la restrizione di massa dei topi, l'identificazione e la stimolazione dei punti di agopuntura MS6 e ST25.

Protocollo

Gli esperimenti in questo studio sono conformi al principio delle "3R" dell'etica animale e sono stati approvati dal Comitato per il benessere degli animali da laboratorio e l'etnia dell'Università di Medicina dell'Esercito (AMUWEC20234543).

1. Preparazione del dispositivo di fissazione del corpo dei roditori

1. Progetta un supporto per animali di piccola taglia basato sul brevetto cinese del modello^{di utilità 9}.
2. Produci il dispositivo attraverso la tecnologia di stampa 3D.
3. Preparare una corda lunga 2 m e dividerla in 6 corde. Infilare queste 6 corde attraverso i fori del fissatore. Utilizza la fibbia a molla per fissare le estremità della corda, facilitando la regolazione delle dimensioni dell'anello.
   NOTA: Il fissatore può essere prodotto da qualsiasi azienda dotata di tecnologia di stampa 3D sulla base di un disegno di progettazione. Il disegno di progettazione del dispositivo è mostrato nella Figura 1. Il fissatore utilizzato in questo studio è stato prodotto da una stampante 3D con un metodo di stampa chiamato modellazione a deposizione fusa (FDM), noto anche come fabbricazione di filamenti fusi (FFF)¹⁰. Questo metodo di produzione additiva stampa le parti del progetto strato per strato depositando selettivamente il materiale nella forma fusa in un percorso predeterminato. Il processo utilizza polimeri termoplastici che si presentano in filamenti per creare la struttura fisica finale. L'apparato di immobilizzazione utilizzato in questo studio può assicurare tre animali contemporaneamente, richiedendo sei corde, con ogni animale che richiede un paio di corde: una per il collo e una per il tronco.

2. Preparazione dei roditori

1. Acquista 3 ratti Sprague-Dawley (10-40 g, 7-45 giorni) e 3 topi C57 BL/C (5-40 g).
2. Allevare gli animali in una stanza con un ciclo giorno/notte di 12 ore, una temperatura ambiente di 21-23 °C e un'umidità del 45%-60%. Disinfettare e ventilare regolarmente l'ambiente di alimentazione e consentire agli animali di mangiare e bere liberamente.

3. Fissaggio dei roditori al fissatore (posizione prona)

1. Posizionare la testa del roditore nel foro a forma di U davanti al fissatore, con il roditore in posizione prona. Passa il corpo del roditore attraverso due anelli di corda.
2. Fissare le corde intorno al collo e all'addome del roditore, assicurandosi che non possa scappare, ma non così strettamente da causare difficoltà respiratorie e morte.
   1. Il passaggio chiave è fissare il collo in posizione. Lasciare uno spazio di 2-5 mm tra il collo del roditore e la corda. Assicurarsi che la corda non sia troppo tesa per consentire agli animali di strangolarsi o troppo allentata per scappare.
3. Fissare gli altri roditori allo stesso modo nel dispositivo.
4. Ripetere i passaggi di fissazione di cui sopra (3.1-3.2) per 3 giorni per ridurre al minimo la potenziale risposta allo stress causata dalla procedura di fissazione. Ripetere la procedura di fissazione per 3 giorni consecutivi, con ogni sessione della durata di 5 minuti al giorno.
   NOTA: Per garantire che i roditori non fossero eccessivamente stressati durante la procedura di fissazione, abbiamo ripetuto la procedura per 3 giorni consecutivi. Ogni sessione è durata 5 minuti al giorno, fornendo ampio tempo ai topi o ai ratti per acclimatarsi alla procedura e riducendo al minimo qualsiasi potenziale disagio.
5. Strat EA dal giorno 4.
6. Per prevenire la diffusione di malattie, immergere un batuffolo di cotone sterile in alcol al 75% e strofinare accuratamente il supporto per pulirlo e disinfettarlo prima e dopo ogni utilizzo. Utilizzare guanti e altri dispositivi di protezione per evitare potenziali rischi per la salute durante la manipolazione dei roditori.

4. Esecuzione di EA in topi o ratti giovani (MS6)

1. Scegli aghi sterili monouso per agopuntura da 0,25 mm x 13 mm.
2. Trovare i punti di agopuntura in base alla posizione anatomica e confermare la profondità di inserimento in corrispondenza del punto di agopuntura.
   NOTA: MS6 si trova sul lato laterale della testa. Questa regione della testa passa attraverso la connessione tra Shencong (Ex-hn1) e Xuanli (GB6), nota anche come parietale anteriore (Du21). MS6 corrisponde all'espressione del giro precentrale della corteccia cerebrale sul cuoio capelluto. Ex-hn1 si trova 0,5 cm dietro il punto medio della linea mediana antero-posteriore della testa. GB6 si trova nel punto medio della parte anteriore dell'orecchio e nell'angolo finale dell'occhio. Il nervo sopratrocleare superiore, il nervo sopraorbitale, il nervo occipitale e il nervo auricolotemporale sono distribuiti in esso. MS6 è usato principalmente per trattare l'ictus e l'encefalopatia, come i disturbi motori.
3. Ruotare lentamente e inserire gli aghi sterili bilateralmente in MS6 ad una profondità di 3/5 dallo Shenchong anteriore (Exhn1) allo Xuanli (GB6) lungo il sottocutaneo in 3 roditori, rispettivamente.
4. Collegare un lato del cavo di collegamento allo strumento EA.
5. Collegare un altro lato del cavo di collegamento contenente le clip EA positive e negative ai gambi dell'ago per agopuntura a sinistra e a destra MS6.
6. Accendere lo strumento EA.
   1. Ruotare il pulsante (Funzione/Scegli interruttore) per impostare la frequenza e la modalità funzione.
   2. Impostare la frequenza su 10 Hz e scegliere una modalità Onda continua .
   3. Ruotare il pulsante corrispondente (Regola intensità) per impostare l'intensità. Ogni pulsante di regolazione dell'intensità controlla l'intensità della corrente dei roditori del filo collegato sotto di esso. Regolare l'intensità della corrente all'intervallo accettabile di roditori, di solito 1-2 mA, della durata di 5 minuti.
      NOTA: È importante monitorare la respirazione e il comportamento dei roditori durante la procedura per assicurarsi che non provino alcun disagio o disagio. Se il ratto sembra essere in difficoltà o sofferente, la procedura deve essere interrotta immediatamente.

5. Fissaggio dei roditori al fissatore (posizione supina)

1. Posizionare le teste del roditore nel foro a forma di U davanti al fissatore, con il roditore in posizione prona. Passa il corpo del roditore attraverso due anelli di corda.
2. Fissare la corda intorno al collo e all'addome del roditore, assicurandosi che non possa fuoriuscire, ma non così stretta da causare difficoltà respiratorie e morte.
   NOTA: I punti da annotare durante il fissaggio sono gli stessi del passaggio 3.2.
3. Fissa gli altri roditori allo stesso modo.
4. Come nel passaggio 3.4, ripetere i passaggi di fissazione precedenti per 3 giorni per ridurre la risposta allo stress dei roditori.
5. Strat EA dal giorno 4.
   NOTA: La disinfezione viene eseguita come indicato al punto 3.6.

6. Esecuzione di EA (ST25)

1. Scegli aghi sterili monouso per agopuntura da 0,25 mm x 13 mm.
2. Trovare i punti di agopuntura in base alla posizione anatomica e confermare la profondità di inserimento in corrispondenza del punto di agopuntura.
   NOTA: ST25 si trova a livello dell'ombelico. Il posizionamento di questo punto nei roditori richiede prima di tutto di misurare la lunghezza della zampa del roditore. ST25 si trova a 2/3 della lunghezza della zampa accanto all'ombelico. Ad esempio, se la zampa misurata del roditore è di 0,6 cm, ST25 si trova a 0,4 cm a destra e a sinistra dell'ombelico.
3. Ruotare lentamente e penetrare gli aghi sterili in ST25 bilaterale a una profondità di 4-8 mm su 3 roditori, rispettivamente.
4. Collegare un lato del cavo di collegamento allo strumento EA.
5. Collegare un altro lato del cavo di collegamento contenente le clip EA positive e negative ai gambi dell'ago per agopuntura a sinistra e a destra ST25.
6. Accendere lo strumento EA.
   1. Ruotare il pulsante (Funzione/Scegli interruttore) per impostare la frequenza e la modalità funzione.
   2. Impostare la frequenza su 10 Hz e scegliere la modalità onda continua.
   3. Ruotare il pulsante corrispondente (Regola intensità) per impostare l'intensità. Ogni pulsante di regolazione dell'intensità controlla l'intensità corrente del ratto del filo collegato sotto di esso. Regolare l'intensità della corrente all'intervallo accettabile di roditori, di solito 1-2 mA, della durata di 5 minuti.
      NOTA: Le osservazioni sono state le stesse del passaggio 4.6.

Risultati

La planimetria del fissatore per il corpo animale che abbiamo progettato è mostrata nella Figura 1. Inoltre, è stato presentato un modello grafico 3D di questo fissatore per fornire una visione completa del progetto (File supplementare 1). Si tratta di un dispositivo che consente di immobilizzare 3 roditori ed eseguire EA contemporaneamente. I ratti e i topi erano limitati al fissatore nello stato di veglia e sia la posizione prona che quella supina potevano essere fissate...

Discussione

L'elettroagopuntura (EA) è una forma di agopuntura che prevede l'uso di stimolazione elettrica su aghi per agopuntura¹¹. Questa tecnica prevede l'uso di micro-correnti di impulso di intensità e frequenza specifiche per stimolare i punti di agopuntura e ottenere effetti terapeutici potenziati³. Tuttavia, il meccanismo di EA per la guarigione è limitato e richiede un'ampia ricerca di base per dimostrare ^1,2,3<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printing batch mice fixator	MESH INVENT	Custom made	The fixator produced by 3D printer. The printing method is called fused deposition modeling (FDM), also known as fused filament fabrication (FFF).
Electroacupuncture instrument	Hwato, Suzhou Medical Appliance Factory	SDZ-III	www.Hwato-med.com
Disposable sterile acupuncture needle	Suzhou Medical Appliance Factory	N/A	0.25 mm x 13 mm