Operação de eletroacupuntura em massa para camundongos ou ratos jovens

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para eletroacupuntura (EA) eficiente e rápida em camundongos ou ratos jovens usando um suporte impresso tridimensional (3D). Esta técnica permite a operação simultânea em vários animais, economizando tempo e aumentando a eficiência experimental.

Resumo

A eletroacupuntura (EA) é amplamente utilizada para tratar várias condições de saúde. No entanto, o mecanismo subjacente do tratamento da EA permanece obscuro, dificultando sua promoção. O estudo mecanicista requer modelos de camundongos ou ratos para abordar essa questão. No entanto, esses animais não são obedientes ao processo experimental, que é demorado. Para resolver esses problemas, projetamos um fixador de corpo de pequenos animais impresso em 3D para melhorar a eficiência dos experimentos com animais da EA. Este vídeo mostra em detalhes como usar o fixador para executar EA em massa em camundongos ou ratos jovens. Para a seleção dos acupontos, optou-se pela linha oblíqua anterior do vértex temporal (cabeça MS6) e ponto de Tianshu (barriga ST25) para verificar o efeito do dispositivo de fixação com posição prona e posição supina. O uso do porta-animais de pequeno porte impresso em 3D permite que vários roedores sejam imobilizados e tratados simultaneamente, reduzindo o tempo e os recursos necessários para o experimento. Esta técnica poderia ser aplicada a outros modelos animais por impressão 3D de diferentes tamanhos e poderia potencialmente ser usada para várias condições de fixação. O dispositivo é benéfico para a promoção da pesquisa científica experimental em EA.

Introdução

A eletroacupuntura (EA) é um método único no qual agulhas de acupuntura são inseridas no couro cabeludo e conectadas a uma eletromáquina para estimular pontos específicos¹. Ao contrário da estimulação manual, a AE permite um melhor controle da estimulação, estabilizando frequências e formas de onda específicas para alcançar efeitos terapêuticos ótimos². De acordo com uma pesquisa, 81,2% das instituições médicas na China usam EA ou acupuntura manual para tratar paralisia cerebral, neuralgia, paralisia facial e outras condições. Apesar de sua popularidade, o mecanismo específico de eficácia da EA ainda é desconhecido, o que tem dificultado sua promoção e aplicação no tratamento reabilitador de doenças neurológicas ^1,2,3. Mais pesquisas são necessárias para compreender completamente o mecanismo de eficácia da EA e promover seu uso no tratamento de reabilitação de doenças neurológicas.

À medida que a influência da acupuntura se expande em todo o mundo, muitos estudos já investigaram os mecanismos de EA realizados em modelos de roedores, como modelos de ratos ou camundongos ^1,2,3. Vários problemas são frequentemente encontrados nos experimentos de roedores da EA. A primeira é como imobilizar roedores sem anestesia, já que a acupuntura realizada em indivíduos acordados é mais reflexiva da prática clínica. Além disso, alguns experimentos requerem que os animais estejam acordados para observar os efeitos do tratamento ^2,3. Outro desafio é localizar com precisão os acupontos em camundongos ou ratos que correspondem aos dos humanos. A localização precisa de acupontos em roedores experimentais está sendo estudada por muitos estudiosos ^4,5. Nesse protocolo, foram selecionadas as SM6 e ST25, as quais foram claramente definidas em roedores pela transformação da localização anatômica humana. A MS6 é comumente utilizada para o tratamento de algumas doenças cerebrais, como a doença de Parkinson⁶. O ST25 é usualmente utilizado para tratar problemas gastrointestinais, como diarreia⁷. Esses dois acupontos foram escolhidos principalmente para demonstrar como os roedores podem ser efetivamente imobilizados tanto na posição supina quanto na posição prona. Além disso, esses acupontos têm sido extensivamente estudados e oferecem insights significativos para fins de pesquisa ^6,7.

O método anterior de imobilização de um único rato para experimentos não é apenas demorado, mas também difícil de manusear por uma única pessoa⁸. Além disso, devido à não cooperação dos animais, a taxa de sucesso é relativamente baixa na prática. Portanto, há uma necessidade crítica de criar um modelo animal facilmente estabelecido com características estáveis para melhorar a eficiência do experimento. Neste artigo, foi introduzido um suporte impresso em 3D para pequenos animais que poderia facilmente imobilizar múltiplos roedores, levando à restrição motora. O objetivo deste trabalho é administrar tratamentos de EA a um lote de ratos jovens ou camundongos, enfocando as estratégias de restrição em massa de camundongos, identificação e estimulação de acupontos MS6 e ST25.

Protocolo

Os experimentos deste estudo obedecem ao princípio "3Rs" da ética animal e foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal e Etnia do Laboratório da Universidade de Medicina do Exército (AMUWEC20234543).

1. Preparo do dispositivo de fixação do corpo de roedores

1. Projetar um pequeno porta-animais com base na patente do modelo de utilidade chinês⁹.
2. Produza o dispositivo através da tecnologia de impressão 3D.
3. Prepare uma corda de 2 m de comprimento e divida em 6 cordas. Rosqueie estas 6 cordas através dos orifícios no fixador. Utilize a fivela com mola para prender as extremidades da corda, facilitando o ajuste do tamanho do laço.
   NOTA: O fixador pode ser fabricado por qualquer empresa equipada com tecnologia de impressão 3D com base em um desenho de projeto. O desenho do projeto do dispositivo é mostrado na Figura 1. O fixador utilizado neste estudo foi produzido por uma impressora 3D por um método de impressão denominado fused deposition modeling (FDM), também conhecido como fused filament fabrication (FFF)¹⁰. Este método de manufatura aditiva imprime as partes do projeto camada por camada, depositando seletivamente o material na forma fundida em um caminho predeterminado. O processo utiliza polímeros termoplásticos que vêm em filamentos para criar a estrutura física final. O aparelho de imobilização utilizado neste estudo pode fixar três animais simultaneamente, necessitando de seis cordas, sendo que cada animal necessita de um par de cordas: uma para o pescoço e outra para o tronco.

2. Preparação de roedores

1. Compre 3 ratos Sprague-Dawley (10-40 g, 7-45 dias de idade) e 3 camundongos C57 BL/C (5-40 g).
2. Crie animais em uma sala com um ciclo dia/noite de 12 horas, uma temperatura ambiente de 21-23 °C e uma umidade de 45%-60%. Desinfetar e ventilar o ambiente de alimentação regularmente, e permitir que os animais comam e bebam livremente.

3. Fixação dos roedores ao fixador (posição prona)

1. Coloque a cabeça do roedor no orifício em forma de U na frente do fixador, com o roedor em decúbito ventral. Passe o corpo do roedor através de duas alças de corda.
2. Aperte as cordas ao redor do pescoço e abdômen do roedor, garantindo que ele não possa escapar, mas não tão firmemente a ponto de causar desconforto respiratório e morte.
   1. O passo fundamental é fixar o pescoço no lugar. Deixe um espaço de 2-5 mm entre o pescoço do roedor e a corda. Certifique-se de que a corda não esteja muito apertada para os animais estrangular ou muito solta para escapar.
3. Corrija os outros roedores da mesma forma no dispositivo.
4. Repetir os passos de fixação acima (3.1-3.2) por 3 dias para minimizar a potencial resposta ao estresse causada pelo procedimento de fixação. Repetir o procedimento de fixação por 3 dias consecutivos, com cada sessão durando 5 min por dia.
   NOTA: Para garantir que os roedores não ficassem sobrecarregados durante o procedimento de fixação, repetimos o procedimento por 3 dias consecutivos. Cada sessão teve duração de 5 min por dia, proporcionando tempo suficiente para camundongos ou ratos se aclimatarem ao procedimento e minimizando qualquer potencial desconforto.
5. Strat EA a partir do dia 4.
6. Para evitar a propagação de doenças, mergulhe um cotonete estéril ou bola em álcool a 75% e limpe bem o suporte para limpá-lo e desinfetá-lo antes e depois de cada uso. Use luvas e outros equipamentos de proteção para evitar potenciais riscos à saúde ao manusear roedores.

4. Realização de EA em camundongos ou ratos jovens (MS6)

1. Escolha agulhas de acupuntura estéreis descartáveis de 0,25 mm x 13 mm.
2. Encontre os acupontos por localização anatômica e confirme a profundidade de inserção no acuponto.
   Observação : MS6 está localizado no lado lateral da cabeça. Essa região da cabeça passa pela conexão entre Shencong (Ex-hn1) e Xuanli (GB6), também conhecida como parietal anterior (Du21). MS6 corresponde à expressão do giro pré-central do córtex cerebral no couro cabeludo. Ex-hn1 está localizado 0,5 cm atrás do ponto médio da linha média anteroposterior da cabeça. GB6 está localizado no ponto médio da frente da orelha e no ângulo final do olho. O nervo supratroclear superior, o nervo supraorbital, o nervo occipital e o nervo auriculotemporal estão distribuídos nele. MS6 é usado principalmente para tratar acidente vascular cerebral e encefalopatia, como distúrbios motores.
3. Torcer lentamente e inserir agulhas estéreis bilateralmente no MS6 a uma profundidade de 3/5 do Shenchong anterior (Exhn1) ao Xuanli (GB6) ao longo do subcutâneo em 3 roedores, respectivamente.
4. Conecte um lado do cabo de conexão ao instrumento EA.
5. Conecte outro lado do cabo de conexão que contém os clipes EA positivos e negativos às hastes da agulha de acupuntura à esquerda e à direita MS6.
6. Ative o instrumento EA.
   1. Gire o botão (Função/ Escolher interruptor) para definir a frequência e o modo de função.
   2. Defina a Frequência para 10 Hz e escolha um modo de Onda Contínua .
   3. Gire o botão correspondente (Ajustar intensidade) para definir a intensidade. Cada botão de ajuste de intensidade controla a força atual dos roedores do fio conectado abaixo dele. Ajuste a intensidade da corrente para a faixa aceitável de roedores, geralmente 1-2 mA, com duração de 5 min.
      OBS: É importante monitorar a respiração e o comportamento dos roedores durante o procedimento para garantir que eles não estejam sentindo nenhum sofrimento ou desconforto. Se o rato parece estar lutando ou com dor, o procedimento deve ser interrompido imediatamente.

5. Fixação dos roedores ao fixador (posição supina)

1. Coloque as cabeças do roedor no orifício em forma de U na frente do fixador, com o roedor em decúbito ventral. Passe o corpo do roedor através de duas alças de corda.
2. Aperte a corda ao redor do pescoço e abdômen do roedor, garantindo que ele não possa escapar, mas não tão apertado a ponto de causar desconforto respiratório e morte.
   NOTA: Os pontos a serem observados durante a fixação são os mesmos da etapa 3.2.
3. Corrija os outros roedores da mesma forma.
4. Como no passo 3.4, repita os passos de fixação acima por 3 dias para reduzir a resposta de estresse dos roedores.
5. Strat EA a partir do dia 4.
   NOTA: A desinfecção é executada conforme mencionado na etapa 3.6.

6. Realizando EA (ST25)

1. Escolha agulhas de acupuntura estéreis descartáveis de 0,25 mm x 13 mm.
2. Encontre os acupontos por localização anatômica e confirme a profundidade de inserção no acuponto.
   NOTA: ST25 está localizado ao nível da cicatriz umbilical. Posicionar este ponto em roedores requer primeiro medir o comprimento da pata do roedor. ST25 está localizado a 2/3 do comprimento da pata ao lado do umbigo. Por exemplo, se a pata medida do roedor é de 0,6 cm, então ST25 está localizado 0,4 cm à direita e esquerda do umbigo.
3. Torcer lentamente e penetrar agulhas estéreis em ST25 bilateral a uma profundidade de 4-8 mm em 3 roedores, respectivamente.
4. Conecte um lado do cabo de conexão ao instrumento EA.
5. Conecte outro lado do cabo de conexão que contém os clipes EA positivos e negativos às hastes da agulha de acupuntura no ST25 esquerdo e direito.
6. Ative o instrumento EA.
   1. Gire o botão (Função/ Escolher interruptor) para definir a frequência e o modo de função.
   2. Defina a Frequência para 10 Hz e escolha Modo de Onda Contínua.
   3. Gire o botão correspondente (Ajustar intensidade) para definir a intensidade. Cada botão de ajuste de intensidade controla a força atual do rato do fio conectado abaixo dele. Ajuste a intensidade da corrente para a faixa aceitável de roedores, geralmente 1-2 mA, com duração de 5 min.
      NOTA: As observações foram as mesmas do passo 4.6.

Resultados

A planta baixa do fixador do corpo do animal que projetamos é mostrada na Figura 1. Além disso, um modelo gráfico 3D deste fixador foi submetido para fornecer uma visão abrangente do projeto (Arquivo Suplementar 1). Trata-se de um dispositivo que permite imobilizar 3 roedores e realizar EA simultaneamente. Ratos e camundongos ficaram restritos ao fixador em estado de vigília, e tanto a posição prona quanto a supina puderam ser firmemente fixadas sem causar lesão aos ...

Discussão

A eletroacupuntura (EA) é uma forma de acupuntura que envolve o uso de estimulação elétrica em agulhas de acupuntura¹¹. Essa técnica envolve o uso de microcorrentes de pulso de intensidade e frequência específicas para estimular pontos de acupuntura e alcançar efeitos terapêuticos aprimorados³. No entanto, o mecanismo de EA para cicatrização é limitado e requer extensa pesquisa básica para comprovação1,2,3.^...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printing batch mice fixator	MESH INVENT	Custom made	The fixator produced by 3D printer. The printing method is called fused deposition modeling (FDM), also known as fused filament fabrication (FFF).
Electroacupuncture instrument	Hwato, Suzhou Medical Appliance Factory	SDZ-III	www.Hwato-med.com
Disposable sterile acupuncture needle	Suzhou Medical Appliance Factory	N/A	0.25 mm x 13 mm