Massen-Elektroakupunktur-Operation für Mäuse oder junge Ratten

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für eine effiziente und schnelle Elektroakupunktur (EA) bei Mäusen oder jungen Ratten unter Verwendung eines dreidimensionalen (3D) gedruckten Halters vor. Diese Technik ermöglicht den gleichzeitigen Betrieb an mehreren Tieren, spart Zeit und erhöht die experimentelle Effizienz.

Zusammenfassung

Elektroakupunktur (EA) wird häufig zur Behandlung verschiedener Gesundheitszustände eingesetzt. Der zugrunde liegende Mechanismus der EA-Behandlung bleibt jedoch unklar und behindert ihre Förderung. Die mechanistische Studie erfordert Maus- oder Rattenmodelle, um dieses Problem zu lösen. Diese Tiere sind jedoch nicht gehorsam gegenüber dem Versuchsprozess, der zeitaufwändig ist. Um diese Probleme zu lösen, haben wir einen 3D-gedruckten Kleintier-Körper-Bulk-Fixator entwickelt, um die Effizienz der Tierversuche von EA zu verbessern. Dieses Video zeigt im Detail, wie man den Fixateur verwendet, um Massen-EA an Mäusen oder jungen Ratten durchzuführen. Für die Auswahl der Akupunkturpunkte wurde die vordere schräge Linie des Scheitelpunkts temporal (MS6-Kopf) und des Tianshu-Punktes (ST25-Bauch) gewählt, um die Wirkung der Fixationsvorrichtung bei Bauchlage und Rückenlage zu überprüfen. Mit dem 3D-gedruckten Kleintierhalter können mehrere Nagetiere gleichzeitig immobilisiert und behandelt werden, wodurch der Zeit- und Ressourcenaufwand für das Experiment reduziert wird. Diese Technik könnte durch den 3D-Druck unterschiedlicher Größen auf andere Tiermodelle angewendet werden und könnte möglicherweise für verschiedene Befestigungsbedingungen verwendet werden. Das Gerät ist vorteilhaft für die Förderung der experimentellen wissenschaftlichen Forschung in EA.

Einleitung

Die Elektroakupunkturtherapie (EA) ist eine einzigartige Methode, bei der Akupunkturnadeln in die Kopfhaut eingeführt und mit einer Elektromaschine verbunden werden, um bestimmte Punkte^{zu stimulieren 1}. Im Gegensatz zur manuellen Stimulation ermöglicht EA eine bessere Kontrolle der Stimulation, indem bestimmte Frequenzen und Wellenformen stabilisiert werden, um optimale therapeutische Effekte zu erzielen². Laut einer Umfrage verwenden 81,2 % der medizinischen Einrichtungen in China EA oder manuelle Akupunktur zur Behandlung von Zerebralparese, Neuralgie, Gesichtslähmung und anderen Erkrankungen. Trotz seiner Popularität ist der spezifische Wirksamkeitsmechanismus von EA noch unbekannt, was seine Förderung und Anwendung in der Rehabilitationsbehandlung neurologischer Erkrankungen behindert hat ^1,2,3. Weitere Forschung ist erforderlich, um den Mechanismus der Wirksamkeit von EA vollständig zu verstehen und seine Verwendung in der Rehabilitationsbehandlung neurologischer Erkrankungen zu fördern.

Da sich der Einfluss der Akupunktur weltweit ausbreitet, haben viele Studien bereits die Mechanismen der EA untersucht, die an Nagetiermodellen wie Ratten- oder Mausmodellen durchgeführt wurden ^1,2,3. Bei den Nagetierexperimenten von EA treten häufig mehrere Probleme auf. Die erste ist, wie Nagetiere ohne Betäubung immobilisiert werden können, da die Akupunktur bei wachen Probanden die klinische Praxis besser widerspiegelt. Darüber hinaus erfordern einige Experimente, dass die Tiere wach sind, um Behandlungseffekte zu beobachten ^2,3. Eine weitere Herausforderung besteht darin, die Akupunkturpunkte bei Mäusen oder Ratten genau zu lokalisieren, die denen beim Menschen entsprechen. Die genaue Lokalisierung von Akupunkturpunkten bei experimentellen Nagetieren wird derzeit von vielen Wissenschaftlern untersucht ^4,5. In diesem Protokoll wurden MS6 und ST25 ausgewählt, die bei Nagetieren durch die Transformation der menschlichen anatomischen Lokalisation klar definiert wurden. MS6 wird häufig zur Behandlung einiger Hirnerkrankungen wie der Parkinson-Krankheit⁶ eingesetzt. ST25 wird normalerweise zur Behandlung von Magen-Darm-Problemen wie Durchfall^{eingesetzt 7}. Diese beiden Akupunkturpunkte wurden in erster Linie ausgewählt, um zu demonstrieren, wie Nagetiere sowohl in Rückenlage als auch in Bauchlage effektiv immobilisiert werden können. Darüber hinaus wurden diese Akupunkturpunkte ausführlich untersucht und bieten wichtige Erkenntnisse für Forschungszwecke ^6,7.

Die bisherige Methode, eine einzelne Ratte für Experimente zu immobilisieren, ist nicht nur zeitaufwändig, sondern auch für eine einzelne Person schwer zu handhaben⁸. Darüber hinaus ist die Erfolgsquote aufgrund der mangelnden Kooperation der Tiere in der Praxis relativ gering. Daher ist es dringend erforderlich, ein leicht zu etablierendes Tiermodell mit stabilen Eigenschaften zu erstellen, um die Effizienz der Experimente zu verbessern. In diesem Artikel wurde ein 3D-gedruckter Halter für Kleintiere vorgestellt, der mehrere Nagetiere leicht bewegungsunfähig machen kann, was zu einer motorischen Einschränkung führt. Das Ziel dieser Arbeit ist es, einer Charge junger Ratten oder Mäuse EA-Behandlungen zu verabreichen, wobei der Schwerpunkt auf den Strategien zur Massenbeschränkung von Mäusen, zur Identifizierung und Stimulation von MS6- und ST25-Akupunkturpunkten liegt.

Protokoll

Die Experimente in dieser Studie entsprechen dem "3R"-Prinzip der Tierethik und wurden vom Laboratory Animal Welfare and Ethnic Committee der Army Medical University (AMUWEC20234543) genehmigt.

1. Vorbereitung der Nagetierkörperfixierungsvorrichtung

1. Entwerfen Sie einen Kleintierhalter auf der Grundlage des chinesischen Gebrauchsmusterpatents⁹.
2. Produzieren Sie das Gerät durch 3D-Drucktechnologie.
3. Bereiten Sie ein 2 m langes Seil vor und teilen Sie es in 6 Seile auf. Fädeln Sie diese 6 Seile durch die Löcher im Fixateur. Verwenden Sie die federbelastete Schnalle, um die Seilenden zu befestigen und die Einstellung der Schlaufengröße zu erleichtern.
   HINWEIS: Der Fixateur kann von jedem Unternehmen hergestellt werden, das mit 3D-Drucktechnologie ausgestattet ist, basierend auf einer Konstruktionszeichnung. Die Konstruktionszeichnung des Geräts ist in Abbildung 1 dargestellt. Der in dieser Studie verwendete Fixateur wurde von einem 3D-Drucker mit einem Druckverfahren namens Fused Deposition Modeling (FDM) hergestellt, das auch als Fused Filament Fabrication (FFF) bekannt ^ist10. Bei diesem additiven Fertigungsverfahren werden die Teile des Designs Schicht für Schicht gedruckt, indem das Material selektiv in der geschmolzenen Form in einem vorgegebenen Weg abgeschieden wird. Bei dem Verfahren werden thermoplastische Polymere verwendet, die in Filamenten geliefert werden, um die endgültige physikalische Struktur zu erzeugen. Der in dieser Studie verwendete Immobilisierungsapparat kann drei Tiere gleichzeitig sichern, was sechs Seile erfordert, wobei jedes Tier ein Paar Seile benötigt: eines für den Hals und eines für den Rumpf.

2. Vorbereitung von Nagetieren

1. Kaufen Sie 3 Sprague-Dawley-Ratten (10-40 g, 7-45 Tage alt) und 3 C57 BL/C-Mäuse (5-40 g).
2. Tiere in einem Raum mit einem 12-stündigen Tag-Nacht-Zyklus, einer Umgebungstemperatur von 21-23 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 45%-60% züchten. Desinfizieren und lüften Sie die Fütterungsumgebung regelmäßig und lassen Sie die Tiere frei fressen und trinken.

3. Fixieren von Nagetieren am Fixateur (Bauchlage)

1. Legen Sie den Kopf des Nagetiers in das U-förmige Loch vor dem Fixateur, während sich das Nagetier in Bauchlage befindet. Führen Sie den Körper des Nagetiers durch zwei Seilschlaufen.
2. Befestigen Sie die Seile um Hals und Bauch des Nagetiers und stellen Sie sicher, dass es nicht entweichen kann, aber nicht so fest, dass Atemnot und Tod verursacht werden.
   1. Der wichtigste Schritt besteht darin, den Hals zu fixieren. Lassen Sie einen Abstand von 2-5 mm zwischen dem Hals des Nagetiers und dem Seil. Stellen Sie sicher, dass das Seil nicht zu eng ist, damit die Tiere es erwürgen können, oder zu locker, um zu entkommen.
3. Befestigen Sie die anderen Nagetiere auf die gleiche Weise im Gerät.
4. Wiederholen Sie die obigen Fixierungsschritte (3.1-3.2) für 3 Tage, um die potenzielle Stressreaktion durch das Fixierungsverfahren zu minimieren. Wiederholen Sie den Fixationsvorgang an 3 aufeinanderfolgenden Tagen, wobei jede Sitzung 5 Minuten pro Tag dauert.
   HINWEIS: Um sicherzustellen, dass Nagetiere während des Fixierungsvorgangs nicht überlastet wurden, wiederholten wir den Vorgang an 3 aufeinanderfolgenden Tagen. Jede Sitzung dauerte 5 Minuten pro Tag, so dass Mäuse oder Ratten ausreichend Zeit hatten, sich an das Verfahren zu gewöhnen und mögliche Beschwerden zu minimieren.
5. Strat EA ab Tag 4.
6. Um die Ausbreitung von Krankheiten zu verhindern, tauchen Sie ein steriles Wattestäbchen oder einen sterilen Wattebausch in 75%igen Alkohol und wischen Sie den Halter gründlich ab, um ihn vor und nach jedem Gebrauch zu reinigen und zu desinfizieren. Verwenden Sie Handschuhe und andere Schutzausrüstung, um potenzielle Gesundheitsrisiken beim Umgang mit Nagetieren zu vermeiden.

4. Durchführung von EA bei Mäusen oder jungen Ratten (MS6)

1. Wählen Sie sterile Einweg-Akupunkturnadeln mit den Maßen 0,25 mm x 13 mm.
2. Finden Sie die Akupunkturpunkte nach anatomischer Lage und bestätigen Sie die Einstichtiefe am Akupunkturpunkt.
   HINWEIS: MS6 befindet sich an der seitlichen Seite des Kopfes. Diese Region im Kopf verläuft durch die Verbindung zwischen Shencong (Ex-hn1) und Xuanli (GB6), auch bekannt als anteriores Parietal (Du21). MS6 entspricht der Expression des präzentralen Gyrus der Großhirnrinde auf der Kopfhaut. Ex-hn1 befindet sich 0,5 cm hinter dem Mittelpunkt der anterior-posterioren Mittellinie des Kopfes. GB6 befindet sich in der Mitte der Vorderseite des Ohrs und des Endwinkels des Auges. Der Nervus supratrochlearis superior, der Nervus supraorbitalis, der Nervus occipitalis und der Nervus auriculotemporalis sind darin verteilt. MS6 wird hauptsächlich zur Behandlung von Schlaganfall und Enzephalopathie, wie z. B. motorischen Störungen, eingesetzt.
3. Drehen Sie langsam sterile Nadeln und führen Sie sie beidseitig in MS6 in einer Tiefe von 3/5 vom vorderen Shenchong (Exhn1) bis zum Xuanli (GB6) entlang der Subkutane bei 3 Nagetieren ein.
4. Verbinden Sie eine Seite des Verbindungskabels mit dem EA-Instrument.
5. Verbinden Sie eine andere Seite des Anschlusskabels mit den positiven und negativen EA-Clips mit den Akupunkturnadelschäften links und rechts MS6.
6. Schalten Sie das EA-Instrument ein.
   1. Drehen Sie die Taste (Funktion / Schalter wählen), um die Frequenz und den Funktionsmodus einzustellen.
   2. Stellen Sie die Frequenz auf 10 Hz ein und wählen Sie einen Dauerstrichmodus .
   3. Drehen Sie die entsprechende Taste (Intensität anpassen), um die Intensität einzustellen. Jede Taste zum Einstellen der Intensität steuert die Stromstärke der Nagetiere des darunter angeschlossenen Drahtes. Stellen Sie die Stromstärke auf den akzeptablen Bereich von Nagetieren ein, normalerweise 1-2 mA, und dauern Sie 5 Minuten.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Atmung und das Verhalten der Nagetiere während des Eingriffs zu überwachen, um sicherzustellen, dass sie keine Beschwerden oder Beschwerden verspüren. Wenn die Ratte Probleme zu haben scheint oder Schmerzen hat, sollte der Eingriff sofort abgebrochen werden.

5. Fixieren von Nagetieren am Fixateur (Rückenlage)

1. Legen Sie die Köpfe des Nagetiers in das U-förmige Loch vor dem Fixateur, während sich das Nagetier in Bauchlage befindet. Führen Sie den Körper des Nagetiers durch zwei Seilschlaufen.
2. Befestigen Sie das Seil um Hals und Bauch des Nagetiers und stellen Sie sicher, dass es nicht entweichen kann, aber nicht so fest, dass Atemnot und Tod verursacht werden.
   HINWEIS: Die Punkte, die bei der Fixierung zu beachten sind, sind die gleichen wie in Schritt 3.2.
3. Fixiere die anderen Nagetiere auf die gleiche Weise.
4. Wiederholen Sie wie in Schritt 3.4 die obigen Fixierungsschritte 3 Tage lang, um die Stressreaktion von Nagetieren zu reduzieren.
5. Strat EA ab Tag 4.
   HINWEIS: Die Desinfektion erfolgt wie in Schritt 3.6 beschrieben.

6. Ausführen von EA (ST25)

1. Wählen Sie sterile Einweg-Akupunkturnadeln mit den Maßen 0,25 mm x 13 mm.
2. Finden Sie die Akupunkturpunkte nach anatomischer Lage und bestätigen Sie die Einstichtiefe am Akupunkturpunkt.
   HINWEIS: ST25 befindet sich auf Höhe des Nabels. Um diesen Punkt bei Nagetieren zu positionieren, muss zuerst die Länge der Pfote des Nagetiers gemessen werden. ST25 befindet sich bei 2/3 der Länge der Pfote neben dem Bauchnabel. Wenn beispielsweise die gemessene Pfote des Nagetiers 0,6 cm beträgt, befindet sich ST25 0,4 cm rechts und links vom Nabel.
3. Sterile Nadeln langsam drehen und bei 3 Nagetieren in einer Tiefe von 4-8 mm beidseitig in ST25 eindringen.
4. Verbinden Sie eine Seite des Verbindungskabels mit dem EA-Instrument.
5. Verbinden Sie eine andere Seite des Anschlusskabels mit den positiven und negativen EA-Clips mit den Akupunkturnadelschäften links und rechts ST25.
6. Schalten Sie das EA-Instrument ein.
   1. Drehen Sie die Taste (Funktion / Schalter wählen), um die Frequenz und den Funktionsmodus einzustellen.
   2. Stellen Sie die Frequenz auf 10 Hz ein und wählen Sie den Dauerstrichmodus.
   3. Drehen Sie die entsprechende Taste (Intensität anpassen), um die Intensität einzustellen. Jede Taste zum Einstellen der Intensität steuert die Stromstärke der Ratte des darunter angeschlossenen Drahtes. Stellen Sie die Stromstärke auf den akzeptablen Bereich von Nagetieren ein, normalerweise 1-2 mA, und dauern Sie 5 Minuten.
      HINWEIS: Die Beobachtungen waren die gleichen wie in Schritt 4.6.

Ergebnisse

Der Grundriss des von uns entworfenen Tierkörperfixateurs ist in Abbildung 1 dargestellt. Zusätzlich wurde ein grafisches 3D-Modell dieses Fixateurs eingereicht, um einen umfassenden Überblick über das Design zu geben (Ergänzungsdatei 1). Dies ist ein Gerät, mit dem 3 Nagetiere immobilisiert werden und gleichzeitig EA ausführen können. Ratten und Mäuse waren im wachen Zustand auf den Fixateur beschränkt, und sowohl die Bauch- als auch die Rückenlage konnten fest f...

Diskussion

Elektroakupunktur (EA) ist eine Form der Akupunktur, bei der elektrische Stimulation auf Akupunkturnadeln verwendet^{wird 11}. Bei dieser Technik werden Mikropulsströme mit spezifischer Intensität und Frequenz verwendet, um Akupunkturpunkte zu stimulieren und verbesserte therapeutische Effekte zu erzielen³. Der Heilungsmechanismus von EA ist jedoch begrenzt und erfordert umfangreiche Grundlagenforschung, um ^1,2,3

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printing batch mice fixator	MESH INVENT	Custom made	The fixator produced by 3D printer. The printing method is called fused deposition modeling (FDM), also known as fused filament fabrication (FFF).
Electroacupuncture instrument	Hwato, Suzhou Medical Appliance Factory	SDZ-III	www.Hwato-med.com
Disposable sterile acupuncture needle	Suzhou Medical Appliance Factory	N/A	0.25 mm x 13 mm