Identificación de biomarcadores para la especificidad de género de la enfermedad de Alzheimer basada en los perfiles del transcriptoma glial

Resumen

Este estudio analizó transcriptomas de un solo núcleo de treinta y tres individuos con enfermedad de Alzheimer (EA), revelando DEG específicos del sexo en las células gliales. El análisis de enriquecimiento funcional destacó las vías sinápticas, neuronales y relacionadas con las hormonas. Se identificaron genes clave, a saber, NLGN4Y y sus reguladores, y se propusieron posibles candidatos terapéuticos para la EA específica del género.

Resumen

Recientemente se han revelado muchos biomarcadores específicos del sexo en la enfermedad de Alzheimer (EA); sin embargo, rara vez se informaron células gliales cerebrales. Este estudio analizó 220.095 transcriptomas de un solo núcleo de la corteza frontal de treinta y tres individuos con EA en la base de datos GEO. Se identificaron genes expresados diferencialmente (DEG) específicos del sexo en las células gliales, incluidos 243 en astrocitos, 1.154 en microglía y 572 en oligodendrocitos. Los análisis de anotación funcional de Gene Ontology (GO) y los análisis de enriquecimiento de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) revelaron concentraciones funcionales en vías sinápticas, neuronales y relacionadas con hormonas. La red de interacción proteína-proteína (PPI) identificó a MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PAKACB, CAMK2D y NLGN4Y en astrocitos, TREM2, FOS, APOE, APP y NLGN4Y en microglía, y GRIN2A, ITPR2, GNAS y NLGN4Y en oligodendrocitos como genes clave. NLGN4Y fue el único gen compartido por las tres glías y se identificó como el biomarcador de la especificidad de género de la EA. La red correguladora de factor de transcripción génica (TF)-miRNA identificó reguladores clave para NLGN4Y y sus TCM objetivo. Se identificaron Ecklonia kurome Okam (Kunbu) y Herba Ephedrae (Mahuang), y se mostraron los efectos de los ingredientes activos sobre la EA. Finalmente, el análisis de enriquecimiento de Kunbu y Mahuang sugirió que podrían actuar como candidatos terapéuticos para la especificidad de género de la EA.

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad mundial con alta incidencia, y representa el 60%-80% de la demencia¹. A pesar de su alta incidencia, la patogenia mecanicista de la EA no está claramente delimitada, y^{hasta ahora no} ha habido terapias efectivas 2. Las principales patologías en la EA fueron identificadas como la atrofia neuronal y la acumulación de residuos patológicos, principalmente la proteína Tau asociada a microtúbulos y β-amiloide (Aβ)^3,4. La patogenia de la EA se asocia con autofagia anormal, estrés oxidativo, disfunción mitocondrial, inflamación y trastorno del metabolismo energético⁵. Las encuestas de prevalencia demostraron que dos tercios de los pacientes con EA eran mujeres⁶. Existen diferencias específicas por sexo en la EA en la etiología, las manifestaciones clínicas, la prevención y el tratamiento. Por lo tanto, revelar el mecanismo biológico que causa las diferencias específicas de sexo en la EA y dirigirse a la medicina tradicional china (MTC) puede proporcionar un marco teórico más completo para comprender la patogénesis de la EA y guiar aún más la estrategia de tratamiento precisa.

Las células neurogliales, especialmente la microglía, los astrocitos y los oligodendrocitos, pueden contribuir a la patogénesis de la EA. En la EA, la microglía se activa y se altera genéticamente, lo que contribuye a la respuesta inflamatoria, la fagocitosis y el aclaramiento de Aβ ^7,8; El astrocito está alterado genéticamente, lo que afecta a la actividad sináptica, la homeostasis iónica y el metabolismo energético y lipídico⁹; Los oligodendrocitos están genéticamente alterados con la especificidad del sexo, lo que contribuye a la pérdida neuronal, ovillos neurofibrilares y lesiones de la sustancia blanca^10,11.

En este estudio, empleamos la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) como una técnica superior. En comparación con la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq), el snRNA-seq ofrece ventajas en términos de riqueza de muestras, integridad del tipo de célula y fiabilidad de los datos^12,13. El SnRNA-seq se ha utilizado ampliamente en estudios centrados en la EA y explorando el papel de las células gliales 14,15,16. Su amplia adopción en estas áreas de investigación pone de manifiesto su eficacia a la hora de proporcionar información valiosa sobre las características transcripcionales de las células gliales en la EA. Al aprovechar las ventajas de snRNA-seq, los investigadores han podido descubrir información crucial sobre la participación de las células gliales en la patología de la EA e identificar posibles objetivos terapéuticos. Con el fin de explorar las características transcripcionales neurogliales específicas del sexo en la EA y las posibles MTC para la especificidad sexual de la EA, este estudio analizó los datos de snRNA-seq de la corteza frontal de pacientes con EA de la base de datos pública NCBI GEO. Los genes expresados diferencialmente (DEG) específicos del sexo, la ontología génica (GO), la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG), la red de interacción proteína-proteína (PPI) y la red gen-TF-miRNA se analizan más a fondo para revelar biomarcadores clave y una posible patogénesis. Por último, se sugirieron posibles MTC y se mostraron sus ingredientes activos en tablas mediante la búsqueda en las bases de datos Coremine Medical, TCMIP y TCMSP.

Protocolo

Los pasos 2 a 9 del análisis se implementaron utilizando el software R (ver Figura complementaria 1 y Archivo complementario 1), mientras que los pasos restantes se ejecutaron en las plataformas en línea. Los detalles de las bases de datos utilizadas en este protocolo (junto con los enlaces web) se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Adquisición de datos

1. Acceda a la base de datos Ómnibus de Expresión Génica (GEO) disponible públicamente en el Centro Nacional de Información Biotecnológica.
2. Busque los datos GEO denominados Enfermedad de Alzheimer en el cuadro de búsqueda.
3. Seleccione los Organismos superiores como Homo sapiens en el lado derecho.
   NOTA: Los resultados de la búsqueda fueron datos sobre la enfermedad de Alzheimer en Homo sapiens.
4. Después de filtrar la información buscada, descargue los archivos de datos GSE167490 y GSE183068 , que abarcan features.tsv, barcode.tsv y matrix.mtx para cada muestra individual de núcleos individuales. Los conjuntos de datos comprendieron 34 muestras de EA originadas en la corteza frontal, con una distribución equitativa de 17 muestras de hombres y 17 muestras de mujeres (Tabla complementaria 1).

2. Fusión de muestras

1. Configure las rutas de datos y los nombres de muestra en consecuencia en el equipo. Importe las 34 muestras descargadas y asigne nombres específicos de género a las muestras utilizando los nombres de función.
2. Genere objetos Seurat para todas las muestras en un proceso por lotes utilizando la lista de funciones y Read10X, especificando los parámetros como min.cells = 3 y min.features = 200.
3. Utilice la función RenameCells para agregar identificadores de muestra como prefijos a los códigos de barras de celda para conservar los códigos de barras de celda durante el proceso de combinación. Esto garantizó que cada célula conservara su identidad única y pudiera rastrearse hasta su fuente de muestra original después de la fusión.

3. Control de calidad (QC)

1. Emplee la función PercentageFeatureSet para calcular las proporciones de genes mitocondriales, las proporciones de genes de eritrocitos y las proporciones de genes de ribosomas para cada célula.
2. Almacene estas proporciones calculadas en los metadatos utilizando el operador [[ ]] para adjuntar esta información directamente a los metadatos de cada celda.
3. Utilice la función de subconjunto para realizar la filtración de celdas, especificando los parámetros como nFeature_RNA > 200, nFeature_RNA < 10000, nCount_RNA < 60000, percent.mt < 10, percent.rb < 5 y percent. HB < 75.
4. Excluir GSM5106107 del análisis.

4. Comprobación del efecto batch

1. Realizar el procesamiento de datos.
   1. Normalice los datos mediante la función NormalizeData .
   2. Identifique las 2000 características de variables principales del conjunto de datos mediante la función FindVariableFeatures .
   3. Realice un análisis de componentes principales (PCA)¹⁷ sobre los datos utilizando RunPCA, conservando 50 componentes principales.
   4. Genere un diagrama de codo utilizando la función ElbowPlot para determinar el número óptimo de dimensiones para el análisis posterior. Considere las primeras 50 dimensiones.
   5. Escale los datos con ScaleData para asegurarse de que todas las características estén en una escala comparable.
   6. Identifique a los vecinos más cercanos mediante FindNeighbors en función de 30 dimensiones.
   7. Aplique el algoritmo UMAP mediante RunUMAP para reducir la dimensionalidad de los datos a 30 dimensiones.
2. Visualice los datos procesados utilizando la función DimPlot con el parámetro de reducción establecido en umap y el parámetro group.by establecido en orig.ident.
   NOTA: Este paso podría generar un gráfico visualizando los datos en el espacio UMAP reducido, agrupados por las identidades de celda originales. Al examinar las parcelas UMAP, se hizo evidente que había una presencia de efecto lote. El agrupamiento o separación de células en función de su origen experimental o por lotes sugirió que los lotes experimentales habían influido en los perfiles de expresión génica.

5. Integración de datos

1. Normalice y estandarice los datos mediante la función SCTransform .
2. Aplique el algoritmo de armonía¹⁸ para integrar los 33 datos restantes de un solo núcleo. Utilice el ensayo SCT para la integración y establezca el número máximo de iteraciones de armonía en 20.
3. Utilice la función FindClusters con un parámetro de resolución establecido en 0,07 para identificar clústeres distintos dentro de los datos.
4. Emplee la función RunUMAP con un número especificado de dimensiones (dims = 30) para reducir aún más la dimensionalidad de los datos y visualizar los clústeres en un espacio de dimensiones inferiores.

6. Anotación del tipo de celda

1. Recolectar los genes marcadores (Tabla suplementaria 2) de las células a través de una revisión extensa de la literatura existente.
2. Tras la identificación de la heterogeneidad del grupo celular, clasifique el tipo de cada célula del grupo por los genes marcadores expresados específicamente.
3. Presentamos varios tipos celulares con visualización UMAP utilizando el paquete ggplot2, donde se resaltó oligodendrocito con el código de color #DB7093, neurona excitadora con #FF69B4, astrocito con #1874CD, microglía con #63B8FF, célula precursora de oligodendrocitos con #DB7093, neurona inhibidora con #FFC0CB y célula endotelial con #FF69B4.
4. Calcula las proporciones de cada tipo de celda estratificadas por género.

7. Extracción de datos de células gliales

1. Extraiga los datos de astrocitos de los datos masivos integrados utilizando la función de subconjunto.
2. Extraiga los datos de la microglía de los datos masivos integrados mediante la función de subconjunto.
3. Extraiga los datos de oligodendrocitos de los datos masivos integrados mediante la función de subconjunto.

8. Captura de genes expresados diferencialmente (DEGs) específicos del sexo glial

1. Identifique los DEG específicos del sexo de los astrocitos utilizando la función FindMarkers (ident.1 = masculino, ident.2 = femenino, group.by = group.sum, assay = RNA) con valores umbral: valor p < 0,05 y |avg_log2FC| > 30. Etiquete los DEG regulados al alza como Arriba, los DEG regulados a la baja como Abajo y el resto como Estable.
   1. Visualice los DEG utilizando la función ggplot , con el eje x representando la diferencia de porcentaje entre dos condiciones (pct.1 - pct.2), y el eje y representando el avg_log2FC. Los genes regulados al alza se resaltaron con el color PaleVioletRed, los genes regulados a la baja con Pink y los genes estables con DodgerBlue3.
2. Identifique los DEG específicos del sexo de la microglía utilizando la función FindMarkers (ident.1 = masculino, ident.2 = femenino, group.by = group.sum, assay = RNA) con valores umbral: valor p < 0,05 y |avg_log2FC| > 1. Etiquete los DEG regulados al alza como Arriba, los DEG regulados a la baja como Abajo y el resto como Estable.
   1. Visualice los DEG utilizando la función ggplot , con el eje x representando la diferencia de porcentaje entre dos condiciones (pct.1 - pct.2), y el eje y representando el avg_log2FC. Los genes regulados al alza se resaltaron utilizando el color OrangeRed, los genes regulados a la baja con LightSalmon y los genes estables con SteelBlue1.
3. Identifique los DEG específicos del sexo de los oligodendrocitos utilizando la función FindMarkers (ident.1 = macho, ident.2 = hembra, group.by = group.sum, assay = RNA) con valores umbral: p-valor < 0,05 y |avg_log2FC| > 10. Etiquete los DEG regulados al alza como Arriba, los DEG regulados a la baja como Abajo y el resto como Estable.
   1. Visualice los DEG utilizando la función ggplot , con el eje x representando la diferencia de porcentaje entre dos condiciones (pct.1 - pct.2), y el eje y representando la avg_log2FC. Los genes regulados al alza se resaltaron con el color DeepPink, los genes regulados a la baja con HotPink y los genes estables con DeepSkyBlue3.

9. Análisis de enriquecimiento funcional de DEGs específicos por sexo

1. Realice análisis de enriquecimiento de ontología génica (GO) en DEG específicos del sexo para cada tipo de célula glial utilizando la función enrichGO . Establezca los siguientes parámetros: OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = SYMBOL, ont = ALL, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 y qvalueCutoff = 0,05.
2. Convierta los símbolos de genes en identificadores de genes correspondientes utilizando function bitr. Llevar a cabo un análisis de enriquecimiento de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) sobre DEG específicos del sexo para cada tipo de célula glial mediante el uso de la función enrichKEGG . Ajuste la configuración de la siguiente manera: organism = has, keyType = kegg, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0.01 y qvalueCutoff = 0.05.

10. Estadísticas de frecuencia de DEGs gliales en las vías go y kegg, diagramas de Venn de cada DEGs específico del sexo glial y construcción de redes PPI

1. Calcule la frecuencia de DEGs específicas del sexo glial en las vías GO y KEGG utilizando un histograma de frecuencia.
2. Acceda a la base de datos STRING para construir las redes PPI.
3. Elija las proteínas múltiples. Busque la lista de nombres en el cuadro de búsqueda. Establecer "Organismos" como Homo sapiens.
4. Revise la lista de proteínas obtenidas de la búsqueda. Haga clic en Continuar para continuar.
5. Exporte las redes PPI seleccionando la opción de descarga , preferiblemente en formato PNG con mayor resolución.
6. Visualice la distribución de la coexpresión de los principales genes específicos del sexo mediante el uso de los diagramas de Venn.
7. Identifique los genes compartidos como genes clave en el estudio basándose en el análisis del diagrama de Venn.

11. Construcción de redes reguladoras multifactoriales

1. Acceda a NetworkAnalyst.
2. Haga clic en Entrada de lista de genes y especifique el organismo como H. sapiens (humano). Establezca el tipo de identificación como símbolo genético oficial. Ingrese el nombre del gen en el campo de búsqueda y luego haga clic en Cargar y continuar.
3. Seleccione Interacciones gen-miRNA y elija miRTarBase v8.0. Confirme la selección haciendo clic en Aceptar.
4. Vaya a Interacciones TF-gen y seleccione la base de datos ENCODE . Haga clic en Aceptar para confirmar la selección.
5. A continuación, navegue hasta la red correguladora TF-miRNA y haga clic en Aceptar para continuar.
6. Por último, elija Proceder para generar la red reguladora multifactorial incorporando interacciones gen-miRNA e interacciones TF-gen.

12. Análisis de genes y dianas de la MTC

1. Acceda a la base de datos en línea de Coremine Medical.
2. Ingrese el nombre del gen específico y seleccione el gen correspondiente con el sufijo gen/proteína, humano en el cuadro de búsqueda en la sección Explorar .
3. Navegue por la sección Medicamentos e identifique las MTC asociadas con los medicamentos buscados.
   NOTA: Los fármacos estadísticamente significativos se marcaron en azul.
4. Determine los cinco principales MTC en función de su valor de "importancia" como MTC terapéuticas.

13. Resumen de la investigación de los ingredientes de la MTC en la selección de genes clave

1. Acceda a la Plataforma de Investigación Integral basada en Farmacología de Medicina Tradicional China (TCMIP) y a la Base de Datos y Plataforma de Análisis de Farmacología de Sistemas de Medicina Tradicional China (TCMSP). Ingrese los nombres de las hierbas en la barra de búsqueda para recuperar sus ingredientes correspondientes.
2. Recupere los ingredientes en la base de datos de PubMed con un límite de tiempo hasta el 10 de^{abril de} 2023. Los términos de búsqueda utilizados incluyeron el nombre de la molécula en TCMSP y los componentes químicos en TCMIP como términos de búsqueda, y se limitaron a artículos publicados en inglés.
3. Resumir y analizar las hierbas y sus ingredientes correspondientes que actúan sobre la EA.

14. Confirmación de la función del tratamiento de las MTC dirigidas a la especificidad sexual de la EA

1. Importe hierbas en el TCMIP y navegue hasta la página de descripción correspondiente.
2. Utilice la función Exportar datos y seleccione el formato CSV para descargar los términos de enriquecimiento de GO - Proceso biológico, GO - Componente celular, GO - Función molecular y Vía del reactoma.
3. Visualice los términos de enriquecimiento descargados para cada hierba utilizando gráficos de barras.

Resultados

Análisis de secuenciación de SNNnARN de los perfiles del transcriptoma glial frontal y la anotación de los tipos celulares
En total, se obtuvieron 220.095 núcleos y 32.077 genes en la corteza frontal de 17 hombres y 17 mujeres (Figura 1A). El diagrama UMAP visualizó el total de transcriptomas frontales de un solo núcleo que mostraban distintos tipos de núcleos después del análisis de reducción de dimensiones (Figura 1B). Se mostró ...

Discusión

Se ha identificado especificidad de género en epidemiología, patología y manifestación clínica de la EA¹⁹. Aquí, confirmamos el posible mecanismo patológico del "eje hormona-sinapsis-neurona" a partir de genes gliales específicos de género y vías relacionadas en pacientes con EA. NLGN4Y fue el único gen compartido en las tres glías y fue elegido como biomarcador para la especificidad de género de la EA. TF y miRNAs que regulan NLGN4Y estaban fuertemente relacionados con las diferencia...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Database
Coremine Medical database	Jointly developed by Norway, the Chinese Academy of Sciences, the Chinese Academy of Medical Sciences, the National Medical Library of the United States and other institutions		When you explore concepts in CoreMine Medical you access a database that is structured to relate important concepts, ranked by statistical relevance, to your topic. For example, if you type in "Alzheimer disease," in addition to retrieving documents and resources that discuss the disease, you will be able to view networks and lists that show how your query concept is related to other bio-medical concepts. This provides an overview of concepts that relate to your search as well as being an interface for navigating information on these concepts. Weblink: https://coremine.com/medical/
Gene Expression Omnibus (GEO)	National Center for Biotechnology Information in the United States (NCBI)		GEO is a public functional genomics data repository supporting MIAME-compliant data submissions. Array- and sequence-based data are accepted. Tools are provided to help users query and download experiments and curated gene expression profiles. Weblink: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine (TCMIP, version: 2.0)	None		Introduction to the Integrated Pharmacology Based Network Computational Research Platform for Traditional Chinese Medicine [TCMIP v2.0], http://www.tcmip.cn/ ) It is an intelligent data mining platform based on the online database of the Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine (ETCM), which integrates medical big data management and pharmacological computing services. It aims to reveal the scientific connotation of traditional Chinese medicine theory and the scientific value of original thinking in traditional Chinese medicine, summarize and pass on the experience of famous doctors, control the quality of traditional Chinese medicine, explain the principles of traditional Chinese medicine action, research and development of new Chinese medicine, especially the discovery and optimization of modern drug combinations, Provide a strong data foundation and analytical tools. Based on TCMIP v1.0, a comprehensive upgrade is implemented, including five major databases and seven functional modules. Through system integration and module integration, a comprehensive analysis of the multi-level correlation of the "disease syndrome prescription" interaction network can be quickly achieved. As an intelligent data mining platform, TCMIP v2.0 will provide a strong data foundation and analysis platform for revealing the scientific connotation of traditional Chinese medicine theory and the scientific value of original thinking in traditional Chinese medicine, summarizing and inheriting the experience of famous doctors, quality control of traditional Chinese medicine, elucidating the principles of traditional Chinese medicine action, research and development of new traditional Chinese medicine drugs, especially modern drug combination discovery and optimization. Weblink: http://www.tcmip.cn/TCMIP
NetworkAnalyst	None		Networkanalyze is an online visualization analysis platform for gene expression analysis and meta-analysis. It can perform comparative, quantitative, differential and enrichment analysis of gene expression, protein-protein interaction analysis, integration analysis of multiple datasets, and can also draw high-value images such as PCA, protein-protein interaction network diagram, heatmap, volcano diagram, Wayne diagram, etc. Weblink: https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/
PubMed database	National Center for Biotechnology Information in the United States (NCBI)		The Pubmed database is a biomedical literature database maintained by the National Library of Medicine (NLM) in the United States, aimed at providing the latest medical research results to scientists, doctors, researchers, and students worldwide. This database collects biomedical literature from around the world, including journal articles, papers, books, etc. As of now, the Pubmed database has collected over 30 million articles and is continuously updated every week. Weblink: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/
R software	Ross Ihaka and Robert Gentleman		R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment which was developed at Bell Laboratories (formerly AT&T, now Lucent Technologies) by John Chambers and colleagues. R can be considered as a different implementation of S. There are some important differences, but much code written for S runs unaltered under R. Weblink: https://www.r-project.org/
STRING database (STRING, version 11.0)	Swiss Institute of Bioinformatics		STRING is a database of known and predicted protein interactions. The interactions include direct (physical) and indirect (functional) associations Weblink: https://string-db.org/
Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)	Zhejiang Jiuwei Health Co., Ltd		TCMSP is not only a data repository, but also an analysis platform for users to comprehensively study Traditional Chinese Medicines (TCM): including identification of active components, screening of drug targets and generation of compounds-targets-diseases networks, as well as the detailed drug pharmacokinetic information involving drug-likeness (DL), oral bioavailability (OB), blood-brain barrier (BBB),intestinal epithelial permeability (Caco-2), ALogP,fractional negative surface area (FASA-) and number of  H-bond donor/acceptor  (Hdon/Hacc). So far, TCMSP has attracted broad attentions and several groups have published more than 10 papers by using our TCMSP database within about one year. Weblink: https://tcmsp-e.com