Identificação de biomarcadores para especificidade de gênero da doença de Alzheimer com base nos perfis de transcriptoma glial

Resumo

Este estudo analisou transcriptomas de núcleo único de trinta e três indivíduos com doença de Alzheimer (DA), revelando DEGs específicos do sexo em células gliais. A análise de enriquecimento funcional destacou as vias sinápticas, neurais e relacionadas a hormônios. Genes-chave, ou seja, NLGN4Y e seus reguladores, foram identificados, e potenciais candidatos terapêuticos para DA específica de gênero foram propostos.

Resumo

Muitos biomarcadores específicos do sexo foram recentemente revelados na doença de Alzheimer (DA); no entanto, células gliais cerebrais raramente foram relatadas. Este estudo analisou 220.095 transcriptomas de núcleo único do córtex frontal de trinta e três indivíduos com DA no banco de dados GEO. Genes diferencialmente expressos específicos do sexo (DEGs) foram identificados em células gliais, incluindo 243 em astrócitos, 1.154 em microglia e 572 em oligodendrócitos. As análises de anotação funcional da Gene Ontology (GO) e as análises de enriquecimento da via da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) revelaram concentração funcional nas vias sinápticas, neurais e relacionadas a hormônios. A rede de interação proteína-proteína (PPI) identificou MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PAKACB, CAMK2D e NLGN4Y em astrócitos, TREM2, FOS, APOE, APP e NLGN4Y na microglia e GRIN2A, ITPR2, GNAS e NLGN4Y em oligodendrócitos como genes-chave. NLGN4Y foi o único gene compartilhado pelas três glias e foi identificado como o biomarcador para a especificidade de gênero da DA. A rede correguladora do fator de transcrição gênica (TF)-miRNA identificou os principais reguladores para NLGN4Y e seus TCMs alvo. Ecklonia kurome Okam (Kunbu) e Herba Ephedrae (Mahuang) foram identificados, e os efeitos dos ingredientes ativos na DA foram exibidos. Finalmente, a análise de enriquecimento de Kunbu e Mahuang sugeriu que eles podem atuar como candidatos terapêuticos para a especificidade de gênero da DA.

Introdução

A doença de Alzheimer (DA) é uma doença global com alta incidência, sendo responsável por 60%-80% das demências¹. Apesar de sua alta incidência, a patogênese mecanicista da DA não está claramente delineada e não houve terapêutica eficaz até o momento². As principais patologias na DA foram identificadas como atrofia neuronal e acúmulo de detritos patológicos, principalmente a proteína Tau associada a microtúbulos e β-amilóide (Aβ)^3,4. A patogênese da DA está associada a autofagia anormal, estresse oxidativo, disfunção mitocondrial, inflamação e distúrbio do metabolismo energético⁵. Inquéritos de prevalência comprovaram que dois terços dos pacientes com DA eram mulheres⁶. Existem diferenças específicas do sexo na DA na etiologia, manifestações clínicas, prevenção e tratamento. Assim, revelar o mecanismo biológico que causa diferenças específicas de sexo na DA e direcionar a medicina tradicional chinesa (MTC) pode potencialmente fornecer uma estrutura teórica mais abrangente para entender a patogênese da DA e orientar ainda mais a estratégia de tratamento precisa.

As células neurogliais, especialmente a microglia, os astrócitos e os oligodendrócitos, contribuem potencialmente para a patogênese da DA. Na DA, as microglias são ativadas e geneticamente alteradas, o que contribui para a resposta inflamatória, fagocitose e depuração de Aβ ^7,8; o astrócito é geneticamente alterado, o que afeta a atividade sináptica, a homeostase iônica e o metabolismo energético e lipídico⁹; O oligodendrócito é geneticamente alterado com especificidade sexual, o que contribui para a perda neuronal, emaranhados neurofibrilares e lesões na substância branca^10,11.

Neste estudo, empregamos o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) como técnica superior. Comparado ao sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq), o snRNA-seq oferece vantagens em termos de riqueza de amostras, integridade do tipo de célula e confiabilidade dos dados^12,13. O SnRNA-seq tem sido amplamente utilizado em estudos com foco na DA e explorando o papel das células gliais 14,15,16. Sua ampla adoção nessas áreas de pesquisa destaca sua eficácia em fornecer informações valiosas sobre as características transcricionais das células gliais na DA. Ao aproveitar as vantagens do snRNA-seq, os pesquisadores conseguiram descobrir informações cruciais sobre o envolvimento das células gliais na patologia da DA e identificar potenciais alvos terapêuticos. A fim de explorar as características transcricionais neurogliais específicas do sexo na DA e potenciais TCMs para a especificidade sexual da DA, este estudo analisou dados de snRNA-seq do córtex frontal de pacientes com DA do banco de dados público NCBI GEO. Genes diferencialmente expressos (DEGs) específicos do sexo, Ontologia Gênica (GO), Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG), rede de interação proteína-proteína (PPI) e rede gene-TF-miRNA são analisados posteriormente para revelar biomarcadores chave e patogênese potencial. Finalmente, potenciais TCMs foram sugeridos e seus ingredientes ativos foram exibidos com tabelas pesquisando os bancos de dados Coremine Medical, TCMIP e TCMSP.

Protocolo

As etapas 2 a 9 da análise foram implementadas usando o software R (ver Figura Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 1), enquanto as etapas restantes foram executadas nas plataformas online. Os detalhes dos bancos de dados usados neste protocolo (juntamente com os links da web) são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Aquisição de dados

1. Acesse o banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) disponível publicamente no Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia.
2. Pesquise os dados GEO chamados Doença de Alzheimer na caixa de pesquisa.
3. Selecione os principais organismos como Homo sapiens no lado direito.
   NOTA: Os resultados da pesquisa foram dados sobre a doença de Alzheimer em Homo sapiens.
4. Depois de filtrar as informações pesquisadas, baixe os arquivos de dados GSE167490 e GSE183068 , que abrangem features.tsv, barcode.tsv e matrix.mtx para cada amostra de núcleo único individual. Os conjuntos de dados compreenderam 34 amostras de DA originárias do córtex frontal, com uma distribuição igual de 17 amostras masculinas e 17 amostras femininas (Tabela Suplementar 1).

2. Fusão de amostras

1. Configure os caminhos de dados e os nomes de exemplo de acordo com o computador. Importe os 34 exemplos baixados e atribua nomes específicos de gênero aos exemplos usando os nomes de função.
2. Gere objetos Seurat para todas as amostras de maneira processada em lote usando a lista de funções e Read10X, especificando os parâmetros como min.cells = 3 e min.features = 200.
3. Use a função RenameCells para adicionar IDs de exemplo como prefixos aos códigos de barras da célula para preservar os códigos de barras da célula durante o processo de mesclagem. Isso garantiu que cada célula mantivesse sua identidade única e pudesse ser rastreada até sua fonte de amostra original após a fusão.

3. Controle de qualidade (QC)

1. Empregue a função PercentageFeatureSet para calcular as proporções de genes mitocondriais, proporções de genes eritrocitários e proporções de genes de ribossomos para cada célula.
2. Armazene essas proporções calculadas nos metadados usando o operador [[ ]] para anexar essas informações diretamente aos metadados de cada célula.
3. Utilize a função de subconjunto para conduzir a filtragem da célula, especificando os parâmetros como nFeature_RNA > 200, nFeature_RNA < 10000, nCount_RNA < 60000, percent.mt < 10, percent.rb < 5 e percent. HB < 75.
4. Exclua GSM5106107 da análise.

4. Verificação do efeito do lote

1. Execute o processamento de dados.
   1. Normalize os dados usando a função NormalizeData .
   2. Identifique os 2000 principais recursos de variáveis no conjunto de dados usando a função FindVariableFeatures .
   3. Realize a análise de componentes principais (PCA)¹⁷ nos dados usando RunPCA, retendo 50 componentes principais.
   4. Gere uma plotagem de cotovelo usando a função ElbowPlot para determinar o número ideal de dimensões para análise subsequente. Considere as primeiras 50 dimensões.
   5. Dimensione os dados usando ScaleData para garantir que todos os recursos estejam em uma escala comparável.
   6. Identifique os vizinhos mais próximos usando FindNeighbors com base em 30 dimensões.
   7. Aplique o algoritmo UMAP usando RunUMAP para reduzir a dimensionalidade dos dados para 30 dimensões.
2. Visualize os dados processados usando a função DimPlot com o parâmetro de redução definido como umap e o parâmetro group.by definido como orig.ident.
   NOTA: Esta etapa pode gerar um gráfico visualizando os dados no espaço UMAP reduzido, agrupados pelas identidades de célula originais. Ao examinar os gráficos do UMAP, tornou-se evidente que havia uma presença de efeito de lote. O agrupamento ou separação distinta de células com base em seu lote ou origem experimental sugeriu que os lotes experimentais influenciaram os perfis de expressão gênica.

5. Integração de dados

1. Normalize e padronize os dados usando a função SCTransform .
2. Aplique o algoritmo^{de harmonia 18} para integrar os 33 dados de núcleo único restantes. Use o ensaio SCT para integração e defina o número máximo de iterações de harmonia para 20.
3. Use a função FindClusters com um parâmetro de resolução definido como 0,07 para identificar clusters distintos nos dados.
4. Empregue a função RunUMAP com um número especificado de dimensões (dims = 30) para reduzir ainda mais a dimensionalidade dos dados e visualizar os clusters em um espaço de dimensão inferior.

6. Anotação de tipo de célula

1. Coletar os genes marcadores (Tabela Suplementar 2) das células por meio de uma extensa revisão da literatura existente.
2. Após a identificação da heterogeneidade do cluster celular, classifique o tipo de cada célula do cluster pelos genes marcadores expressos especificamente.
3. Apresentar vários tipos celulares com visualização UMAP usando o pacote ggplot2, onde oligodendrócito foi destacado com o código de cores #DB7093, neurônio excitatório com #FF69B4, astrócitos com #1874CD, micróglia com #63B8FF, célula precursora de oligodendrócitos com #DB7093, neurônio inibitório com #FFC0CB e célula endotelial com #FF69B4.
4. Calcule as proporções de cada tipo de célula estratificadas por gênero.

7. Extração de dados de células gliais

1. Extraia dados de astrócitos dos dados em massa integrados usando a função de subconjunto.
2. Extraia dados de microglia dos dados em massa integrados usando a função de subconjunto.
3. Extraia dados de oligodendrócitos dos dados em massa integrados usando a função de subconjunto.

8. Captura de genes diferencialmente expressos (DEGs) específicos do sexo glial

1. Identifique DEGs específicos do sexo de astrócitos usando a função FindMarkers (ident.1 = masculino, ident.2 = feminino, group.by = group.sum, ensaio = RNA) com valores limiares: valor de p < 0,05 e |avg_log2FC| > 30. Rotule os DEGs regulados para cima como Para cima, os DEGs regulados para baixo como Para baixo e o restante como Estável.
   1. Visualize os DEGs usando a função ggplot , com o eixo x representando a diferença em porcentagem entre duas condições (pct.1 - pct.2) e o eixo y representando o avg_log2FC. Os genes regulados positivamente foram destacados usando a cor PaleVioletRed, os genes regulados negativamente com Pink e os genes estáveis com DodgerBlue3.
2. Identifique DEGs específicos do sexo da microglia usando a função FindMarkers (ident.1 = masculino, ident.2 = feminino, group.by = group.sum, ensaio = RNA) com valores limiares: valor de p < 0,05 e |avg_log2FC| > 1. Rotule os DEGs regulados para cima como Para cima, os DEGs regulados para baixo como Para baixo e o restante como Estável.
   1. Visualize os DEGs usando a função ggplot , com o eixo x representando a diferença de porcentagem entre duas condições (pct.1 - pct.2) e o eixo y representando o avg_log2FC. Os genes regulados positivamente foram destacados usando a cor OrangeRed, os genes regulados negativamente com LightSalmon e os genes estáveis com SteelBlue1.
3. Identifique DEGs específicos do sexo de oligodendrócitos usando a função FindMarkers (ident.1 = masculino, ident.2 = feminino, group.by = group.sum, ensaio = RNA) com valores limiares: valor de p < 0,05 e |avg_log2FC| > 10. Rotule os DEGs regulados para cima como Para cima, os DEGs regulados para baixo como Para baixo e o restante como Estável.
   1. Visualize os DEGs usando a função ggplot , com o eixo x representando a diferença em porcentagem entre duas condições (pct.1 - pct.2) e o eixo y representando o avg_log2FC. Os genes regulados positivamente foram destacados usando a cor DeepPink, os genes regulados negativamente com HotPink e os genes estáveis com DeepSkyBlue3.

9. Análises de enriquecimento funcional de DEGs específicos do sexo

1. Realize a análise de enriquecimento de ontologia gênica (GO) em DEGs específicos do sexo para cada tipo de célula glial usando a função enrichGO . Defina os seguintes parâmetros: OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = SYMBOL, ont = ALL, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 e qvalueCutoff = 0,05.
2. Converta os símbolos de genes em IDs de genes correspondentes usando a função bitr. Realize a análise de enriquecimento da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) em DEGs específicos do sexo para cada tipo de célula glial usando a função enrichKEGG . Ajuste as configurações da seguinte maneira: organismo = tem, keyType = kegg, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 e qvalueCutoff = 0,05.

10. Estatísticas de frequência de DEGs gliais nas vias go e kegg, diagramas de Venn de cada DEG glial específico do sexo e construção de rede PPI

1. Calcule a frequência de DEGs específicos do sexo glial nas vias GO e KEGG usando um histograma de frequência.
2. Acesse o banco de dados STRING para construir as redes PPI.
3. Escolha as proteínas múltiplas. Procure a Lista de Nomes na caixa de pesquisa. Defina "Organismos" como Homo sapiens.
4. Revise a lista de proteínas obtidas na pesquisa. Clique em Continuar para prosseguir.
5. Exporte as redes PPI selecionando a opção de download , de preferência no formato PNG com maior resolução.
6. Visualize a distribuição de co-expressão para os principais genes específicos do sexo usando os diagramas de Venn.
7. Identifique o(s) gene(s) compartilhado(s) como gene(s) chave(s) no estudo com base na análise do diagrama de Venn.

11. Construção de rede regulatória multifatorial

1. Acesse o NetworkAnalyst.
2. Clique em Entrada da lista de genes e especifique o organismo como H. sapiens (humano). Defina o tipo de ID como símbolo genético oficial. Digite o nome do gene no campo de pesquisa e clique em Carregar e continuar.
3. Selecione Interações gene-miRNA e escolha miRTarBase v8.0. Confirme a seleção clicando em OK.
4. Prossiga para Interações do gene TF e selecione o banco de dados ENCODE . Clique em OK para confirmar a seleção.
5. Em seguida, navegue até a Rede Co-Reguladora TF-miRNA e clique em OK para prosseguir.
6. Por fim, escolha Proceed para gerar a rede regulatória multifatorial incorporando interações gene-miRNA e interações TF-gene.

12. Análise de MTC de genes e alvos

1. Acesse o banco de dados on-line da Coremine Medical.
2. Digite o nome do gene específico e selecione o gene correspondente com o sufixo gene/proteína, humano na caixa de pesquisa na seção Explorar .
3. Navegue na seção Medicamentos e identifique os TCMs associados aos medicamentos pesquisados.
   NOTA: Os medicamentos estatisticamente significativos foram marcados em azul.
4. Determine os cinco principais TCMs com base em seu valor de "significância" como TCMs terapêuticos.

13. Resumo da pesquisa dos ingredientes da MTC no direcionamento do gene-chave

1. Acesse a Plataforma de Pesquisa Integrativa Baseada em Farmacologia da Medicina Tradicional Chinesa (TCMIP) e a Plataforma de Análise e Banco de Dados de Farmacologia de Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP). Digite os nomes das ervas na barra de pesquisa para recuperar seus ingredientes correspondentes.
2. Recupere os ingredientes no banco de dados PubMed com um limite de tempo até 10 de abril^de 2023. Os termos de busca utilizados incluíram o Nome da Molécula no TCMSP e Componentes Químicos no TCMIP como termos de busca, e foram limitados a artigos publicados em inglês.
3. Resuma e analise as ervas e seus ingredientes correspondentes que atuam na DA.

14. Confirmação da função de tratamento das MTCs direcionadas na especificidade sexual da DA

1. Importe ervas para o TCMIP e navegue até a página de descrição correspondente.
2. Utilize a função Exportar dados e selecione o formato CSV para baixar os termos de enriquecimento de GO - Processo Biológico, GO - Componente Celular, GO - Função Molecular e Caminho do Retomoma.
3. Visualize os termos de enriquecimento baixados para cada erva usando gráficos de barras.

Resultados

Análise de SnRNA-seq de perfis de transcriptoma glial frontal e anotação de tipos de células
No total, foram obtidos 220.095 núcleos e 32.077 genes no córtex frontal de 17 DA masculinas e 17 femininas (Figura 1A). O gráfico UMAP visualizou o total de transcriptomas frontais de núcleos únicos exibindo tipos distintos de núcleos após a análise de redução de dimensão (Figura 1B). Foram mostrados números totais de núcleos anotado...

Discussão

A especificidade de gênero foi identificada na epidemiologia, patologia e manifestação clínica da DA¹⁹. Aqui, confirmamos o potencial mecanismo patológico do "eixo hormônio-sinapse-neurônio" a partir de genes gliais específicos de gênero e vias relacionadas em pacientes com DA. NLGN4Y foi o único gene compartilhado nas três glias e foi escolhido como o biomarcador para a especificidade de gênero da DA. TF e miRNAs que regulam NLGN4Y estavam fortemente ligados a diferenças de gênero e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Database
Coremine Medical database	Jointly developed by Norway, the Chinese Academy of Sciences, the Chinese Academy of Medical Sciences, the National Medical Library of the United States and other institutions		When you explore concepts in CoreMine Medical you access a database that is structured to relate important concepts, ranked by statistical relevance, to your topic. For example, if you type in "Alzheimer disease," in addition to retrieving documents and resources that discuss the disease, you will be able to view networks and lists that show how your query concept is related to other bio-medical concepts. This provides an overview of concepts that relate to your search as well as being an interface for navigating information on these concepts. Weblink: https://coremine.com/medical/
Gene Expression Omnibus (GEO)	National Center for Biotechnology Information in the United States (NCBI)		GEO is a public functional genomics data repository supporting MIAME-compliant data submissions. Array- and sequence-based data are accepted. Tools are provided to help users query and download experiments and curated gene expression profiles. Weblink: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine (TCMIP, version: 2.0)	None		Introduction to the Integrated Pharmacology Based Network Computational Research Platform for Traditional Chinese Medicine [TCMIP v2.0], http://www.tcmip.cn/ ) It is an intelligent data mining platform based on the online database of the Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine (ETCM), which integrates medical big data management and pharmacological computing services. It aims to reveal the scientific connotation of traditional Chinese medicine theory and the scientific value of original thinking in traditional Chinese medicine, summarize and pass on the experience of famous doctors, control the quality of traditional Chinese medicine, explain the principles of traditional Chinese medicine action, research and development of new Chinese medicine, especially the discovery and optimization of modern drug combinations, Provide a strong data foundation and analytical tools. Based on TCMIP v1.0, a comprehensive upgrade is implemented, including five major databases and seven functional modules. Through system integration and module integration, a comprehensive analysis of the multi-level correlation of the "disease syndrome prescription" interaction network can be quickly achieved. As an intelligent data mining platform, TCMIP v2.0 will provide a strong data foundation and analysis platform for revealing the scientific connotation of traditional Chinese medicine theory and the scientific value of original thinking in traditional Chinese medicine, summarizing and inheriting the experience of famous doctors, quality control of traditional Chinese medicine, elucidating the principles of traditional Chinese medicine action, research and development of new traditional Chinese medicine drugs, especially modern drug combination discovery and optimization. Weblink: http://www.tcmip.cn/TCMIP
NetworkAnalyst	None		Networkanalyze is an online visualization analysis platform for gene expression analysis and meta-analysis. It can perform comparative, quantitative, differential and enrichment analysis of gene expression, protein-protein interaction analysis, integration analysis of multiple datasets, and can also draw high-value images such as PCA, protein-protein interaction network diagram, heatmap, volcano diagram, Wayne diagram, etc. Weblink: https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/
PubMed database	National Center for Biotechnology Information in the United States (NCBI)		The Pubmed database is a biomedical literature database maintained by the National Library of Medicine (NLM) in the United States, aimed at providing the latest medical research results to scientists, doctors, researchers, and students worldwide. This database collects biomedical literature from around the world, including journal articles, papers, books, etc. As of now, the Pubmed database has collected over 30 million articles and is continuously updated every week. Weblink: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/
R software	Ross Ihaka and Robert Gentleman		R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment which was developed at Bell Laboratories (formerly AT&T, now Lucent Technologies) by John Chambers and colleagues. R can be considered as a different implementation of S. There are some important differences, but much code written for S runs unaltered under R. Weblink: https://www.r-project.org/
STRING database (STRING, version 11.0)	Swiss Institute of Bioinformatics		STRING is a database of known and predicted protein interactions. The interactions include direct (physical) and indirect (functional) associations Weblink: https://string-db.org/
Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)	Zhejiang Jiuwei Health Co., Ltd		TCMSP is not only a data repository, but also an analysis platform for users to comprehensively study Traditional Chinese Medicines (TCM): including identification of active components, screening of drug targets and generation of compounds-targets-diseases networks, as well as the detailed drug pharmacokinetic information involving drug-likeness (DL), oral bioavailability (OB), blood-brain barrier (BBB),intestinal epithelial permeability (Caco-2), ALogP,fractional negative surface area (FASA-) and number of  H-bond donor/acceptor  (Hdon/Hacc). So far, TCMSP has attracted broad attentions and several groups have published more than 10 papers by using our TCMSP database within about one year. Weblink: https://tcmsp-e.com