Identification de biomarqueurs pour la spécificité du sexe de la maladie d’Alzheimer sur la base des profils de transcriptome glial

Résumé

Cette étude a analysé les transcriptomes à noyau unique de trente-trois personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer (MA), révélant des DEG spécifiques au sexe dans les cellules gliales. L’analyse de l’enrichissement fonctionnel a mis en évidence les voies synaptiques, neuronales et hormonales. Des gènes clés, à savoir NLGN4Y et ses régulateurs, ont été identifiés, et des candidats thérapeutiques potentiels pour la MA spécifique au genre ont été proposés.

Résumé

De nombreux biomarqueurs spécifiques au sexe ont récemment été révélés dans la maladie d’Alzheimer (MA) ; Cependant, les cellules gliales cérébrales ont rarement été signalées. Cette étude a analysé 220 095 transcriptomes à noyau unique du cortex frontal de trente-trois individus atteints de la maladie d’Alzheimer dans la base de données GEO. Des gènes exprimés différentiellement (DEG) spécifiques au sexe ont été identifiés dans les cellules gliales, dont 243 dans les astrocytes, 1 154 dans les microglies et 572 dans les oligodendrocytes. Les analyses d’annotation fonctionnelle de l’ontologie génétique (GO) et les analyses d’enrichissement des voies de l’Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) ont révélé une concentration fonctionnelle dans les voies synaptiques, neuronales et hormonales. Le réseau d’interaction protéine-protéine (IPP) a identifié MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PAKACB, CAMK2D et NLGN4Y dans les astrocytes, TREM2, FOS, APOE, APP et NLGN4Y dans la microglie, et GRIN2A, ITPR2, GNAS et NLGN4Y dans les oligodendrocytes comme gènes clés. NLGN4Y était le seul gène partagé par les trois cellules gliales et a été identifié comme le biomarqueur de la spécificité sexuelle de la MA. Le réseau de corégulation du facteur de transcription génique (TF)-miARN a identifié des régulateurs clés pour NLGN4Y et ses MTC cibles. Ecklonia kurome Okam (Kunbu) et Herba Ephedrae (Mahuang) ont été identifiés, et les effets des ingrédients actifs sur la MA ont été mis en évidence. Enfin, l’analyse de l’enrichissement de Kunbu et Mahuang a suggéré qu’ils pourraient agir comme candidats thérapeutiques pour la spécificité de genre de la MA.

Introduction

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie mondiale à forte incidence, et elle représente 60 à 80 % des démences¹. Malgré sa forte incidence, la pathogenèse mécaniste de la MA n’est pas clairement délimitée, et il n’y a pas eu de traitements efficaces jusqu’à présent². Les principales pathologies de la MA ont été identifiées comme étant l’atrophie neuronale et l’accumulation de débris pathologiques, principalement la protéine Tau associée aux microtubules, et la β-amyloïde (Aβ)^3,4. La pathogenèse de la MA est associée à une autophagie anormale, un stress oxydatif, un dysfonctionnement mitochondrial, une inflammation et un trouble du métabolisme énergétique⁵. Les enquêtes de prévalence ont prouvé que les deux tiers des patients atteints de la maladie d’Alzheimer étaient des femmes⁶. Il existe des différences spécifiques au sexe dans la MA dans l’étiologie, les manifestations cliniques, la prévention et le traitement. Ainsi, la révélation du mécanisme biologique à l’origine des différences spécifiques au sexe dans la MA et le ciblage de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) peuvent potentiellement fournir un cadre théorique plus complet pour comprendre la pathogenèse de la MA et pour guider davantage une stratégie de traitement plus précise.

Les cellules neurogliales, en particulier les microglies, les astrocytes et les oligodendrocytes, contribuent potentiellement à la pathogenèse de la MA. Dans la MA, les microglies sont activées et génétiquement modifiées, ce qui contribue à la réponse inflammatoire, à la phagocytose et à la clairance Aβ ^7,8 ; Les astrocytes sont génétiquement modifiés, ce qui affecte l’activité synaptique, l’homéostasie ionique et le métabolisme de l’énergie et des lipides⁹ ; L’oligodendrocyte est génétiquement modifié avec une spécificité sexuelle, ce qui contribue à la perte neuronale, aux enchevêtrements neurofibrillaires et aux lésions de la substance blanche^10,11.

Dans cette étude, nous avons utilisé le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNA-seq) comme technique supérieure. Par rapport au séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq), le snRNA-seq offre des avantages en termes de richesse des échantillons, d’intégrité du type de cellule et de fiabilité des données^12,13. Le séquençage de l’ARNn a été largement utilisé dans des études axées sur la MA et l’exploration du rôle des cellules gliales 14,15,16. Sa large adoption dans ces domaines de recherche souligne son efficacité à fournir des informations précieuses sur les caractéristiques transcriptionnelles des cellules gliales dans la MA. En tirant parti des avantages du snRNA-seq, les chercheurs ont pu découvrir des informations cruciales concernant l’implication des cellules gliales dans la pathologie de la MA et identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Afin d’explorer les caractéristiques transcriptionnelles neurogliales spécifiques au sexe dans la MA et les MTC potentielles pour la spécificité sexuelle de la MA, cette étude a analysé les données de séquençage de l’ARNnb du cortex frontal des patients atteints de la MA à partir de la base de données publique NCBI GEO. Les gènes exprimés différentiellement (DEG) spécifiques au sexe, l’ontologie des gènes (GO), l’Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG), le réseau d’interaction protéine-protéine (IPP) et le réseau gène-TF-miARN sont analysés plus en détail pour révéler des biomarqueurs clés et une pathogenèse potentielle. Enfin, des MTC potentielles ont été suggérées, et leurs ingrédients actifs ont été présentés à l’aide de tableaux en effectuant une recherche dans les bases de données de Coremine Medical, du TCMIP et du TCMSP.

Protocole

Les étapes 2 à 9 de l’analyse ont été mises en œuvre à l’aide du logiciel R (voir la figure supplémentaire 1 et le fichier supplémentaire 1), tandis que les autres étapes ont été exécutées sur les plateformes en ligne. Les détails des bases de données utilisées dans ce protocole (ainsi que les liens Web) sont fournis dans la Table des matériaux.

1. Acquisition de données

1. Accédez à la base de données GEO (Gene Expression Omnibus) accessible au public au National Center of Biotechnology Information.
2. Recherchez les données GEO nommées maladie d’Alzheimer dans le champ de recherche.
3. Sélectionnez les organismes supérieurs comme Homo sapiens sur le côté droit.
   REMARQUE : Les résultats de la recherche étaient des données sur la maladie d’Alzheimer chez Homo sapiens.
4. Après avoir filtré les informations recherchées, téléchargez les fichiers de données GSE167490 et GSE183068 , qui englobent features.tsv, barcode.tsv et matrix.mtx pour chaque échantillon de noyau. Les ensembles de données comprenaient 34 échantillons de MA provenant du cortex frontal, avec une distribution égale de 17 échantillons masculins et 17 échantillons féminins (tableau supplémentaire 1).

2. Fusion d’échantillons

1. Configurez les chemins d’accès aux données et les noms d’échantillons en conséquence sur l’ordinateur. Importez les 34 exemples téléchargés et attribuez-leur des noms spécifiques au sexe à l’aide des noms de fonction.
2. Générez des objets Seurat pour tous les échantillons de manière à traiter par lots à l’aide de la liste des fonctions et de Read10X, en spécifiant les paramètres min.cells = 3 et min.features = 200.
3. Utilisez la fonction RenameCells pour ajouter des exemples d’ID en tant que préfixes aux codes-barres de cellule afin de conserver les codes-barres de cellule pendant le processus de fusion. Cela a permis de s’assurer que chaque cellule conservait son identité unique et pouvait être retracée jusqu’à sa source d’échantillon d’origine après la fusion.

3. Contrôle de la qualité (QC)

1. Utilisez la fonction PercentageFeatureSet pour calculer les rapports de gènes mitochondriaux, les rapports de gènes érythrocytaires et les rapports de gènes de ribosomes pour chaque cellule.
2. Stockez ces ratios calculés dans les métadonnées à l’aide de l’opérateur [[ ]] pour attacher ces informations directement aux métadonnées de chaque cellule.
3. Utilisez la fonction de sous-ensemble pour effectuer le filtrage des cellules, en spécifiant les paramètres nFeature_RNA > 200, nFeature_RNA < 10000, nCount_RNA < 60000, percent.mt < 10, percent.rb < 5 et percent. HB < 75.
4. Excluez GSM5106107 de l’analyse.

4. Vérification de l’effet de lot

1. Effectuer le traitement des données.
   1. Normalisez les données à l’aide de la fonction NormalizeData .
   2. Identifiez les 2000 principales entités variables du jeu de données à l’aide de la fonction FindVariableFeatures .
   3. Effectuez une analyse en composantes principales (ACP)¹⁷ sur les données à l’aide de RunPCA, en conservant 50 composantes principales.
   4. Générez un tracé en coude à l’aide de la fonction ElbowPlot pour déterminer le nombre optimal de dimensions pour l’analyse ultérieure. Considérez les 50 premières dimensions.
   5. Mettez à l’échelle les données à l’aide de ScaleData pour vous assurer que toutes les fonctionnalités sont à une échelle comparable.
   6. Identifiez les voisins les plus proches à l’aide de FindNeighbors basé sur 30 dimensions.
   7. Appliquez l’algorithme UMAP à l’aide de RunUMAP pour réduire la dimensionnalité des données à 30 dimensions.
2. Visualisez les données traitées à l’aide de la fonction DimPlot avec le paramètre de réduction défini sur umap et le paramètre group.by défini sur orig.ident.
   REMARQUE : Cette étape peut générer un graphique visualisant les données dans l’espace UMAP réduit, regroupées par les identités de cellule d’origine. En examinant les graphiques UMAP, il est devenu évident qu’il y avait une présence d’effet de lot. Le regroupement ou la séparation distincts des cellules en fonction de leur lot ou de leur origine expérimentale suggère que les lots expérimentaux ont influencé les profils d’expression génique.

5. Intégration des données

1. Normalisez et standardisez les données à l’aide de la fonction SCTransform .
2. Appliquez l’algorithme d’harmonie¹⁸ pour intégrer les 33 données restantes de noyaux uniques. Utilisez le test SCT pour l’intégration et définissez le nombre maximal d’itérations d’harmonie sur 20.
3. Utilisez la fonction FindClusters avec un paramètre de résolution défini sur 0,07 pour identifier les clusters distincts dans les données.
4. Utilisez la fonction RunUMAP avec un nombre spécifié de dimensions (dims = 30) pour réduire davantage la dimensionnalité des données et visualiser les clusters dans un espace de dimension inférieure.

6. Annotation du type de cellule

1. Collecter les gènes marqueurs (tableau supplémentaire 2) des cellules grâce à une revue approfondie de la littérature existante.
2. Après l’identification de l’hétérogénéité du cluster cellulaire, classez le type de chaque cellule du cluster par les gènes marqueurs exprimés spécifiquement.
3. Présentez différents types cellulaires avec la visualisation UMAP à l’aide du package ggplot2, où l’oligodendrocyte a été mis en évidence avec le code couleur #DB7093, le neurone excitateur avec le #FF69B4, l’astrocyte avec le #1874CD, la microglie avec #63B8FF, la cellule précurseur d’oligodendrocytes avec #DB7093, le neurone inhibiteur avec #FFC0CB et la cellule endothéliale avec #FF69B4.
4. Calculez les proportions de chaque type de cellule stratifiées par sexe.

7. Extraction des données des cellules gliales

1. Extrayez les données astrocytaires des données en vrac intégrées à l’aide de la fonction de sous-ensemble.
2. Extrayez des données microgliales à partir des données en vrac intégrées à l’aide de la fonction de sous-ensemble.
3. Extrayez les données d’oligodendrocytes à partir des données en vrac intégrées à l’aide de la fonction de sous-ensemble.

8. Capture des gènes exprimés différentiellement (DEG) spécifiques au sexe glial

1. Identifiez les DEG spécifiques au sexe des astrocytes à l’aide de la fonction FindMarkers (ident.1 = mâle, ident.2 = femelle, group.by = group.sum, assay = RNA) avec des valeurs seuils : valeur p < 0,05 et |avg_log2FC| > 30. Étiquetez les DEG régulés à la hausse comme étant vers le haut, les DEG régulés à la baisse comme étant vers le bas et les autres comme étant stables.
   1. Visualisez les DEG à l’aide de la fonction ggplot , l’axe des x représentant la différence de pourcentage entre deux conditions (pct.1 - pct.2) et l’axe des y représentant les avg_log2FC. Les gènes régulés à la hausse ont été mis en évidence en utilisant la couleur PaleVioletRed, les gènes régulés à la baisse avec le rose et les gènes stables avec DodgerBlue3.
2. Identifiez les DEG de la microglie spécifiques au sexe à l’aide de la fonction FindMarkers (ident.1 = mâle, ident.2 = femelle, group.by = group.sum, assay = RNA) avec des valeurs seuils : valeur p < 0,05 et |avg_log2FC| > 1. Étiquetez les DEG régulés à la hausse comme étant vers le haut, les DEG régulés à la baisse comme étant vers le bas et les autres comme étant stables.
   1. Visualisez les DEG à l’aide de la fonction ggplot , l’axe des x représentant la différence de pourcentage entre deux conditions (pct.1 - pct.2) et l’axe des y représentant les avg_log2FC. Les gènes régulés à la hausse ont été mis en évidence en utilisant la couleur OrangeRed, les gènes régulés à la baisse avec LightSalmon et les gènes stables avec SteelBlue1.
3. Identifiez les DEG spécifiques au sexe des oligodendrocytes à l’aide de la fonction FindMarkers (ident.1 = mâle, ident.2 = femelle, group.by = group.sum, assay = RNA) avec des valeurs seuils : valeur p < 0,05 et |avg_log2FC| > 10. Étiquetez les DEG régulés à la hausse comme étant vers le haut, les DEG régulés à la baisse comme étant vers le bas et les autres comme étant stables.
   1. Visualisez les DEG à l’aide de la fonction ggplot , l’axe des x représentant la différence de pourcentage entre deux conditions (pct.1 - pct.2) et l’axe des y représentant le avg_log2FC. Les gènes régulés à la hausse ont été mis en évidence en utilisant la couleur DeepPink, les gènes régulés à la baisse avec HotPink et les gènes stables avec DeepSkyBlue3.

9. Analyses d’enrichissement fonctionnel des DEG spécifiques au sexe

1. Effectuez une analyse d’enrichissement en ontologie génétique (GO) sur des DEG spécifiques au sexe pour chaque type de cellule gliale à l’aide de la fonction enrichGO . Définissez les paramètres suivants : OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = SYMBOL, ont = ALL, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 et qvalueCutoff = 0,05.
2. Convertissez les symboles de gènes en ID de gènes correspondants à l’aide de la fonction bitr. Effectuez une analyse d’enrichissement de l’Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) sur les DEG spécifiques au sexe pour chaque type de cellule gliale à l’aide de la fonction enrichKEGG . Ajustez les paramètres comme suit : organism = has, keyType = kegg, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 et qvalueCutoff = 0,05.

10. Statistiques de fréquence des DEG gliaux dans les voies go et kegg, diagrammes de Venn de chaque DEG glial spécifique au sexe et construction du réseau PPI

1. Calculez la fréquence des DEG gliales spécifiques au sexe dans les voies GO et KEGG à l’aide d’un histogramme de fréquence.
2. Accédez à la base de données STRING pour construire les réseaux PPI.
3. Choisissez l’option Protéines multiples. Recherchez la liste des noms dans la zone de recherche. Définir « Organismes » comme Homo sapiens.
4. Examinez la liste des protéines obtenues à partir de la recherche. Cliquez sur Continuer pour continuer.
5. Exportez les réseaux PPI en sélectionnant l’option de téléchargement , de préférence au format PNG avec une résolution plus élevée.
6. Visualisez la distribution de la co-expression pour les principaux gènes spécifiques au sexe à l’aide des diagrammes de Venn.
7. Identifiez le(s) gène(s) partagé(s) en tant que(s) gène(s) clé(s) dans l’étude en fonction de l’analyse du diagramme de Venn.

11. Construction de réseaux réglementaires multifactoriels

1. Accédez à NetworkAnalyst.
2. Cliquez sur Entrée de la liste des gènes et spécifiez l’organisme comme H. sapiens (humain). Définissez le type d’ID comme symbole de gène officiel. Entrez le nom du gène dans le champ de recherche, puis cliquez sur Télécharger et continuer.
3. Sélectionnez Interactions gène-miARN et choisissez miRTarBase v8.0. Confirmez la sélection en cliquant sur OK.
4. Passez à la section Interactions entre les gènes TF et sélectionnez la base de données ENCODE . Cliquez sur OK pour confirmer la sélection.
5. Ensuite, accédez à TF-miRNA Coregulatory Network et cliquez sur OK pour continuer.
6. Enfin, choisissez Procéder à la génération du réseau de régulation multifactoriel intégrant les interactions gène-miARN et les interactions TF-gène.

12. Analyse de la MTC des gènes et des cibles

1. Accédez à la base de données en ligne de Coremine Medical.
2. Entrez le nom du gène spécifique et sélectionnez le gène correspondant avec le suffixe gène/protéine, humain dans le champ de recherche sous la section Explorer .
3. Naviguez dans la section Drogues et identifiez les MTC associées aux drogues recherchées.
   REMARQUE : Les médicaments statistiquement significatifs ont été marqués en bleu.
4. Déterminez les cinq principales MTC en fonction de leur valeur « significative » en tant que MTC thérapeutiques.

13. Résumé de la recherche sur les ingrédients de la MTC dans le ciblage d’un gène clé

1. Accédez à la Plateforme de recherche en pharmacologie intégrative de la médecine traditionnelle chinoise (TCMIP) et à la Plateforme de base de données et d’analyse de pharmacologie des systèmes de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP). Entrez les noms des herbes dans la barre de recherche pour récupérer leurs ingrédients correspondants.
2. Récupérez les ingrédients dans la base de données PubMed avec une limite de temps allant jusqu’au 10 avril 2023. Les termes de recherche utilisés comprenaient le nom de la molécule dans TCMSP et les composants chimiques dans TCMIP comme termes de recherche, et se limitaient aux articles publiés en anglais.
3. Résumer et analyser les herbes et leurs ingrédients correspondants agissant sur la DA.

14. Confirmation du ciblage de la fonction de traitement des MTC dans la spécificité sexuelle de la MA

1. Importez des herbes dans le MITCT et accédez à la page de description correspondante.
2. Utilisez la fonction Exporter les données et sélectionnez le format CSV pour télécharger les termes d’enrichissement de GO - Biological Process, GO - Cellular Component, GO - Molecular Function et Reactome Pathway.
3. Visualisez les termes d’enrichissement téléchargés pour chaque plante à l’aide de diagrammes à barres.

Résultats

Analyse SnRNA-seq des profils de transcriptome glial frontal et annotation des types cellulaires
Au total, 220 095 noyaux et 32 077 gènes dans le cortex frontal de 17 MA mâles et 17 DA femelles ont été obtenus (Figure 1A). Le graphique UMAP a visualisé l’ensemble des transcriptomes frontaux des noyaux uniques affichant des types distincts de noyaux après analyse de réduction de dimension (Figure 1B). Le nombre total de noyaux annoté...

Discussion

La spécificité du genre a été identifiée dans l’épidémiologie, la pathologie et la manifestation clinique de la^COVID-19. Ici, nous avons confirmé le mécanisme pathologique potentiel de « l’axe hormone-synapse-neurone » à partir de gènes gliaux spécifiques au sexe et des voies associées chez les patients atteints de MA. NLGN4Y était le seul gène partagé dans les trois cellules gliales et a été choisi comme biomarqueur de la spécificité sexuelle de la MA. TF et les miARN r?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Database
Coremine Medical database	Jointly developed by Norway, the Chinese Academy of Sciences, the Chinese Academy of Medical Sciences, the National Medical Library of the United States and other institutions		When you explore concepts in CoreMine Medical you access a database that is structured to relate important concepts, ranked by statistical relevance, to your topic. For example, if you type in "Alzheimer disease," in addition to retrieving documents and resources that discuss the disease, you will be able to view networks and lists that show how your query concept is related to other bio-medical concepts. This provides an overview of concepts that relate to your search as well as being an interface for navigating information on these concepts. Weblink: https://coremine.com/medical/
Gene Expression Omnibus (GEO)	National Center for Biotechnology Information in the United States (NCBI)		GEO is a public functional genomics data repository supporting MIAME-compliant data submissions. Array- and sequence-based data are accepted. Tools are provided to help users query and download experiments and curated gene expression profiles. Weblink: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine (TCMIP, version: 2.0)	None		Introduction to the Integrated Pharmacology Based Network Computational Research Platform for Traditional Chinese Medicine [TCMIP v2.0], http://www.tcmip.cn/ ) It is an intelligent data mining platform based on the online database of the Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine (ETCM), which integrates medical big data management and pharmacological computing services. It aims to reveal the scientific connotation of traditional Chinese medicine theory and the scientific value of original thinking in traditional Chinese medicine, summarize and pass on the experience of famous doctors, control the quality of traditional Chinese medicine, explain the principles of traditional Chinese medicine action, research and development of new Chinese medicine, especially the discovery and optimization of modern drug combinations, Provide a strong data foundation and analytical tools. Based on TCMIP v1.0, a comprehensive upgrade is implemented, including five major databases and seven functional modules. Through system integration and module integration, a comprehensive analysis of the multi-level correlation of the "disease syndrome prescription" interaction network can be quickly achieved. As an intelligent data mining platform, TCMIP v2.0 will provide a strong data foundation and analysis platform for revealing the scientific connotation of traditional Chinese medicine theory and the scientific value of original thinking in traditional Chinese medicine, summarizing and inheriting the experience of famous doctors, quality control of traditional Chinese medicine, elucidating the principles of traditional Chinese medicine action, research and development of new traditional Chinese medicine drugs, especially modern drug combination discovery and optimization. Weblink: http://www.tcmip.cn/TCMIP
NetworkAnalyst	None		Networkanalyze is an online visualization analysis platform for gene expression analysis and meta-analysis. It can perform comparative, quantitative, differential and enrichment analysis of gene expression, protein-protein interaction analysis, integration analysis of multiple datasets, and can also draw high-value images such as PCA, protein-protein interaction network diagram, heatmap, volcano diagram, Wayne diagram, etc. Weblink: https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/
PubMed database	National Center for Biotechnology Information in the United States (NCBI)		The Pubmed database is a biomedical literature database maintained by the National Library of Medicine (NLM) in the United States, aimed at providing the latest medical research results to scientists, doctors, researchers, and students worldwide. This database collects biomedical literature from around the world, including journal articles, papers, books, etc. As of now, the Pubmed database has collected over 30 million articles and is continuously updated every week. Weblink: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/
R software	Ross Ihaka and Robert Gentleman		R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment which was developed at Bell Laboratories (formerly AT&T, now Lucent Technologies) by John Chambers and colleagues. R can be considered as a different implementation of S. There are some important differences, but much code written for S runs unaltered under R. Weblink: https://www.r-project.org/
STRING database (STRING, version 11.0)	Swiss Institute of Bioinformatics		STRING is a database of known and predicted protein interactions. The interactions include direct (physical) and indirect (functional) associations Weblink: https://string-db.org/
Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)	Zhejiang Jiuwei Health Co., Ltd		TCMSP is not only a data repository, but also an analysis platform for users to comprehensively study Traditional Chinese Medicines (TCM): including identification of active components, screening of drug targets and generation of compounds-targets-diseases networks, as well as the detailed drug pharmacokinetic information involving drug-likeness (DL), oral bioavailability (OB), blood-brain barrier (BBB),intestinal epithelial permeability (Caco-2), ALogP,fractional negative surface area (FASA-) and number of  H-bond donor/acceptor  (Hdon/Hacc). So far, TCMSP has attracted broad attentions and several groups have published more than 10 papers by using our TCMSP database within about one year. Weblink: https://tcmsp-e.com