Identifizierung von Biomarkern für die Geschlechtsspezifität der Alzheimer-Krankheit auf der Grundlage der glialen Transkriptomprofile

Zusammenfassung

In dieser Studie wurden Einzelkern-Transkriptome von dreiunddreißig Personen mit Alzheimer-Krankheit (AD) analysiert und geschlechtsspezifische DEGs in Gliazellen aufgedeckt. Die Analyse der funktionellen Anreicherung hob synaptische, neuronale und hormonbezogene Signalwege hervor. Schlüsselgene, nämlich NLGN4Y und seine Regulatoren, wurden identifiziert und potenzielle therapeutische Kandidaten für geschlechtsspezifische AD vorgeschlagen.

Zusammenfassung

Viele geschlechtsspezifische Biomarker wurden kürzlich bei der Alzheimer-Krankheit (AD) entdeckt; Über zerebrale Gliazellen wurde jedoch selten berichtet. Diese Studie analysierte 220.095 Einzelkern-Transkriptome aus dem frontalen Kortex von dreiunddreißig AD-Personen in der GEO-Datenbank. Geschlechtsspezifische differentiell exprimierte Gene (DEGs) wurden in Gliazellen identifiziert, darunter 243 in Astrozyten, 1.154 in Mikroglia und 572 in Oligodendrozyten. Funktionelle Annotationsanalysen der Gene Ontology (GO) und Analysen der Anreicherung des Signalwegs in der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) zeigten die funktionelle Konzentration in synaptischen, neuralen und hormonbezogenen Signalwegen. Das Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) identifizierte MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PAKACB, CAMK2D und NLGN4Y in Astrozyten, TREM2, FOS, APOE, APP und NLGN4Y in Mikroglia und GRIN2A, ITPR2, GNAS und NLGN4Y in Oligodendrozyten als Schlüsselgene. NLGN4Y war das einzige Gen, das von den drei Gliazellen gemeinsam genutzt wurde, und wurde als Biomarker für die Geschlechtsspezifität von Alzheimer identifiziert. Das Gen-Transkriptionsfaktor (TF)-miRNA-koregulatorische Netzwerk identifizierte Schlüsselregulatoren für NLGN4Y und seine Ziel-TCMs. Ecklonia kurome Okam (Kunbu) und Herba Ephedrae (Mahuang) wurden identifiziert und die Auswirkungen der Wirkstoffe auf AD wurden gezeigt. Schließlich deutete die Anreicherungsanalyse von Kunbu und Mahuang darauf hin, dass sie als therapeutische Kandidaten für die Geschlechtsspezifität von AD fungieren könnten.

Einleitung

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine globale Krankheit mit hoher Inzidenz, die 60 % bis 80 % der Demenzerkrankungen ausmacht¹. Trotz der hohen Inzidenz ist die mechanistische Pathogenese der Alzheimer-Krankheit nicht klar abgegrenzt, und es gibt bisher keine wirksamen Therapeutika². Die Hauptpathologien bei AD wurden als neuronale Atrophie und die Anhäufung von pathologischen Trümmern, hauptsächlich Mikrotubuli-assoziiertem Protein Tau, und β-Amyloid (Aβ)^3,4 identifiziert. Die Pathogenese der Alzheimer-Krankheit ist mit abnormaler Autophagie, oxidativem Stress, mitochondrialer Dysfunktion, Entzündung und Störung des Energiestoffwechsels verbunden⁵. Prävalenzerhebungen zeigten, dass zwei Drittel der Alzheimer-Patienten Frauen waren⁶. Geschlechtsspezifische Unterschiede bei AD bestehen in der Ätiologie, den klinischen Manifestationen, der Prävention und der Behandlung. Daher kann die Aufdeckung des biologischen Mechanismus, der geschlechtsspezifische Unterschiede bei AD verursacht, und die Ausrichtung auf die traditionelle chinesische Medizin (TCM) möglicherweise einen umfassenderen theoretischen Rahmen bieten, um die Pathogenese der AD zu verstehen und eine genaue Behandlungsstrategie zu leiten.

Neurogliazellen, insbesondere Mikroglia, Astrozyten und Oligodendrozyten, tragen möglicherweise zur Pathogenese der Alzheimer-Krankheit bei. Bei der Alzheimer-Krankheit werden Mikroglia aktiviert und genetisch verändert, was zur Entzündungsreaktion, Phagozytose und Aβ-Clearance beiträgt ^7,8; Astrozyten sind genetisch verändert, was sich auf die synaptische Aktivität, die Ionenhomöostase sowie den Energie- und Fettstoffwechsel auswirkt⁹; Oligodendrozyten sind genetisch mit Geschlechtsspezifität verändert, was zu neuronalem Verlust, neurofibrillären Verwicklungen und Läsionen der weißen Substanz beiträgt^10,11.

In dieser Studie haben wir die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) als überlegene Technik eingesetzt. Im Vergleich zur Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bietet snRNA-seq Vorteile in Bezug auf die Probenvielfalt, die Integrität des Zelltyps und die Zuverlässigkeit der Daten^12,13. SnRNA-seq wurde ausgiebig in Studien eingesetzt, die sich auf Alzheimer konzentrierten und die Rolle von Gliazellen ^{untersuchten 14,15,16}. Seine breite Akzeptanz in diesen Forschungsbereichen unterstreicht seine Wirksamkeit bei der Bereitstellung wertvoller Einblicke in die transkriptionellen Eigenschaften von Gliazellen bei AD. Durch die Nutzung der Vorteile von snRNA-seq konnten Forscher wichtige Informationen über die Beteiligung von Gliazellen an der Alzheimer-Pathologie aufdecken und potenzielle therapeutische Ziele identifizieren. Um geschlechtsspezifische neurogliale Transkriptionsmerkmale bei AD und potenzielle TCMs für die Geschlechtsspezifität von AD zu untersuchen, analysierte diese Studie snRNA-seq-Daten aus dem frontalen Kortex von AD-Patienten aus der öffentlichen NCBI GEO-Datenbank. Geschlechtsspezifische differentiell exprimierte Gene (DEGs), Genontologie (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) und Gen-TF-miRNA-Netzwerk werden weiter analysiert, um wichtige Biomarker und potenzielle Pathogenese aufzudecken. Schließlich wurden potenzielle TCMs vorgeschlagen und ihre Wirkstoffe durch Durchsuchen der Datenbanken Coremine Medical, TCMIP und TCMSP mit Tabellen dargestellt.

Protokoll

Die Schritte 2 bis 9 der Analyse wurden mit der Software R implementiert (siehe Ergänzende Abbildung 1 und Ergänzende Datei 1), während die restlichen Schritte auf den Online-Plattformen ausgeführt wurden. Die Einzelheiten zu den Datenbanken, die in diesem Protokoll verwendet werden (zusammen mit den Weblinks), sind in der Materialtabelle enthalten.

1. Datenerfassung

1. Greifen Sie auf die öffentlich zugängliche Datenbank Gene Expression Omnibus (GEO) des National Center of Biotechnology Information zu.
2. Suchen Sie im Suchfeld nach den GEO-Daten mit dem Namen Alzheimer-Krankheit .
3. Wählen Sie auf der rechten Seite die Top-Organismen als Homo sapiens aus.
   HINWEIS: Bei den Suchergebnissen handelte es sich um Daten zur Alzheimer-Krankheit beim Homo sapiens.
4. Nachdem Sie die gesuchten Informationen gefiltert haben, laden Sie die GSE167490 - und GSE183068 Datendateien herunter, die features.tsv, barcode.tsv und matrix.mtx für jede einzelne Kernprobe umfassen. Die Datensätze umfassten 34 Proben von Alzheimer, die aus dem frontalen Kortex stammten, mit einer gleichen Verteilung von 17 männlichen und 17 weiblichen Proben (Ergänzende Tabelle 1).

2. Zusammenführung von Proben

1. Konfigurieren Sie die Datenpfade und Beispielnamen auf dem Computer entsprechend. Importieren Sie die 34 heruntergeladenen Beispiele und weisen Sie den Beispielen mithilfe der Funktionsnamen geschlechtsspezifische Namen zu.
2. Generieren Sie Seurat-Objekte für alle Proben in einer Batch-Verarbeitungsweise mit der Funktionsliste und Read10X, wobei Sie die Parameter als min.cells = 3 und min.features = 200 angeben.
3. Verwenden Sie die Funktion "Zellen umbenennen", um den Zellen-Barcodes Proben-IDs als Präfixe hinzuzufügen und so die Zellen-Barcodes während des Zusammenführungsprozesses beizubehalten. Dadurch wurde sichergestellt, dass jede Zelle ihre einzigartige Identität behielt und nach der Verschmelzung zu ihrer ursprünglichen Probenquelle zurückverfolgt werden konnte.

3. Qualitätskontrolle (QC)

1. Verwenden Sie die PercentageFeatureSet-Funktion , um die mitochondrialen Genverhältnisse, die Erythrozyten-Genverhältnisse und die Ribosomen-Genverhältnisse für jede Zelle zu berechnen.
2. Speichern Sie diese berechneten Verhältnisse in den Metadaten, indem Sie den Operator [[ ]] verwenden, um diese Informationen direkt an die Metadaten der einzelnen Zellen anzuhängen.
3. Verwenden Sie die Teilmengenfunktion , um die Zellfiltration durchzuführen, und geben Sie die Parameter als nFeature_RNA > 200, nFeature_RNA < 10000, nCount_RNA < 60000, percent.mt < 10, percent.rb < 5 und percent an. HB < 75.
4. Schließen Sie GSM5106107 aus der Analyse aus.

4. Prüfung der Batch-Wirkung

1. Führen Sie die Datenverarbeitung durch.
   1. Normalisieren Sie die Daten mit der NormalizeData-Funktion .
   2. Identifizieren Sie die 2000 wichtigsten variablen Features im Dataset mit der Funktion FindVariableFeatures .
   3. Führen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (PCA)¹⁷ für die Daten mit RunPCA durch, wobei 50 Hauptkomponenten beibehalten werden.
   4. Generieren Sie ein Bogendiagramm mit der Funktion EllbogenPlot, um die optimale Anzahl von Dimensionen für die nachfolgende Analyse zu bestimmen. Betrachten Sie die ersten 50 Dimensionen.
   5. Skalieren Sie die Daten mit ScaleData, um sicherzustellen, dass sich alle Features in einem vergleichbaren Maßstab befinden.
   6. Identifizieren Sie die nächsten Nachbarn mit FindNeighbors basierend auf 30 Dimensionen.
   7. Wenden Sie den UMAP-Algorithmus mithilfe von RunUMAP an, um die Dimensionalität der Daten auf 30 Dimensionen zu reduzieren.
2. Visualisieren Sie die verarbeiteten Daten mit der DimPlot-Funktion , wobei der Reduktionsparameter auf umap und der Parameter group.by auf orig.ident eingestellt ist.
   HINWEIS: In diesem Schritt kann ein Diagramm generiert werden, in dem die Daten im reduzierten UMAP-Raum visualisiert werden, gruppiert nach den ursprünglichen Zellidentitäten. Bei der Untersuchung der UMAP-Diagramme wurde deutlich, dass ein Batch-Effekt vorhanden war. Die unterschiedliche Clusterbildung oder Trennung von Zellen basierend auf ihrer Charge oder experimentellen Herkunft deutet darauf hin, dass die experimentellen Chargen die Genexpressionsprofile beeinflusst haben.

5. Datenintegration

1. Normalisieren und standardisieren Sie die Daten mit der Funktion SCTransform .
2. Wenden Sie den Harmoniealgorithmus¹⁸ an, um die verbleibenden 33 Einzelkerndaten zu integrieren. Verwenden Sie den SCT-Assay für die Integration und legen Sie die maximale Anzahl von Harmonie-Iterationen auf 20 fest.
3. Verwenden Sie die Funktion FindClusters mit einem Auflösungsparameter , der auf 0,07 festgelegt ist, um unterschiedliche Cluster innerhalb der Daten zu identifizieren.
4. Verwenden Sie die RunUMAP-Funktion mit einer angegebenen Anzahl von Dimensionen (Dims = 30), um die Dimensionalität der Daten weiter zu reduzieren und die Cluster in einem niedrigdimensionalen Raum zu visualisieren.

6. Anmerkung zum Zelltyp

1. Sammeln Sie die Markergene (Ergänzende Tabelle 2) von Zellen durch eine umfassende Überprüfung der vorhandenen Literatur.
2. Nach der Identifizierung der zellulären Clusterheterogenität ist der Typ jeder Clusterzelle nach den spezifisch exprimierten Markergenen zu klassifizieren.
3. Präsentieren Sie verschiedene Zelltypen mit UMAP-Visualisierung unter Verwendung des ggplot2-Pakets, wobei Oligodendrozyten mit dem Farbcode #DB7093, exzitatorisches Neuron mit #FF69B4, Astrozyten mit #1874CD, Mikroglia mit #63B8FF, Oligodendrozyten-Vorläuferzelle mit #DB7093, inhibitorisches Neuron mit #FFC0CB und Endothelzelle mit #FF69B4 hervorgehoben wurden.
4. Berechnen Sie die Anteile der einzelnen Zelltypen, geschichtet nach Geschlecht.

7. Extraktion von Gliazellendaten

1. Extrahieren Sie Astrozytendaten aus den integrierten Massendaten mit der Teilmengenfunktion.
2. Extrahieren Sie Mikroglia-Daten aus den integrierten Massendaten mit der Subset-Funktion.
3. Extrahieren Sie Oligodendrozytendaten aus den integrierten Massendaten mit der Teilmengenfunktion.

8. Gliageschlechtsspezifische differentiell exprimierte Gene (DEGs), die die Gene erfassen

1. Identifizieren Sie geschlechtsspezifische DEGs von Astrozyten mit der FindMarkers-Funktion (Ident.1 = männlich, Ident.2 = weiblich, group.by = group.sum, Assay = RNA) mit Schwellenwerten: p-Wert < 0,05 und |avg_log2FC| 30. >. Kennzeichnen Sie die hochregulierten DEGs als "Up", die herunterregulierten DEGs als "Down" und den Rest als "Stable".
   1. Visualisieren Sie die DEGs mit der ggplot-Funktion , wobei die x-Achse die prozentuale Differenz zwischen zwei Bedingungen (pct.1 - pct.2) darstellt und die y-Achse die avg_log2FC darstellt. Die hochregulierten Gene wurden mit der Farbe PaleVioletRed, die herunterregulierten Gene mit Pink und die stabilen Gene mit DodgerBlue3 hervorgehoben.
2. Identifizieren Sie geschlechtsspezifische DEGs von Mikroglia mit der FindMarkers-Funktion (Ident.1 = männlich, Ident.2 = weiblich, group.by = group.sum, Assay = RNA) mit Schwellenwerten: p-Wert < 0,05 und |avg_log2FC| > 1. Kennzeichnen Sie die hochregulierten DEGs als "Up", die herunterregulierten DEGs als "Down" und den Rest als "Stable".
   1. Visualisieren Sie die DEGs mit der ggplot-Funktion , wobei die x-Achse die prozentuale Differenz zwischen zwei Bedingungen (pct.1 - pct.2) darstellt und die y-Achse die avg_log2FC darstellt. Die hochregulierten Gene wurden mit der Farbe OrangeRed, die herunterregulierten Gene mit LightSalmon und die stabilen Gene mit SteelBlue1 hervorgehoben.
3. Identifizierung geschlechtsspezifischer DEGs von Oligodendrozyten mit der FindMarkers-Funktion (Ident.1 = männlich, Ident.2 = weiblich, group.by = group.sum, Assay = RNA) mit Schwellenwerten: p-Wert < 0,05 und |avg_log2FC| > 10. Kennzeichnen Sie die hochregulierten DEGs als "Up", die herunterregulierten DEGs als "Down" und den Rest als "Stable".
   1. Visualisieren Sie die DEGs mit der ggplot-Funktion , wobei die x-Achse die prozentuale Differenz zwischen zwei Bedingungen (pct.1 - pct.2) darstellt und die y-Achse die avg_log2FC darstellt. Die hochregulierten Gene wurden mit der Farbe DeepPink, die herunterregulierten Gene mit HotPink und die stabilen Gene mit DeepSkyBlue3 hervorgehoben.

9. Funktionelle Anreicherungsanalysen geschlechtsspezifischer DEGs

1. Führen Sie eine Gen-Ontologie-Anreicherungsanalyse (GO) für geschlechtsspezifische DEGs für jeden Gliazelltyp mit der enrichGO-Funktion durch. Legen Sie die folgenden Parameter fest: OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = SYMBOL, ont = ALL, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 und qvalueCutoff = 0,05.
2. Wandeln Sie die Gensymbole mit der Funktion bitr in entsprechende Gen-IDs um. Durchführung einer Anreicherungsanalyse der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) an geschlechtsspezifischen DEGs für jeden Gliazelltyp unter Verwendung der enrichKEGG-Funktion . Passen Sie die Einstellungen wie folgt an: organism = has, keyType = kegg, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0.01 und qvalueCutoff = 0.05.

10. Häufigkeitsstatistiken von glialen DEGs in go- und kegg-Signalwegen, Venn-Diagramme der einzelnen glialen geschlechtsspezifischen DEGs und PPI-Netzwerkkonstruktion

1. Berechnen Sie die Häufigkeit von glialen geschlechtsspezifischen DEGs in GO- und KEGG-Signalwegen mit Hilfe eines Häufigkeitshistogramms.
2. Greifen Sie auf die STRING-Datenbank zu, um die PPI-Netzwerke zu erstellen.
3. Wählen Sie die Mehrere Proteine. Suchen Sie im Suchfeld nach der Liste der Namen . Setze "Organismen" auf Homo sapiens.
4. Überprüfen Sie die Liste der Proteine, die Sie bei der Suche erhalten haben. Klicken Sie auf Weiter , um fortzufahren.
5. Exportieren Sie die PPI-Netzwerke, indem Sie die Download-Option auswählen, vorzugsweise im PNG-Format mit höherer Auflösung.
6. Visualisieren Sie die Verteilung der Co-Expression für die wichtigsten geschlechtsspezifischen Gene mithilfe der Venn-Diagramme.
7. Identifizieren Sie das/die gemeinsame(n) Gen(e) als Schlüsselgen(e) in der Studie auf der Grundlage der Venn-Diagramm-Analyse.

11. Aufbau eines multifaktoriellen Regulierungsnetzes

1. Greifen Sie auf NetworkAnalyst zu.
2. Klicken Sie auf Gene List Input und geben Sie als Organismus H. sapiens (Mensch) an. Legen Sie den ID-Typ als offizielles Gensymbol fest. Geben Sie den Gennamen in das Suchfeld ein und klicken Sie dann auf Hochladen und fortfahren.
3. Wählen Sie Gen-miRNA-Wechselwirkungen und dann miRTarBase v8.0 aus. Bestätigen Sie die Auswahl mit einem Klick auf OK.
4. Fahren Sie mit TF-Gen-Interaktionen fort und wählen Sie die ENCODE-Datenbank aus. Klicken Sie auf OK , um die Auswahl zu bestätigen.
5. Navigieren Sie als Nächstes zu TF-miRNA Coregulatory Network und klicken Sie auf OK , um fortzufahren.
6. Wählen Sie abschließend Proceed (Weiter ) aus, um das multifaktorielle regulatorische Netzwerk zu generieren, das Gen-miRNA-Interaktionen und TF-Gen-Interaktionen umfasst.

12. Gen- und Ziel-TCM-Analyse

1. Greifen Sie auf die Online-Datenbank von Coremine Medical zu.
2. Geben Sie den spezifischen Gennamen ein und wählen Sie das entsprechende Gen mit dem Suffix Gen/Protein, human in das Suchfeld unter dem Abschnitt Explore aus.
3. Navigieren Sie zum Abschnitt Drogen und identifizieren Sie die TCMs, die mit den gesuchten Medikamenten verbunden sind.
   HINWEIS: Statistisch signifikante Arzneimittel wurden blau markiert.
4. Bestimmen Sie die fünf besten TCMs auf der Grundlage ihres "Signifikanz"-Wertes als therapeutische TCM.

13. Zusammenfassung der Forschung über TCM-Inhaltsstoffe bei der Ausrichtung auf Schlüsselgene

1. Greifen Sie auf die Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine (TCMIP) und die Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) zu. Geben Sie die Namen der Kräuter in die Suchleiste ein, um die entsprechenden Zutaten abzurufen.
2. Rufen Sie die Inhaltsstoffe in der PubMed-Datenbank mit einer Frist bis zum 10. April 2023 ab. Die verwendeten Suchbegriffe umfassten den Molecule Name in TCMSP und Chemical Components in TCMIP als Suchbegriffe und beschränkten sich auf englischsprachige Artikel.
3. Fassen Sie die Kräuter und ihre entsprechenden Inhaltsstoffe, die auf AD wirken, zusammen und analysieren Sie sie.

14. Bestätigung der Ausrichtung der Behandlungsfunktion von TCMs auf die Geschlechtsspezifität der AD

1. Importieren Sie Kräuter in das TCMIP und navigieren Sie zur entsprechenden Beschreibungsseite.
2. Verwenden Sie die Funktion Daten exportieren und wählen Sie das CSV-Format aus, um die Anreicherungsbedingungen von GO - Biologischer Prozess, GO - Zelluläre Komponente, GO - Molekulare Funktion und Reaktomweg herunterzuladen.
3. Visualisieren Sie die heruntergeladenen Anreicherungsbegriffe für jedes Kraut mithilfe von Balkendiagrammen.

Ergebnisse

SnRNA-seq-Analyse von frontalen glialen Transkriptomprofilen und die Annotation von Zelltypen
Insgesamt wurden 220.095 Kerne und 32.077 Gene im frontalen Kortex von 17 männlichen und 17 weiblichen AD gewonnen (Abbildung 1A). Das UMAP-Diagramm visualisierte die Gesamtzahl der frontalen Einzelkerntranskriptome, die nach der Dimensionsreduktionsanalyse unterschiedliche Kerntypen zeigten (Abbildung 1B). Es wurde eine Gesamtanzahl der annotierten...

Diskussion

Geschlechtsspezifität wurde in der Epidemiologie, Pathologie und klinischen Manifestation von^{AD 19} identifiziert. Hier konnten wir den möglichen pathologischen Mechanismus der "Hormon-Synapse-Neuron-Achse" aus geschlechtsspezifischen Glia-Genen und verwandten Signalwegen bei Alzheimer-Patienten bestätigen. NLGN4Y war das einzige gemeinsame Gen in den drei Gliazellen und wurde als Biomarker für die Geschlechtsspezifität von Alzheimer ausgewählt. TF und miRNAs, die NLGN4Y regulieren, waren sta...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Database
Coremine Medical database	Jointly developed by Norway, the Chinese Academy of Sciences, the Chinese Academy of Medical Sciences, the National Medical Library of the United States and other institutions		When you explore concepts in CoreMine Medical you access a database that is structured to relate important concepts, ranked by statistical relevance, to your topic. For example, if you type in "Alzheimer disease," in addition to retrieving documents and resources that discuss the disease, you will be able to view networks and lists that show how your query concept is related to other bio-medical concepts. This provides an overview of concepts that relate to your search as well as being an interface for navigating information on these concepts. Weblink: https://coremine.com/medical/
Gene Expression Omnibus (GEO)	National Center for Biotechnology Information in the United States (NCBI)		GEO is a public functional genomics data repository supporting MIAME-compliant data submissions. Array- and sequence-based data are accepted. Tools are provided to help users query and download experiments and curated gene expression profiles. Weblink: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine (TCMIP, version: 2.0)	None		Introduction to the Integrated Pharmacology Based Network Computational Research Platform for Traditional Chinese Medicine [TCMIP v2.0], http://www.tcmip.cn/ ) It is an intelligent data mining platform based on the online database of the Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine (ETCM), which integrates medical big data management and pharmacological computing services. It aims to reveal the scientific connotation of traditional Chinese medicine theory and the scientific value of original thinking in traditional Chinese medicine, summarize and pass on the experience of famous doctors, control the quality of traditional Chinese medicine, explain the principles of traditional Chinese medicine action, research and development of new Chinese medicine, especially the discovery and optimization of modern drug combinations, Provide a strong data foundation and analytical tools. Based on TCMIP v1.0, a comprehensive upgrade is implemented, including five major databases and seven functional modules. Through system integration and module integration, a comprehensive analysis of the multi-level correlation of the "disease syndrome prescription" interaction network can be quickly achieved. As an intelligent data mining platform, TCMIP v2.0 will provide a strong data foundation and analysis platform for revealing the scientific connotation of traditional Chinese medicine theory and the scientific value of original thinking in traditional Chinese medicine, summarizing and inheriting the experience of famous doctors, quality control of traditional Chinese medicine, elucidating the principles of traditional Chinese medicine action, research and development of new traditional Chinese medicine drugs, especially modern drug combination discovery and optimization. Weblink: http://www.tcmip.cn/TCMIP
NetworkAnalyst	None		Networkanalyze is an online visualization analysis platform for gene expression analysis and meta-analysis. It can perform comparative, quantitative, differential and enrichment analysis of gene expression, protein-protein interaction analysis, integration analysis of multiple datasets, and can also draw high-value images such as PCA, protein-protein interaction network diagram, heatmap, volcano diagram, Wayne diagram, etc. Weblink: https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/
PubMed database	National Center for Biotechnology Information in the United States (NCBI)		The Pubmed database is a biomedical literature database maintained by the National Library of Medicine (NLM) in the United States, aimed at providing the latest medical research results to scientists, doctors, researchers, and students worldwide. This database collects biomedical literature from around the world, including journal articles, papers, books, etc. As of now, the Pubmed database has collected over 30 million articles and is continuously updated every week. Weblink: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/
R software	Ross Ihaka and Robert Gentleman		R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment which was developed at Bell Laboratories (formerly AT&T, now Lucent Technologies) by John Chambers and colleagues. R can be considered as a different implementation of S. There are some important differences, but much code written for S runs unaltered under R. Weblink: https://www.r-project.org/
STRING database (STRING, version 11.0)	Swiss Institute of Bioinformatics		STRING is a database of known and predicted protein interactions. The interactions include direct (physical) and indirect (functional) associations Weblink: https://string-db.org/
Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)	Zhejiang Jiuwei Health Co., Ltd		TCMSP is not only a data repository, but also an analysis platform for users to comprehensively study Traditional Chinese Medicines (TCM): including identification of active components, screening of drug targets and generation of compounds-targets-diseases networks, as well as the detailed drug pharmacokinetic information involving drug-likeness (DL), oral bioavailability (OB), blood-brain barrier (BBB),intestinal epithelial permeability (Caco-2), ALogP,fractional negative surface area (FASA-) and number of  H-bond donor/acceptor  (Hdon/Hacc). So far, TCMSP has attracted broad attentions and several groups have published more than 10 papers by using our TCMSP database within about one year. Weblink: https://tcmsp-e.com