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Resumen

Aquí presentamos dos protocolos para cuantificar el envolvimiento microglial de sinapsis positivas para vGLUT1 y sinaptosomas crudos marcados con pHRodo Red mediante citometría de flujo.

Resumen

La microglía desempeña un papel fundamental en el refinamiento sináptico del cerebro. El análisis de la envolvimiento microglial de las sinapsis es esencial para comprender este proceso; sin embargo, los métodos disponibles actualmente para identificar el envolvimiento microglial de las sinapsis, como la inmunohistoquímica (IHQ) y las imágenes, son laboriosos y requieren mucho tiempo. Para abordar este reto, presentamos ensayos in vitro e in vivo* que permiten la cuantificación rápida y de alto rendimiento del envolvimiento microglial de las sinapsis mediante citometría de flujo.

En el enfoque in vivo* , realizamos una tinción intracelular de vGLUT1 después del aislamiento de células frescas de cerebros de ratones adultos para cuantificar la absorción de sinapsis de vGLUT1+ por parte de la microglía. En el ensayo de envolvimiento de sinaptosomas in vitro , utilizamos células recién aisladas del cerebro de ratón adulto para cuantificar la absorción de sinaptosomas marcados con pHrodo Red por la microglía. Estos protocolos juntos proporcionan un enfoque eficiente en el tiempo para cuantificar el envolvimiento microglial de las sinapsis y representan alternativas prometedoras a los métodos basados en el análisis de imágenes que requieren mucha mano de obra. Al simplificar el análisis, estos ensayos pueden contribuir a una mejor comprensión del papel de la microglía en el refinamiento sináptico en diferentes modelos de enfermedades.

Introducción

Las microglías son las células inmunitarias residentes del sistema nervioso central (SNC)1. Exploran constantemente su microambiente y proporcionan vigilancia 1,2. Además, interactúan frecuentemente con las sinapsis y median en el ajuste fino de la actividad sináptica3. Por lo tanto, se han convertido en un actor clave en el proceso de refinamiento sináptico.

El papel de la microglía en el refinamiento sináptico a través de la engullimiento de las sinapsis ha sido demostrado por diversos grupos de investigación 3,4,5,6,7. Las interrupciones en este proceso pueden contribuir a la patología de trastornos neurodegenerativos y del neurodesarrollo como la esquizofrenia y la enfermedad de Alzheimer8. El refinamiento sináptico aberrante por microglía ya ha sido detectado en varios modelos murinos de trastornos neurológicos 5,9,10. Por lo tanto, la identificación de los distintos mecanismos que subyacen a la absorción microglial de las sinapsis es primordial para comprender la fisiopatología de los trastornos neurodegenerativos y del neurodesarrollo8.

Dirigirse a la envolvimiento microglial de las sinapsis tiene un gran potencial tanto para intervenir en la progresión de la enfermedad como para obtener información sobre los mecanismos subyacentes de los trastornos neurodegenerativos y del neurodesarrollo. Para facilitar este tipo de investigaciones, es necesario contar con enfoques rápidos y de alto rendimiento. Los enfoques metodológicos actuales abarcan ensayos in vivo, ex vivo e in vitro que permiten la detección de material sináptico dentro de la microglía. En general, la detección del envolvimiento microglial de las sinapsis depende en gran medida de los enfoques basados en inmunohistoquímica (IHQ) y microscopía 5,6,11, que requieren mucha mano de obra y muestran limitaciones en el análisis de un gran número de microglías.

Dadas estas limitaciones técnicas, es imperativo explorar metodologías alternativas. Para superar esto, hemos optimizado un enfoque basado en citometría de flujo, que permite un análisis eficiente, imparcial y de alto rendimiento de la absorción microglial de las sinapsis. Elegimos el hipocampo como la principal región de interés debido a su alto grado de remodelación sináptica y plasticidad12, pero el protocolo se puede adaptar a varias regiones cerebrales. Si bien la citometría de flujo ya se ha utilizado en estudios previos para detectar el envolvimiento microglial de las sinapsis 13,14,15, aquí proporcionamos una metodología paso a paso que emplea un anticuerpo vGLUT1 conjugado con fluoróforos actualmente disponible en el mercado. Además, proporcionamos un enfoque complementario in vitro para el cribado de alto rendimiento de la inmersión microglial del material sináptico mediante el uso de sinaptosomas crudos.

Protocolo

En la Figura 1A se ilustra gráficamente una visión general del procedimiento experimental. Todos los experimentos relacionados con el manejo de animales vivos utilizados se realizaron en estricta conformidad con la Ley de Protección Animal alemana y fueron aprobados por la Oficina Regional de Salud y Servicios Sociales en Berlín (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlín, Alemania). Los ratones fueron alojados en grupos en jaulas ventiladas en condiciones estándar de laboratorio con un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h en las instalaciones del núcleo animal del Centro Max Delbrück de Medicina Molecular (MDC). Se proporcionaba comida y agua ad libitum. Consulte la Tabla 1 para la composición de tampones y reactivos y la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los reactivos, instrumentos y materiales utilizados en este protocolo. Para el ensayo específico de vGLUT1, utilizamos el término in vivo* en todo el manuscrito para reconocer que la citometría de flujo requiere homogeneización de tejidos y aislamiento celular, y la microglía exhibe aproximadamente un 95% de viabilidad después del procedimiento de aislamiento (Figura 1B y Figura Suplementaria S1). Por lo tanto, conservan su capacidad de engullir material sináptico ex vivo, durante un corto período, hasta la fijación. Por lo tanto, la cuantificación de la microglía vGLUT1+ comprende tanto el envolvimiento in vivo como el ex vivo a corto plazo hasta la etapa de fijación.

1. Tinción intracelular de vGLUT1 para la detección de envolvimiento in vivo* de sinapsis glutamatérgicas por microglía

NOTA: El siguiente procedimiento de aislamiento celular es una adaptación del16. Todos los pasos del aislamiento celular deben llevarse a cabo en hielo.

  1. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital. Perfundir los ratones por vía intracardíaca con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco helada durante ~2 min.
    NOTA: Se utiliza un ratón por muestra (n).
  2. Saca el cerebro del cráneo y consérvalo en 1 mL de medio de células neurales.
    NOTA: El medio celular neural, como el medio Hibernate-A, se utiliza para garantizar una alta viabilidad de las células después del proceso de disociación del tejido.
  3. Transfiera el cerebro a una placa de Petri llena de 1 mL de medio de células neurales heladas y diseccione los hipocampos como sedescribió anteriormente.
  4. Transfiera los hipocampos a un homogeneizador Dounce lleno de 1 mL de medio de células neurales y disocie el tejido con el mortero suelto con aproximadamente ~ 25 movimientos suaves.
  5. Coloque un colador de 70 μm en un tubo de polipropileno de 5 mL y agregue 500 μL de medio de célula neural. Transfiera el homogeneizado de tejido al tubo de polipropileno de 5 mL a través del colador.
  6. Enjuague el homogeneizador Dounce 2 veces con 1 mL de medio de células neurales frías y centrifugue las muestras a 400 × g durante 8 min.
  7. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 μL de DPBS helado mediante un pipeteo suave. Asegure una suspensión homogénea y complete el volumen final a 1,5 mL mediante el uso de DPBS.
  8. Añadir 500 μL de solución isotónica de Percoll a la muestra, resuspenderla suavemente y recubrirla con otros 2 ml de DPBS frío.
  9. Centrifugar las muestras a 3.000 × g durante 10 minutos con aceleración máxima y sin freno. Aspire la capa superior, así como el disco de mielina en la fase media.
    NOTA: Todos los siguientes pasos de centrifugación se llevan a cabo a 4 oC si no se especifica lo contrario.
  10. Añadir 4 mL de DPBS frío y centrifugar las muestras a 400 × g durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 100 μL de solución de tinción de viabilidad fijable e incubar las muestras durante 30 min a 4 °C.
  11. Añada 1 ml de DPBS frío a la muestra y centrifugue las muestras a 300 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y añada 100 μL de solución de tinción CD16/CD32 (1/200 en tampón FACS). Vórtice durante ~5 s e incube durante 10 min a 4 °C.
    NOTA: La tinción con CD16/CD32 es un tratamiento previo para minimizar la unión inespecífica de los anticuerpos a las células portadoras de FcR, como la microglía, antes de aplicaciones como la citometría de flujo.
  12. Añada 1 ml de tampón FACS a la muestra y centrifugue a 300 × g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y añadir 100 μL de tinción master mix-I (1/100 anti-CD11b/ anti-CD45 + 1/200 anti-Ly6C/ anti-Ly6G en 1x FACS Buffer). Incubar las muestras durante 20 min a 4°C en la oscuridad.
  13. Añada 1 ml de tampón FACS a la muestra y centrifugue a 300 × g durante 5 min.
  14. Vuelva a suspender el pellet en 250 μL de tampón de fijación. Incubar a 4 °C durante 25 min.
  15. Añadir 2 mL de tampón de permeabilización 1x (PERM) y centrifugar 300 × g durante 5 min.
  16. Deseche el sobrenadante y añada 100 μL de vGLUT1 o de solución de tinción de control de isotipo. Agitar el vórtice durante ~5 s e incubar las muestras a 4 °C durante 50 min.
  17. Añadir 2 mL de 1x PERM Buffer y centrifugar 300 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y añada 2 mL de tampón FACS a las muestras.
  18. Centrifugar a 300 × g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 250 μL de tampón FACS y pase las muestras a través de un filtro filtrante de 40 μm.
  19. Analice la intensidad de fluorescencia de vGLUT1 a partir de microglía única/viable/CD11b++/CD45+ mediante citometría de flujo. Utilice los macrófagos del bazo como control negativo para cada experimento.
    1. Aísle los esplenocitos comprimiendo suavemente el tejido picado del bazo a través de un filtro de filtro de 70 μm dos veces. Enjuague los filtros con 40 mL de DPBS y recoja la suspensión en un tubo cónico de 50 mL.
    2. Centrifugar 350 × g durante 10 min y resuspender el pellet resultante en una solución de 1 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos. Incubar durante 10 min en hielo.
    3. Añadir 10 mL de DPBS a la muestra después de la incubación y centrifugar a 350 × g durante 10 min.
    4. Continúe con los pasos de tinción explicados entre los pasos 1.11 y 1.17.
      NOTA: La estrategia de compuerta se proporciona en la Figura Suplementaria S2 para definir los macrófagos del bazo como CD11b ++/ CD45 ++/ Población de células viables.
    5. Estrategia de compuerta (Figura 1)
      1. Puerta primaria: Ajuste el área de dispersión frontal (FSC-A) [eje x] y el área de dispersión lateral (SSC-A) [eje y] para incluir la población de microglía en el área cerrada y excluir los desechos celulares.
      2. Ajuste el área de dispersión directa (FSC-A) [eje x] y la altura de dispersión directa (FSC-H) [eje y] para excluir dobletes. Los singletes aparecen como una diagonal en este diagrama de puntos.
      3. Ajuste CD11b-PECy7 [eje y] y CD45-APC [eje x] y dirija la población con un alto nivel superficial de CD11b y un nivel medio de CD45 como microglía.
      4. Excluya las células muertas en la puerta negativa FITC[eje Y]. OPCIONAL: Excluya también las células que son positivas para Ly6C- y Ly6G-FITC en la puerta negativa de FITC para excluir los macrófagos asociados al SNC del análisis.
        NOTA: A diferencia de las células vivas, las células muertas con membranas comprometidas permiten que el tinte de viabilidad fijable ingrese al citoplasma, lo que aumenta la cantidad de marcaje de proteínas18. Por lo tanto, las células muertas serán más brillantes que las células vivas, que se incluyen en la puerta definida.
      5. Ajuste CD45-APC [eje x] y vGLUT1-PE [eje y]; la población que está por encima de la puerta umbral, donde no se detectan eventos positivos en la muestra de bazo (control biológico negativo interno, Figura 1E) se considera la fracción positiva para vGLUT1 en la muestra.

2. Detección de engullimiento in vitro de sinaptosomas crudos por microglía

  1. Preparación cruda de sinaptosomas y etiquetado de pHrodo Red
    NOTA: Todos los siguientes pasos deben realizarse con hielo.
    1. Siga los pasos 1.1 a 1.2.
    2. Transfiera el cerebro a una placa de Petri llena de 1 ml de medio de células neurales heladas y diseccione cuidadosamente los hipocampos. Mantenga siempre la placa de Petri en hielo. Utilice el hipocampo para el aislamiento de la microglía en el siguiente paso.
    3. Transfiera el resto del cerebro (excluyendo el cerebelo y el bulbo olfatorio) a un homogeneizador Dounce lleno de 1 mL de reactivo de extracción de proteínas sinápticas y disocie suavemente el tejido usando el mortero suelto con aproximadamente ~ 30 golpes. Complemente el inhibidor de la proteasa en comprimido por cada 10 ml del reactivo de extracción y aísle los sinaptosomas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Los reactivos de extracción sináptica de proteínas, como SynPER19, se utilizan para preparar sinaptosomas que contienen proteínas presinápticas y postsinápticas biológicamente activas.
    4. Disolver el pellet crudo de sinaptosoma en 500 μL de solución de 0,1 M de Na2CO3 . Teñir la muestra de sinaptosomas con 10 μL de 0,2 mM de pHrodo Red. Incubar las muestras brutas de sinaptosomas a temperatura ambiente (24-25 °C) durante 1,5 h con agitación suave.
    5. Añadir 1 mL de DPBS frío a la muestra, centrifugar durante 1 min a máxima velocidad (20.815 × g) y aspirar el sobrenadante.
    6. Repita el paso 2.1.5 durante 7 veces en total para eliminar el exceso de pHrodo Red no unido de las muestras.
    7. Después de la última centrífuga, realice un ensayo estándar de BCA para cuantificar las concentraciones de proteínas de la muestra.
    8. Opcional: congelar muestras de sinaptosomas en DPBS con un 5% de DMSO utilizando nitrógeno líquido y conservarlas durante 3 semanas a -80 °C. Cubra los tubos con papel de aluminio para mantener la exposición a la luz al mínimo.
  2. In vitro Ensayo de envolvimiento de sinaptosomas crudos utilizando microglía adulta recién aislada
    1. Prepare un CSF y equilibre con 95% O2:5%CO2 durante 30 min.
      NOTA: Para los pasos 2.2.2-2.2.4, siga las instrucciones del fabricante para la preparación de la solución de digestión a base de papaína.
    2. Agregue 4 mL de aCSF al vial 2 del kit de papaína. Coloque el vial en un baño de agua a 37 °C durante ~10 min hasta que la solución de papaína parezca clara.
    3. Añadir 400 μL de aCSF al vial 3 del kit de papaína. Mezcle suavemente durante ~ 10 veces mediante un pipeteo lento.
    4. Añadir 200 μL del vial 3 al vial 2 (reconstruido en el paso 2.2.3). Guarde el resto del vial 3.
    5. Tome los hipocampos disecados en el paso 2.1.2 y pique los hipocampos disecados con un bisturí.
    6. Transfiera el hipocampo picado a un tubo disociador de tejido lleno de 2 mL de solución enzimática preparada en el paso 2.2.5. Coloque el tubo en el disociador de tejidos y ejecute el programa: 37C_ABDK_01 (tarda ~30 min).
    7. Colocar las muestras en un baño de agua a 37 °C durante ~20 min y triturar la mezcla cada 5 min con una pipeta de 1 mL sin hacer burbujas.
      NOTA: Este proceso debe continuarse hasta que el tejido esté completamente disociado y parezca completamente homogéneo para asegurar una disociación eficiente. Todos los siguientes pasos de centrifugación se llevan a cabo a 4 oC si no se especifica lo contrario.
    8. Retire con cuidado la suspensión de células turbias a un nuevo tubo de 15 ml y centrifugue a 300 × g durante 5 minutos.
    9. Durante este período de 5 minutos, prepare la siguiente mezcla de lavado (5 ml) por muestra; añadir 500 μL de la solución de inhibidor de la albúmina-ovomucoide reconstituida suministrada en el kit de papaína a 4,5 mL de LCR-a. Añada la solución restante en el vial 3 del paso 2.2.5 a la mezcla de lavado.
    10. Deseche el sobrenadante del paso 2.2.8 y vuelva a suspender inmediatamente el pellet celular en la solución de mezcla de lavado.
    11. Pase la muestra a través de un filtro de 70 μm a un nuevo tubo de microcentrífuga de 5 mL. Centrifugar las muestras a 300 × g durante 5 min.
    12. Continúe con el paso de centrifugación en gradiente de Percoll explicado anteriormente en los pasos 1.7-1.9.
    13. Vuelva a suspender las células con cuidado en el tampón de tinción MACS pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo. Incubar las muestras durante 15 min a 4 °C.
    14. Añada 1 ml de tampón MACS a cada muestra y centrifugar a 300 × g durante 8 min.
    15. Vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón MACS.
    16. Coloque las columnas de selección positiva en el separador magnético. Equilibre las columnas enjuagándolas con 3 mL de MACS Buffer.
    17. Mezclar suavemente y aplicar 500 μL de la suspensión celular sobre la columna. Lave las columnas 3 veces con 3 mL de MACS Buffer.
    18. Retire las columnas del separador magnético y colóquelas en tubos cónicos de 15 mL. Añada 5 ml de tampón MACS a la columna y enjuague inmediatamente las células con un rellenador. Centrifugar las muestras a 300 × g durante 10 min.
    19. Durante este período, prepare 20 mL de 40% de FBS en DPBS. Precalentar 1 mL de DMEM por muestra hasta 37 °C en un baño de agua.
    20. Disuelva el pellet de celda final en 1 mL de DMEM precalentado. Siembre alrededor de ~ 150,000-200,000 células en 500 μL de DMEM precalentado por pocillo en una placa de 24 pocillos. Como control, siembre un número similar de células en 1-2 pocillos adicionales. Compruebe la confluencia de células en todos los pocillos utilizando un microscopio óptico.
      NOTA: Si la región cerebral objetivo es el hipocampo o regiones cerebrales comparativamente pequeñas, se pueden agrupar 5 ratones por muestra (n) para aislar ~ 150,000 microglías. Para todo el cerebro, 1 ratón por n será suficiente para obtener un número similar de células utilizando ambos protocolos de aislamiento. Alternativamente, se pueden sembrar ~ 40,000 células en placas de 96 pocillos en un volumen final de 100 μL para comenzar el ensayo de envolvimiento. Esto reduce el número de células analizadas, pero también reduce el número de ratones utilizados por n. La privación de proteínas debido a la falta de FCS en DMEM desencadenará la fagocitosis.
    21. Incubar la placa durante 1-2 h en la incubadora (37 °C y 5% de CO2).
      NOTA: Este paso tiene como objetivo que las células se recuperen de los efectos propensos al estrés del procedimiento de aislamiento antes del inicio del ensayo de envolvimiento funcional.
    22. Tome 250 μL de medio de cada pocillo muy lentamente, agregue 250 μL de DMEM fresco precalentado a cada pocillo y agregue 3 μg de sinaptosomas marcados con pHRodo Red en la parte superior. Comprobar la confluencia celular en todos los pocillos utilizando un microscopio óptico.
      1. Para los pocillos de control negativos, agregue la misma cantidad de sinaptosomas sin marcar al pozo extra sembrado con células.
      2. En el caso de los pozos de prueba, asegúrese de que el pocillo 1 contenga solo células; el pozo 2 contiene células+ sinaptosomas sin marcar; well-3 contiene células+ 3 μg de pHrodo Red; el pozo 4 contiene DMEM + 3 μg de pHrodo Red.
    23. Incubar las células con sinaptosomas durante 2 h en la incubadora (37 °C y 5% de CO2).
    24. Saque el medio y lave los pocillos con DPBS frío. Añadir 200 μL de solución de tripsina/EDTA por pocillo para separar las células durante 35 s.
    25. Agregue 1 mL de 40% de FBS en DPBS por pocillo y transfiera las celdas a un tubo de polipropileno de 5 mL a través del colador. Mantenga tanto la placa como el tubo en hielo durante este proceso para facilitar el desprendimiento de las células.
    26. Lave cada pocillo 2 veces con 500 μL de DPBS helado. Centrifugar las muestras recogidas a 500 × g durante 5 min.
    27. Vuelva a suspender las células en la solución de tinción que contiene 1/200 CD16/CD32 en 100 μL de tampón FACS e incube durante 10 min en hielo.
    28. Después de la incubación, agregue CD11b y CD45 a la solución de tinción con una concentración final de 1/100 de cada uno. Incubar las muestras durante 20 min a 4 °C en la oscuridad.
    29. Lavar las muestras con 1 mL de tampón FACS y centrifugarlas a 300 × g durante 10 min.
    30. Vuelva a suspender el pellet en 250 μL de tampón FACS y registre al menos 100.000 eventos totales mediante citometría de flujo. Analice la intensidad de fluorescencia roja de pHrodo de la microglía CD11b++/CD45+ .
    31. Estrategia de compuerta (Figura 2C)
      1. Ajuste la puerta primaria: Área de dispersión directa (FSC-A) [eje x] y Área de dispersión lateral (SSC-A) [eje x] para incluir la población de microglía en el área cerrada y excluir los desechos celulares.
      2. Ajuste el área de dispersión directa (FSC-A) [eje x] y la altura de dispersión directa (FSC-H) [eje y] para excluir dobletes. Los singletes aparecen como una diagonal en este diagrama de puntos.
      3. Ajuste CD11b-PECy7 [eje y] y CD45-APC [eje x] y controle la población con un nivel de superficie alto de CD11b y un nivel medio de CD45 como microglía.
      4. Calcular la mediana de la intensidad de fluorescencia de pHrodo-PE a partir de esta población. Utilice las mismas células incubadas con sinaptosomas no marcados como control negativo.

Resultados Representativos

En este proyecto, optimizamos y presentamos dos protocolos para medir in vivo* e in vitro el envolvimiento de sinapsis por microglía. En el primer protocolo, nos centramos en el envolvimiento in vivo* de sinapsis positivas para vGLUT1. Como punto de partida, se utilizó un protocolo previamente publicado14. Sin embargo, los anticuerpos FACS utilizados en este protocolo están descontinuados y agregamos muchos pasos de optimización, así como un método novedoso para el aislamiento de microglía16. Es por ello que vale la pena compartir con la comunidad científica el protocolo que aquí se presenta como una actualización integral de los protocolos que ya están publicados.

Para cuantificar la absorción microglial de las sinapsis, utilizamos ratones macho C57BL/6N de 11 a 14 semanas de edad. El hipocampo fue seleccionado como la principal región de interés debido a su alto grado de remodelación sináptica y plasticidad12. Analizamos la microglía %vGLUT1-positiva, así como la intensidad de fluorescencia (MFI) vGLUT1-PE específica de la microglía en el hipocampo de ratones C57BL/6N. Los macrófagos del bazo derivados de los mismos animales se utilizaron como control biológico negativo por experimento. Probamos el anticuerpo vGLUT1 demostrando una señal de fluorescencia vGLUT1-PE más alta de la microglía del hipocampo en comparación con el control del isotipo y los macrófagos del bazo (Figura 1B-E)

Además, comparamos el envolvimiento microglial de sinapsis tanto en el cerebelo como en el bulbo olfatorio (como otra referencia de alta plasticidad sináptica)20. Encontramos una señal de fluorescencia vGLUT1 más alta en la microglía desde el bulbo olfatorio y una señal más baja en el cerebelo en comparación con el hipocampo (Figura 1F). La intensidad de señal más baja se detectó en los macrófagos del bazo, que sirven como control negativo interno (Figura 1E). Además, utilizamos ratones Vglut-IRES-Cre/ChR2-YFP para probar la inmunorreactividad de nuestro anticuerpo vGLUT1. YFP es expresado por las neuronas glutamatérgicas de estos ratones, lo que indica que la población YFP positiva también debería incluir una fracción vGLUT1 positiva. Utilizando este protocolo de tinción, detectamos que el 98,7% de la población YFP positiva era vGLUT1-positiva, lo que valida la eficacia de nuestro anticuerpo (Figura suplementaria S3).

En general, estos resultados validan la eficiencia del anticuerpo vGLUT1 y el protocolo de tinción presentado. Demostramos que este protocolo y el anticuerpo se pueden utilizar con confianza para cuantificar in vivo* la absorción de sinapsis de una manera rápida y de alto rendimiento en comparación con otros enfoques experimentales.

Pasando al método in vitro , aislamos microglía adulta y los incubamos con sinaptosomas marcados con pHrodo Red recién aislados de los mismos animales para cuantificar su engullimiento in vitro (Figura 2A). Marcamos los sinaptosomas con pHrodo Red, que aumenta naturalmente la señal de fluorescencia en el pH21 del entorno ácido. Aislamos sinaptosomas y los expusimos a diferentes valores de pH (pH = 4 y pH = 11). Después de confirmar el aumento de la señal de fluorescencia a pH bajo como experimento de prueba de principio (Figura 2B), incubamos estos sinaptosomas con microglía recién aislada durante 1,5-2 h. Como control, incubamos microglía con sinaptosomas no marcados. A continuación, analizamos la señal de fluorescencia pHrodo Red-PE de la microglía CD11b++/CD45+ y observamos una fluorescencia de PE positiva, comparable a la obtenida de los sinaptosomas a pH = 4 (Figura 2C). Por lo tanto, este método proporciona un análisis rápido y de alto rendimiento de la absorción in vitro de sinaptosomas y puede extenderse a placas amiloides o al engullimiento de otros objetivos potenciales siguiendo los pasos de optimización necesarios. De hecho, Rangaraju et al. cuantificaron el engullimiento de beta amiloide por la microglía utilizando un enfoque similar basado en la citometría de flujo22. En conclusión, estos dos métodos proporcionan una cuantificación robusta, eficiente y de alto rendimiento de la absorción microglial de las sinapsis tanto in vivo* como in vitro.

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Figura 1: Análisis de la envolvimiento microglial de las sinapsis de vGLUT1+ in vivo*. (A) Ilustración gráfica del flujo de trabajo experimental que muestra los pasos de la tinción intracelular de vGLUT1. (B) Estrategia de compuerta para definir una población de células viables individuales / CD11b ++ / CD45 + / del hipocampo. Esta población se utilizó para analizar vGLUT1-MFI, así como para cuantificar el porcentaje de microglía vGLUT1+ en el hipocampo. La puerta que se muestra con el rectángulo rojo indica la fracción de células vGLUT1+ en la muestra total. (C) El histograma indica la intensidad de fluorescencia de vGLUT1-PE. (D) La puerta que se muestra con el rectángulo rojo indica que no hay una fracción celular positiva que muestre inmunorreactividad del isotipo-PE. El histograma indica la intensidad de fluorescencia del isotipo-PE. (E) La puerta que se muestra con el rectángulo rojo indica que no hay una fracción celular positiva que muestre inmunorreactividad de vGLUT1-PE en los macrófagos del bazo. El histograma indica la intensidad de fluorescencia de vGLUT1-PE. La puerta indicada en el histograma comienza en el nivel, donde termina el vGLUT1-MFI del bazo (~104) y se utiliza para analizar la fracción positiva de vGLUT1 en las muestras de cerebro. (F) El histograma superpuesto muestra la comparación de la intensidad de fluorescencia de PE de los macrófagos del bazo (gris) y la microglía del hipocampo (rojo), el cerebelo (púrpura) y el bulbo olfativo (azul claro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Análisis de la envolvición microglial de sinaptosomas sinapsis in vitro. (A) Ilustración gráfica del flujo de trabajo experimental que representa los pasos del ensayo de envolvimiento de sinaptosomas in vitro. (B) Los sinaptosomas incubados a dos valores de pH diferentes muestran una señal de fluorescencia baja de pHrodo Red-PE a pH = 11 y una alta fluorescencia de pHrodoRed-PE a pH = 4. (C) Se utilizó una población de células únicas/CD11b++/CD45+ para analizar la intensidad de fluorescencia de pHrodo Red-PE. Las microglías incubadas con sinaptosomas no teñidos se utilizaron como control negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Lista de tampones y reactivos utilizados en este protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura suplementaria S1: Imagen representativa de la microglía adulta recién aislada. Imagen obtenida utilizando un microscopio óptico con objetivo 20x siguiendo el protocolo de disociación tisular basado en papaína y el aislamiento basado en MACS de la microglía CD11b+. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Gráficos representativos de FACS que demuestran la estrategia de compuerta para definir macrófagos del bazo. El bazo se utilizó como control negativo en los experimentos experimentales mientras se probaba la envolvimiento microglial de las sinapsis en el hipocampo. Los gráficos FACS dados anteriormente definen los macrófagos del bazo como población CD11b++/CD45++/viable. Esta población se utilizó para establecer un umbral para cuantificar la microglía vGLUT1+ en las muestras de cerebro que residen por encima de esta puerta de umbral. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S3: Gráficos representativos de FACS que demuestran la estrategia de compuerta para probar la eficiencia del anticuerpo vGLUT1. (A) Ilustración gráfica del flujo de trabajo experimental que describe los pasos de la tinción vGLUT1. Las neuronas glutamatérgicas YFP+ se utilizaron para probar la inmunorreactividad del anticuerpo vGLUT1. (B) Estrategia de compuerta para definir la población YFP+ del hipocampo de ratones Vglut-IRES-Cre//ChR2-YFP que se utilizaron como control positivo para probar la eficiencia del anticuerpo vGLUT1 FACS. La fracción YFP+ se comprimió para especificar sinapsis glutamatérgicas. En esta población, se analizó la inmunorreactividad del anticuerpo vGLUT1 para probar la inmunorreactividad del anticuerpo. En comparación con el (C) Isotipo control; El 97,9% de la fracción de células positivas para YFP se detecta como (D) vGLUT1 positivo. (E) El histograma superpuesto indica la comparación de la fluorescencia de PE entre el isotipo y el anticuerpo vGLUT1. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El refinamiento sináptico a través de la interacción microglía-sinapsis es un área de estudio intrigante dentro del campo de la neuroinmunología, que ofrece información prometedora sobre el papel de la microglía en los trastornos neurodegenerativos y del neurodesarrollo. En 2011; Paolicelli et al. proporcionaron evidencia de la presencia de material sináptico dentro de la microglía, arrojando luz sobre su participación en el proceso de envolvimiento sináptico4. Otro estudio intrigante empleó imágenes de lapso de tiempo y un modelo de cultivo de cortes de cerebro organotípicos ex vivo e informó que las microglías participan en un proceso fagocítico conocido como trogocitosis, donde engullen estructuras presinápticas en lugar de toda la estructura sináptica23. Una publicación muy reciente utilizando un nuevo modelo de ratón transgénico que permite la medición de la fagocitosis en tejido intacto mostró la poda de Bergmann-glia in vivo sobre el aprendizaje motor24. Por lo tanto, hay suficiente evidencia que indica la participación de las células gliales en el envolvimiento sináptico, incluida la microglía. Sin embargo, el grado en que esta función microglial afecta el proceso dinámico y selectivo de la poda sináptica requiere más evidencia.

Sin embargo, la cuantificación de la absorción microglial de las sinapsis sirve como un indicador valioso y proporciona una visión parcial de la compleja dinámica de las interacciones microglía-sinapsis, especialmente el refinamiento sináptico. Una revisión exhaustiva ha resumido los protocolos actuales utilizados para investigar el envolvimiento de las sinapsis por parte de la microglía25. Nos gustaría enfatizar que nuestros protocolos están optimizados en base a los protocolos existentes que ya están en uso. Los métodos presentados en este estudio proporcionan una cuantificación rápida y de alto rendimiento de la envolvimiento microglial de las sinapsis en varias regiones cerebrales disecadas. Dependiendo de la región del cerebro, es posible realizar un análisis de al menos 10.000 células microgliales en un máximo de dos días para ambas metodologías, lo que las hace valiosas para probar múltiples modelos de ratón en paralelo.

Reconocemos que la cuantificación de la microglía vGLUT1+ comprende tanto in vivo como ex vivo a corto plazo hasta la etapa de fijación. Por lo tanto, sugerimos que nuestro ensayo presenta una forma rápida y confiable de cuantificar el material sináptico dentro de la microglía como un paso inicial antes de la validación in vivo utilizando enfoques como IHC.

Otra desventaja del análisis de citometría de flujo es la disponibilidad limitada de anticuerpos para los marcadores sinápticos, particularmente para las sinapsis inhibitorias. Es difícil encontrar anticuerpos conjugados directos disponibles en el mercado que muestren una señal brillante para estos marcadores. Dado el extenso tiempo de optimización requerido para probar diferentes anticuerpos dirigidos a marcadores sinápticos, es importante compartir los procedimientos bien optimizados con la comunidad científica para la tinción intracelular con diferentes anticuerpos, como lo hacemos aquí con este estudio.

En cuanto al análisis de datos en este estudio, utilizamos controles de isotipo como controles técnicos negativos para dar cuenta de las uniones inespecíficas del anticuerpo vGLUT1, ya que proporcionan una estimación de la unión inespecífica de un anticuerpo en una muestra al tiempo que optimizan los ensayos basados en citometría de flujo26. Sin embargo, los controles de isotipo se han optimizado principalmente para detectar la señal de fondo inespecífica de los procedimientos de tinción superficial y no son óptimos para los controles de tinción intracelular27,28. Por lo tanto, no se debe confiar en ellos para distinguir entre las poblaciones negativas y positivas al realizar la tinción intracelular, que implica pasos de fijación y permeabilización que pueden afectar la detección de antígenos, la autofluorescencia y el brillo de los fluoróforos29. Estos procedimientos de tinción intracelular requieren el uso de controles biológicos internos apropiados para definir la población celular positiva teñida para un marcador intracelular29. Por lo tanto, considerando que utilizamos un protocolo de tinción intracelular, empleamos un control biológico negativo interno (macrófagos del bazo) y definimos el límite entre las poblaciones positivas y negativas según los macrófagos del bazo aislados de los mismos ratones. Distinguimos la población positiva por encima de la puerta, en la que no hay eventos positivos para vGLUT1, de los macrófagos del bazo que sirven como control biológico negativo (Figura 1).

Ambos métodos presentados en este estudio ofrecen un gran potencial para el análisis inicial de la absorción microglial de las sinapsis de una manera rápida y de alto rendimiento, analizando más de 10.000 células de pequeñas regiones cerebrales y esto no se puede lograr con las técnicas de microscopía estándar. Por lo tanto, estos métodos ofrecen una ventaja significativa sobre los métodos que requieren mucho tiempo y mano de obra y, además, proporcionan un análisis más completo de la envolvimiento sináptico al permitir un análisis de un mayor número de microglías. Además, el método in vitro presentado en este estudio es particularmente útil para probar el impacto de diferentes tratamientos en el envolvimiento microglial de las sinapsis. Permite cuantificar directamente el efecto del tratamiento sobre la microglía sin los factores de confusión asociados con otros tipos de células. Además, sirve como un enfoque indirecto para probar un efecto potencial del microambiente u otros tipos de células en el proceso de envolvimiento sináptico. Por lo tanto, concluimos que estos métodos, especialmente cuando se utilizan en paralelo, ofrecen alternativas intuitivas y ventajosas para el análisis de la envolvimiento microglial de materiales sinápticos.

Sin embargo, el análisis de la microglía recién aislada mediante ensayos fagocíticos basados en FACS ex vivo puede plantear algunas desventajas. En primer lugar, es fundamental emplear protocolos bien optimizados que generen microglía recién aislada del cerebro adulto y eviten la activación ex vivo y la respuesta al estrés de la microglía. Dissing-Olesen et al. incorporaron el uso de inhibidores transcripcionales y traduccionales para superar este problema mediante el empleo de un procedimiento de disociación tisular a 37 oC30. Mattei et al., por otro lado, presentaron un protocolo de disociación tisular mecánica en frío para evitar inducir la expresión ex vivo de genes asociados al estrés16 y adaptamos este protocolo en la primera sección para evitar la activación ex vivo de la respuesta de la microglía asociada al estrés antes de la tinción intracelular de vGLUT1. Empleamos un protocolo de disociación tisular enzimática en la segunda sección antes del ensayo de envolvimiento de sinaptosomas in vitro , considerando el mayor rendimiento de microglía después de la disociación tisular basada en papaína (datos no mostrados). La microglía permanece inevitablemente a 37 °C en condiciones de cultivo cuando se incuba con sinaptosomas, y la incubación a 37 °C puede inducir cambios en la microglía como inconvenientes comunes de todos los ensayos in vitro y procedimientos de cultivo celular. Por lo tanto, sugerimos el uso de ambos protocolos presentados en paralelo para llegar a una conclusión más amplia en términos de envolvimiento microglial de las sinapsis.

Además, es importante definir cuidadosamente la estrategia de activación para seleccionar la microglía CD11b++/CD45+ , teniendo en cuenta la presencia de otras células inmunitarias en el parénquima cerebral que también expresan estos marcadores31. Más importante aún, al elegir marcadores para dirigirse específicamente a la microglía (por ejemplo, TMEM119, P2RY12), es importante considerar que pueden sufrir cambios en sus niveles de expresión durante condiciones patológicas e inflamatorias32, y dichos cambios deben considerarse antes de establecer el panel FACS para cuantificar el envolvimiento microglial de las sinapsis. Por último, es esencial destacar que ninguno de los métodos discutidos anteriormente, incluidos los enfoques in vivo basados en IHQ y microscopía, puede capturar por sí solo la poda activa y selectiva de las sinapsis por parte de la microglía. Estos métodos no son capaces de discriminar la poda activa por microglía de la eliminación pasiva de los restos sinápticos dentro del parénquima cerebral. Por lo tanto, al evaluar y discutir los datos, es imperativo distinguir claramente entre estos distintos conceptos.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Agradecemos a Regina Piske por su asistencia técnica en el aislamiento de la microglía y al Dr. Caio Andreta Figueiredo por su ayuda en la adquisición de imágenes de microscopía en la Figura Suplementaria S1. Agradecemos a las instalaciones FACS del MDC por su apoyo técnico. Este manuscrito presenta parcialmente las figuras representativas presentadas a la revista Brain, Behavior and Immunity en 2024. La Figura 1A, la Figura 2A y la Figura Suplementaria S3A se crearon utilizando BioRender.com.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Dounce HomogenizerActive MotifCat# 40401
5 mL TubesEppendorfCat# 0030119452
Anti-CD11bThermoFisher ScientificCat# 25-0112-82
Anti-CD45BDCat# 559864
Anti-Ly6CBDCat# 553104
Anti-Ly6GBDCat# 551460
BCA Protein Assay KitPierceCat# 23227
C-TubesMiltenyi BiotechCat# 130-096-334
CD11b MicroBeadsMiltenyi BiotechCat# 130-093-634
CD16/CD32 AntibodyThermo Fisher ScientificCat#14-0161-82
Cytofix/Cytoperm KitBDCat# 554714
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoCat# 41966029
Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline  (DPBS)GibcoCat# 14190144
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes Thermo Fisher ScientificCat# 08-771-23
fixable viability dyeThermo Fisher ScientificCat# L34969
Hibernate A mediumThermoFisherCat# A1247501
LS-columnsMiltenyi BiotechCat# 130-042-401
Papain Dissociation SystemWorthingtonCat# LK003150
PercollTh.GeyerCat# 17-0891-02
Petri dishesThermo Fisher ScientificCat# 11339283
pHrodoRedThermo Fisher ScientificCat# P36600
Protease inhibitorRocheCat# 5892970001
Red Blood Cell Lysis BufferSigma Cat# 11814389001
Steritop E-GP Sterile Filtration SystemMerckCat# SEGPT0038
SynPer SolutionThermoFisherCat# 87793
vGLUT1 AntibodyMiltenyi BiotechCat# 130-120-764

Referencias

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