Modelización de la hidrocefalia poshemorrágica de la prematuridad en ratas

Resumen

La hidrocefalia poshemorrágica del prematuro (PHHP, por sus siglas en inglés) se puede modelar en ratas neonatas mediante la combinación de corioamnionitis y hemorragia intraventricular. La combinación de estos eventos prenatales y postnatales recapitula con precisión las características clínicas distintivas de la PHHP, incluida la macrocefalia, la ventriculomegalia y la presión intracraneal elevada, a lo largo de la vida.

Resumen

La hidrocefalia poshemorrágica del prematuro (PHHP, por sus siglas en inglés) es una secuela grave de una hemorragia intraventricular grave (IVH, por sus siglas en inglés) en recién nacidos muy prematuros con menos de 32 semanas de edad gestacional (AG). La PHHP se define por la acumulación de líquido cefalorraquídeo (LCR) asociada a síntomas clínicos de presión intracraneal (PIC) elevada. Los lactantes con PHHP sufren dependencia de la derivación de por vida, y la mitad de ellos requiere cirugía repetida en el primer año de vida y muchos requieren múltiples cirugías adicionales a lo largo de la vida. La corioamnionitis prenatal predispone a los recién nacidos prematuros a una hemorragia intraventricular grave y a la necesidad de tratamiento quirúrgico de las tendencias de PHHP con sepsis neonatal. Estas características clínicas sugieren que la inflamación sistémica es un componente integral de la fisiopatología de la PHHP.

Aquí, definimos un modelo animal que recapitula todos los aspectos clínicos y características esenciales de PHHP en ratas. El objetivo de este protocolo es ilustrar cómo la corioamnionitis intrauterina y la hemorragia intraventricular postnatal con glóbulos rojos lisados pueden combinarse para producir PHHP. Este abordaje preclínico produce macrocefalia progresiva y cráneos abovedados, presión intracraneal elevada y ventriculomegalia que se pueden detectar mediante imágenes por resonancia magnética (RM) o mediante microscopía. Además de la interrupción sostenida en la dinámica del LCR, las ratas también tienen retraso cognitivo y discapacidad funcional en la edad adulta. En consecuencia, esta plataforma preclínica facilita estudios traslacionales únicos e incomparables de PHHP que pueden incorporar medidas de resultados moleculares, celulares, bioquímicas, histológicas, de imágenes y funcionales. También se puede utilizar para el análisis riguroso del plexo coroideo, los cilios móviles ependimarios y el sistema glinfático en paralelo. Por último, también puede ser una herramienta preclínica invaluable para la investigación de nuevas estrategias de intervención quirúrgica y enfoques terapéuticos no quirúrgicos para el tratamiento de la hidrocefalia.

Introducción

La hidrocefalia poshemorrágica del prematuro (PHHP, por sus siglas en inglés) sigue siendo un problema importante de salud pública. Definida por la acumulación sintomática de líquido cefalorraquídeo (LCR) concomitante con presión intracraneal (PIC) elevada secundaria a hemorragia intraventricular (HIV), la HPH es una manifestación grave de la encefalopatía del prematuro y un contribuyente significativo a la carga global de prematuridad e hidrocefalia adquirida ^1,2. A nivel mundial, aproximadamente 400.000 lactantes nacen cada año con hidrocefalia o adquieren la carga de por vida de la hidrocefalia³ y muchos mueren debido a la falta de tratamiento³. La PHHP es común en los países desarrollados en recién nacidos muy prematuros (<32 semanas de gestación) con IVH grave, y a menudo afecta a los lactantes más enfermos que ya sufren otras comorbilidades potencialmente mortales ^4,5.

El único tratamiento disponible para la hidrocefalia es la cirugía⁶. Los procedimientos quirúrgicos producen una mayor longevidad cuando los lactantes tienen más de 6 meses en el momento de la primera intervención permanente, ya sea para una derivación ventriculoperitoneal (VP) para desviar el líquido cefalorraquídeo (LCR), una endoscópica del tercer ventriculostomía (ETV) o una ETV con coagulación del plexo coroideo (ETV-CPC)⁷. La opción más común, las derivaciones VP, a menudo fallan en un año y predisponen a los niños a una vida de complicaciones, cirugías repetidas y hospitalizaciones a un costo tremendo para el niño, la familia y la sociedad. ⁸ En particular, la ansiedad de que una derivación pueda fallar en cualquier momento es una carga para las familias⁹. La atención a los niños con hidrocefalia sintomática, incluidas las cirugías frecuentes, es una de las principales causas de gasto en atención médica pediátrica 10,11,12,13,14. El costo anual estimado de los gastos relacionados con la derivación en niños fue de 2.000 millones de dólares en 2003¹⁵. Mientras que los niños con derivaciones representan solo el 0,6% de las admisiones hospitalarias, generan el 3,1% de los gastos hospitalarios pediátricos¹⁵. Por lo tanto, el descubrimiento de terapias seguras y no quirúrgicas para el tratamiento de la PHHP es primordial.

En los bebés, la PHHP se desarrolla después de la hemorragia intraventricular durante un curso clínico que dura semanas o meses después de la identificación inicial de la hemorragia cerebral. Un estudio realizado por la Red de Investigación Clínica de Hidrocefalia (HCRN) confirmó que las derivaciones VP siguen siendo la mejor opción quirúrgica para los neonatos con PHHP¹⁶. Incluso para los niños con PHHP en países de ingresos altos con acceso a atención neuroquirúrgica pediátrica especializada, los resultados están lejos de ser óptimos, con >50% de las derivaciones colocadas en lactantes con PHHP que requieren revisión quirúrgica dentro de los primeros 2 años⁸. A pesar de la clara necesidad de identificar tratamientos más seguros y eficaces para la PHHP, la investigación se ha enfrentado a obstáculos. El progreso se ha visto obstaculizado en parte porque la literatura preclínica sobre PHHP a menudo no distingue adecuadamente la ventriculomegalia causada por hidrocefalia ex vacuo^17,18 de la hidrocefalia sintomática con macrocefalia^19,20. De hecho, los modelos de desarrollo de la hidrocefalia deben incluir la macrocefalia progresiva y/o las mediciones de la PIC elevada¹.

La combinación de conocimientos clínicos y preclínicos ha mejorado el diseño del estudio e impulsado nuestra comprensión de PHHP². Estudios realizados en diversos centros de todo el mundo han demostrado que la hemorragia intraventricular es más frecuente en neonatos muy prematuros secundarios a corioamnionitis 21,22,23,24,25,26,27,28. Además de la infección e inflamación de la placenta, la sepsis neonatal es un factor de riesgo adicional importante y puede desempeñar un papel central en la progresión de la hemorragia intraventricular a la ventriculomegalia sintomática y a la posterior intervención quirúrgica²⁹. Los datos preclínicos y clínicos apoyan que la inflamación transmitida por la sangre puede causar hidrocefalia²⁰, y la inflamación sistémica aumenta la secreción de LCR por el plexo coroideo³⁰. Además, los adultos con hemorragia subaracnoidea y hemorragia intraventricular que también sufren de sepsis tienen muchas más probabilidades de requerir una derivación³¹. La literatura más reciente ha confirmado que la inflamación reduce la propulsión de los cilios móviles ependimarios del LCR 19,20,32 y la reabsorción del LCR por el sistema glinfático 33,34,35,36. En general, la inflamación sistémica es un factor fisiopatológico y clínico clave en la PHHP¹.

Teniendo en cuenta estos hallazgos, creamos un modelo preclínico de PHHP apropiado para la edad. Este modelo combina la hemorragia intraventricular en el postnatal inmediato y temprano con la corioamnionitis, principal causa de parto prematuro¹⁹. Este abordaje experimental comienza en el útero, con la insuficiencia placentaria, la inflamación placentaria y la inflamación intraamniótica que definen la corioamnionitis ^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,}
23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40^,41,42,
43,44,45. En concreto, recapitulamos un síndrome de respuesta inflamatoria fetal, neutrofilia placentaria y microambiente proinflamatorio del SNC en el período prematuro mediante laparotomía abdominal en madres de ratas embarazadas en el día embrionario 18 (E18)37,38,39,40,41,42,43,44,45. La lesión intrauterina es inducida por la oclusión temporal de la arteria uterina bilateral que conduce a hipoxia-isquemia sistémica transitoria (TSHI) seguida de inyección intraamniótica de lipopolisacárido (LPS)37,38,39,40,41,42,43,44,45. Posteriormente, para alterar la dinámica del LCR y catalizar el desarrollo de hidrocefalia en las crías nacidas vivas, se induce la hemorragia intraventricular en el día 1 postnatal. Esto se logra con la inyección intracerebroventricular (ICV) bilateral de glóbulos rojos (RBC) lisados en los ventrículos laterales 19,37,44. Las crías se estudian a medida que se desarrolla la hidrocefalia y a lo largo de su vida.

Protocolo

El Comité de Cuidado y Uso de Animales (ACUC, por sus siglas en inglés) de la Universidad Johns Hopkins aprobó todos los procedimientos experimentales descritos en este documento. Este protocolo utiliza madres y cachorros de ratas Sprague-Dawley preñadas de ambos sexos.

1. Inducción de corioamnionitis en E18

NOTA: La parte de insulto en el útero de este protocolo se ha publicado previamente en detalle, se resume arriba y es objeto de un protocolo JOVE separado y video 19,37,38,39,40,41,42,43,44,46. Brevemente, ratas hembras Sprague-Dawley preñadas se someten a una laparotomía abdominal en el día embrionario 18 (E18) para inducir corioamnionitis, que incluye TSHI y administración de LPS intraamniótico.

1. Anestesia
   1. Inducir la anestesia en la madre de ratas preñadas E18 con isoflurano al 2-4%.
   2. Retire la madre embarazada de la cámara de inducción y coloque a la rata en posición supina sobre una manta quirúrgica de agua circulante colocada a 37 °C.
   3. Aplique ungüento oftálmico para prevenir la sequedad de la córnea. Apriete suavemente una pata para confirmar la ausencia de reflejo de pellizco del dedo del pie. Controle la profundidad del anestésico cada 15-20 minutos y aumente el isoflurano en caso de una respuesta positiva al pinzamiento de los dedos del pie.
   4. Administrar buprenorfina de liberación prolongada (0,1 mg/kg SC) en la nuca.
2. Preparación quirúrgica y exfoliación
   1. Usando una técnica estéril estándar, afeita el abdomen.
   2. Frote el abdomen 3 veces con betadine alternado y etanol al 70%.
   3. Cubra al animal con paños quirúrgicos estériles.
3. Laparotomía abdominal
   1. Realice una incisión de 3 cm en la línea media de la piel abdominal preparada con un bisturí.
   2. Utilice fórceps y tijeras quirúrgicas para sujetar la capa fascial abdominal y haga una incisión de la línea avascular alba de la capa muscular para acceder a la cavidad peritoneal.
   3. Exteriorizar el útero.
   4. Aísle y pinje las arterias uterinas con clips para aneurismas durante 60 minutos. Mantenga la temperatura y mantenga húmedo el contenido intraabdominal con solución salina estéril.
   5. Retire las pinzas e inyecte 100 μL de LPS (4 μg/saco de solución de LPS) en cada saco amniótico de cada feto. No moleste al feto ni a la placenta.
   6. Irrigar los cuernos uterinos y plantar generosamente 3 veces con solución salina estéril.
4. Cierre de la laparotomía
   1. Reemplace los cuernos uterinos en la cavidad peritoneal.
   2. Reaproximar los bordes de la capa musculofascial y cerrar con una sutura 3-0 corrida.
   3. Vuelva a aproximar la capa de piel y cierre la piel con una sutura 3-0 en ejecución.
   4. Utilice una aguja de 26 G para inyectar bupivacaína al 0,125% por vía subcutánea alrededor de los bordes de la herida.
   5. En el caso de los controles simulados, realice la laparotomía durante el mismo período de tiempo para controlar la duración de la anestesia. No pinza las arterias y no administre inyecciones intraamnióticas. Al final del procedimiento, cierre la laparotomía en dos capas (fascia muscular abdominal y piel) con sutura 3-0. En todos los casos, las crías nacen a término (E21/22) y son cuidadas por la madre.

2. Preparación de glóbulos rojos lisados en P1

1. Recolección de sangre
   1. Tome un cachorro de rata Sprague-Dawley macho y una hembra en el día postnatal 1 (P1) de una camada que experimentó corioamnionitis en E18. Decapita rápidamente a cada cachorro donante con tijeras quirúrgicas específicas.
      NOTA: Utilizamos 1 cachorro macho y 1 hembra para la recolección de sangre para eliminar un posible sesgo sexual al representar a cada uno en las cohortes de donantes. Además, utilizamos una pareja emparejada por sexo para garantizar suficiente volumen y rendimiento de glóbulos rojos lisados para inyectar a sus compañeros de camada. Por lo general, cada cachorro donante produce suficientes glóbulos rojos lisados para realizar la inyección de ICV en un máximo de 4-5 compañeros de camada.
   2. Recoja la sangre inmediatamente en un tubo de microcentrífuga de 2 mL que contenga 0,2 mL de solución salina estéril, teniendo cuidado de recolectar solo la sangre que fluye libremente después de la decapitación y no raspar ni apretar para producir más sangre, ya que esto conduce a una hemólisis prematura. Pozo de vórtice.
      NOTA: La cantidad exacta de sangre varía según el animal donante y el peso individual, pero debe ser máxima manteniendo las precauciones anteriores.
   3. Picar o picar los coágulos de sangre con unas tijeras quirúrgicas pequeñas.
   4. Centrifugar la suspensión sanguínea a 500 × g durante 10 min a 4 ^oC, retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 0,2 mL de solución salina estéril. Pozo de vórtice.
   5. Picar / picar los coágulos de sangre residuales posteriores al vórtice con tijeras quirúrgicas pequeñas.
   6. Repita los pasos 2.1.4-2.1.5 dos veces más para un total de 3 veces, limpiando las tijeras quirúrgicas con etanol en aerosol al 70% entre cada ronda de lisado.
2. Lisis de glóbulos rojos
   1. Después de la centrifugación final, agregue 0,25 mL de solución salina estéril al pellet; pozo de vórtice.
   2. Coloque la suspensión sobre hielo seco durante 5 min.
   3. Retire la suspensión del hielo seco, colóquela en una incubadora a 37,5 ^oC durante 5 minutos hasta que se descongele por completo y haga un buen vórtice.
   4. Repita los ciclos de congelación y descongelación por un total de 3 veces (tres congelaciones y tres descongelaciones).
   5. Al final del último deshielo, haga vórtice y realice un giro rápido. Los glóbulos rojos ya están lisados y listos para usar.
      NOTA: La mezcla debe tener un color opaco similar al jugo de tomate y debe introducirse fácilmente en las jeringas.

3. Inyecciones intracerebroventriculares de glóbulos rojos lisados en P1

1. Anestesia mediante hipotermia
   1. Coloque una pequeña plataforma sobre hielo húmedo para que se enfríe.
   2. Coloque una toallita de laboratorio seca encima para proteger la piel del cachorro.
      NOTA: Esta superficie plana y fría se utiliza para anestesiar e inyectar a los cachorros.
   3. Transfiera al cachorro (P1 de edad) desde la almohadilla térmica a la toallita de trabajo sobre la plataforma fría para inducir la anestesia por hipotermia.
   4. Confirme la profundidad de la anestesia apretando una pata y confirmando la ausencia del reflejo de pinzamiento del dedo del pie.
   5. Ajuste una lámpara quirúrgica externa a sus configuraciones más brillantes.
   6. Con un asistente que usa sus dedos índice y medio para mantener suavemente la línea media de la cabeza del animal, transilumine el cráneo para visualizar los ventrículos laterales a través del cráneo. Identifique el bregma visualizando el seno sagital superior (línea media) a través de la piel y la palpación de la sutura coronal con pinzas finas como puntos de referencia que se cruzan.
2. Inyección de ICV
   1. Limpie la cabeza del cachorro anestesiado con un hisopo de algodón empapado en etanol al 70%.
   2. Identifique y marque el lugar de la inyección como 1 mm lateral de la sutura sagital, a medio camino entre lambda y bregma.
   3. Después de la visualización, utilice una jeringa de insulina de 0,3 ml, 8 mm de largo y 31 g con una aguja percutánea ultrafina para inyectar 20 μl de glóbulos rojos lisados en el ventrículo lateral derecho. Inserte la aguja directamente hacia abajo utilizando la técnica a mano alzada hasta una profundidad de aproximadamente la mitad de la longitud de la aguja e inyecte y retire la aguja lentamente (proceso de inyección y extracción durante aproximadamente 10-15 s).
   4. Deje la aguja en su lugar durante varios segundos después de la inyección para evitar la salida de los glóbulos rojos lisados inyectados.
   5. Repita con el ventrículo lateral izquierdo e inyecte 20 μL de glóbulos rojos lisados.
   6. Coloque al cachorro en una almohadilla térmica a 37,5 ^oC para recuperarse de la anestesia.
   7. Registre el sexo del cachorro y asigne un identificador único de animal.
   8. Regrese al cachorro a la jaula de inicio solo después de que se haya recuperado por completo en la almohadilla de calentamiento y haya recuperado la conciencia de modo que el animal pueda mantener la decúbito esternal de manera segura.
   9. Monitoree a diario a todas las crías de rata para verificar su salud y bienestar.

4. Confirmación de éxito de hemorragia intraventricular bilateral en P2

1. Ecografía de la cabeza
   1. Para prepararse para la ecografía de la cabeza, retire a los cachorros P2 de su jaula doméstica.
   2. Coloque gel de ultrasonido en la sonda de ultrasonido y coloque la sonda sobre la parte superior del cráneo.
   3. Con una presión extremadamente ligera, mueva la sonda para visualizar los ventrículos. Confirmar la hiperecogenicidad bilateral en los ventrículos laterales representativos de la hemorragia intraventricular.

5. Confirmación de hidrocefalia poshemorrágica exitosa

1. Medición de la distancia intraaural (DIA), un sustituto de la circunferencia de la cabeza, para confirmar la macrocefalia
   1. Para prepararse para la medición, adquiera una pequeña cinta métrica apropiada para medir la circunferencia de la cabeza, idealmente con designaciones de milímetros claramente visualizadas.
   2. Pídele a un observador enmascarado que saque al cachorro de la jaula de su casa.
   3. Mientras sostiene suavemente al cachorro, mida la distancia de oreja a oreja (distancia intraaural, IAD) y registre el valor en milímetros.
   4. Repita el IAD diariamente de P1 a P15 y grafique los valores. Realice un seguimiento en serie de la IAD y vuelva a medir en P21 al reubicar a las crías en nuevas jaulas separadas físicamente de la madre (que es el punto de tiempo estándar para el destete de las crías). Repita la IAD posteriormente cada 5 días a partir de P25 hasta P60.
2. Medición de la presión de apertura para confirmar la presión intracraneal elevada
   1. Pídele a un observador enmascarado que saque al cachorro de su jaula de origen.
   2. Anestesiar con 75-100 mg/kg de ketamina intraperitoneal (IP) y 5-10 mg/kg de xilacina IP en preparación para la eutanasia.
   3. Verifique la profundidad de la anestesia apretando una pata y confirmando la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie/pedal.
   4. Inserte una aguja pequeña (31 G) conectada a un manómetro en el espacio del líquido cefalorraquídeo de la unión cervicomedular.
   5. Registre la presión de apertura en el manómetro.
   6. Retire la aguja y decapita a la rata con unas tijeras afiladas y proceda a la recolección de tejidos.
3. Resonancia magnética (RM) ex vivo para la evaluación de la ventriculomegalia
   1. Anestesiar con 75-100 mg/kg de ketamina intraperitoneal (IP) y 5-10 mg/kg de xilacina IP en preparación para la eutanasia.
   2. Verifique la profundidad de la anestesia apretando una pata y confirmando la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie/pedal.
   3. Perfundir las ratas con solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguida de paraformaldehído (PFA) al 4% hasta que se fijen bien.
   4. Extirpar el cerebro y fijarlo en PFA al 4%
   5. Incrustar el cerebro en agarosa al 2% en un tubo cónico de 50 mL. Déjalo reposar a temperatura ambiente.
   6. Transfiera el cerebro al escáner de resonancia magnética para una resonancia magnética ex vivo .
   7. Ejecute 11.7T MRI de la siguiente manera: T2 Turbo RARE; TE/TR = 30,0/3000 ms; promedio = 2; Espaciado de eco = 10.000 ms; Factor de rareza = 8; número de rebanadas = 30; espesor de la loncha = 1 mm; tamaño de la imagen = 128 x 128; FOV = 28 mm x 28 mm; resolución de corte = 0,219 x 0,219 mm²; FA = 90,0°.
      NOTA: Si bien las imágenes de resonancia magnética proporcionan evidencia de un modelado exitoso de PHHP, no es necesario escanear todos los cerebros de una cohorte determinada para verificar el PHHP. La medición de IAM e ICP es suficiente para verificar como se describe anteriormente. En última instancia, la capacidad de un investigador para realizar resonancias magnéticas in vivo o ex vivo dependerá de una variedad de factores, como el acceso al escáner de resonancia magnética, los fondos y la capacidad técnica. Este paso es particularmente útil para la validación cuando se incorpora recientemente el modelo PHHP. Es clave señalar que, en ausencia de signos documentados de aumento de la presión intracraneal, como una presión de apertura elevada, los hallazgos aislados de ventriculomegalia en las imágenes de RMN no representan hidrocefalia.

Resultados

Con este modelo, la hidrocefalia se desarrolla en los días y semanas posteriores a la inyección de glóbulos rojos lisados. En la Figura 1 se proporciona una representación de un diseño experimental típico y la progresión de la hidrocefalia. Se evaluaron 5-6 animales simulados y 6-8 animales PHHP por grupo. Cuando eran jóvenes, las ratas con PHHP exhibieron macrocefalia (Figura 2), presión intracraneal elevada (

Discusión

Este protocolo para la inducción de PHHP permite medidas de resultado rigurosas, cuantificables y clínicamente traducibles de la estructura y función cerebral concomitantes con las características fenotípicas de la hidrocefalia, incluida la elevación crónica de la PIC, la ventriculomegalia y la macrocefalia, desde el nacimiento hasta la edad adulta⁴. Los ensayos bioquímicos, histológicos y funcionales se pueden utilizar para evaluar la salud del plexo cor...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% ethanol	Pharmco	111000200	Diluted to 70%
Betadine surgical scrub	Cardinal Health	NDC-67618-151-17
Blunt Forceps	Roboz	RS-8100
Bravmini Plus Cordless Rechargeable Trimmer	Wahl	41590-0438
Carbon Steel Surgical blades	Bard-Parker	371151-11
centrifuge	Eppendorf	5424R
Cotton Gauze Sponge	Fisherbrand	22-362-178	Small, 6 inch sterile
Cotton-tipped Applicators	Fisherbrand	23-400-114	30 G 1
Eye Lubricant	Refresh Lacri Lube	75929
Far infrared warming pad	Kent scientific	RT-0501
Incubator -  Genie Temp-Shaker 100	Scientific Industries	SI-G100
Insulin Syringes	BD	328438	0.3 cc 3 mm 31 G, ultrafine
Isoflurane	Covetrus	11695067772
Ketamine hydrochloride injection	Dechra	17033-101-10
Kimwipes	Kimtech Science	BXTNI141300
LPS 011B4	Sigma	L2630
microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	3453	2.0 mL
Needle	BD	305122	1 mL
Needle	BD	305128	25 G 5/8
Needle Holders	Kent Scientific Corp.	INS14109	12.5 CM STR
OR Towels	Cardinal Health	287000-008
Paper measuring tape	Cardinal Health	SKU
Saline Solution, 0.9%	Sigma	S8776
Scissors	Roboz	RS-6808
SomnoSuite	Kent Scientific	SS6823B
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62	Sterile
Surgical gloves	Biogel	40870
Surgical Scissors	Roboz	RS-5880
Surgical Scissors	EST	14002-16
Syringe	BD	309628
T/Pump (Heat Therapy Pump)	Stryker Medical	TP700
Vessel Clips	Kent Scientific Corp.	INS14120	30 G Pressure
Xylazine injection	vet one	NDC 13985-704-10