Modellazione dell'idrocefalo postemorragico del prematuro nei ratti

Riepilogo

L'idrocefalo postemorragico del prematuro (PHHP) può essere modellato nei ratti neonatali combinando corioamnionite ed emorragia intraventricolare. La combinazione di questi eventi prenatali e postnatali ricapitola accuratamente i segni clinici distintivi della PHHP, tra cui macrocefalia, ventricolomegalia ed elevata pressione intracranica, per tutta la durata della vita.

Abstract

L'idrocefalo postemorragico del prematuro (PHHP) è una grave sequela di grave emorragia intraventricolare (IVH) nei neonati molto prematuri di età gestazionale (GA) di età inferiore alle 32 settimane. La PHHP è definita dall'accumulo di liquido cerebrospinale (CSF) associato a sintomi clinici di pressione intracranica elevata (ICP). I neonati con PHHP soffrono di dipendenza dallo shunt per tutta la vita, con la metà che richiede un intervento chirurgico ripetuto nel primo anno di vita e molti che richiedono più interventi chirurgici aggiuntivi nel corso della vita. La corioamnionite prenatale predispone i neonati prematuri a una grave IVH e alla necessità di un trattamento chirurgico delle tendenze della PHHP con sepsi neonatale. Queste caratteristiche cliniche suggeriscono che l'infiammazione sistemica è una componente integrante della fisiopatologia della PHHP.

Qui, definiamo un modello animale che ricapitola tutti gli aspetti clinici e le caratteristiche essenziali della PHHP nei ratti. L'obiettivo di questo protocollo è illustrare come la corioamnionite in utero e l'IVH postnatale utilizzando globuli rossi lisati possano essere combinate per produrre PHHP. Questo approccio preclinico produce macrocefalia progressiva e crani a cupola, elevata pressione intracranica e ventricolomegalia che possono essere rilevati tramite risonanza magnetica (MRI) o microscopia. Oltre all'interruzione prolungata delle dinamiche del liquido cerebrospinale, i ratti hanno anche ritardo cognitivo e disabilità funzionale nell'età adulta. Di conseguenza, questa piattaforma preclinica facilita studi traslazionali unici e senza precedenti di PHHP che possono incorporare misure di esito molecolari, cellulari, biochimiche, istologiche, di imaging e funzionali. Può anche essere utilizzato per un'analisi rigorosa del plesso coroideo, delle ciglia mobili ependimali e del sistema glinfatico in parallelo. Infine, può anche essere un prezioso strumento preclinico per lo studio di nuove strategie di intervento chirurgico e approcci terapeutici non chirurgici per il trattamento dell'idrocefalo.

Introduzione

L'idrocefalo postemorragico del prematuro (PHHP) rimane un problema sostanziale per la salute pubblica. Definita dall'accumulo sintomatico di liquido cerebrospinale (CSF) concomitante con elevata pressione intracranica (ICP) secondaria a emorragia intraventricolare (IVH), la PHHP è una grave manifestazione di encefalopatia del prematuro e contribuisce in modo significativo al carico globale del prematuro e dell'idrocefalo acquisito ^1,2. A livello globale, circa 400.000 neonati ogni anno nascono o acquisiscono il peso permanente dell'idrocefalo³ e molti muoiono a causa della mancanza di trattamento³. La PHHP è comune nei paesi sviluppati nei neonati molto prematuri (<32 settimane di gestazione) con IVH grave e spesso colpisce i neonati più malati che già soffrono di altre comorbilità potenzialmente letali ^4,5.

L'unico trattamento disponibile per l'idrocefalo è la chirurgia⁶. Le procedure chirurgiche producono una migliore longevità quando i neonati hanno più di 6 mesi al momento del primo intervento permanente, sia per uno shunt ventricoloperitoneale (VP) per deviare il liquido cerebrospinale (CSF), sia per la terza ventricolostomia endoscopica (ETV) o per l'ETV con coagulazione del plesso coroideo (ETV-CPC)⁷. L'opzione più comune, gli shunt VP, spesso fallisce entro un anno e predispone i bambini a una vita di complicazioni, interventi chirurgici ripetuti e ricoveri ospedalieri a un costo enorme per il bambino, la famiglia e la società. ⁸ In particolare, l'ansia derivante da uno shunt che potrebbe non funzionare in qualsiasi momento è gravosa per le famiglie⁹. L'assistenza ai bambini con idrocefalo sintomatico, compresi gli interventi chirurgici frequenti, è una delle principali cause di spesa sanitaria pediatrica 10,11,12,13,14. Il costo annuo stimato per le spese relative allo shunt nei bambini era di 2 miliardi di dollari nel 2003¹⁵. Sebbene i bambini con shunt rappresentino solo lo 0,6% dei ricoveri ospedalieri, generano il 3,1% delle spese ospedaliere pediatriche¹⁵. Pertanto, la scoperta di terapie sicure e non chirurgiche per il trattamento della PHHP è fondamentale.

Nei neonati, la PHHP si sviluppa dopo IVH in un decorso clinico che dura settimane o mesi dopo l'identificazione iniziale dell'emorragia cerebrale. Uno studio condotto dall'Hydrocephalus Clinical Research Network (HCRN) ha confermato che gli shunt VP rimangono la migliore opzione chirurgica per i neonati con PHHP¹⁶. Anche per i bambini con PHHP nei paesi ad alto reddito con accesso a cure neurochirurgiche pediatriche qualificate, i risultati sono tutt'altro che ottimali, con il >50% degli shunt posizionati nei neonati con PHHP che richiedono una revisione chirurgica entro i primi 2 anni⁸. Nonostante la chiara necessità di identificare trattamenti più sicuri ed efficaci per la PHHP, la ricerca ha incontrato ostacoli. I progressi sono stati ostacolati in parte dal fatto che la letteratura preclinica sulla PHHP spesso non riesce a distinguere in modo appropriato la ventricolomegalia causata da idrocefalo ex vacuo ^17,18 dall'idrocefalo sintomatico con macrocefalia^19,20. Infatti, i modelli di sviluppo dell'idrocefalo dovrebbero includere la macrocefalia progressiva e/o la misurazione di ICP¹ elevata.

L'unione di intuizioni cliniche e precliniche ha migliorato il disegno dello studio e ha spinto la nostra comprensione di PHHP². Studi condotti in diversi centri in tutto il mondo hanno dimostrato che l'IVH è più comune nei neonati molto pretermine secondari alla corioamnionite 21,22,23,24,25,26,27,28. Oltre all'infezione e all'infiammazione della placenta, la sepsi neonatale è un ulteriore importante fattore di rischio e può svolgere un ruolo centrale nella progressione dall'IVH alla ventricolomegalia alla PHHP sintomatica e al successivo intervento chirurgico²⁹. I dati preclinici e clinici supportano che l'infiammazione trasmessa per via ematica può causare idrocefalo²⁰ e l'infiammazione sistemica aumenta la secrezione di liquido cerebrospinale da parte del plesso^{coroideo 30}. Inoltre, gli adulti con emorragia subaracnoidea e IVH che soffrono anche di sepsi hanno molte più probabilità di richiedere uno shunt³¹. La letteratura più recente ha confermato che l'infiammazione riduce la propulsione delle ciglia mobili ependimali del liquido cerebrospinale 19,20,32 e il riassorbimento del liquido cerebrospinale da parte del sistema glinfatico 33,34,35,36. Nel complesso, l'infiammazione sistemica è un fattore fisiopatologico e clinico chiave nella PHHP¹.

Considerando questi risultati, abbiamo creato un modello preclinico di PHHP adatto all'età. Questo modello combina l'IVH nel periodo postnatale immediato e precoce con la corioamnionite, la principale causa di parto pretermine¹⁹. Questo approccio sperimentale inizia in utero, con l'insufficienza placentare, l'infiammazione placentare e l'infiammazione intraamniotica che definisce la corioamnionite ^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,}
23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40^,41,42,
43,44,45. In particolare, ricapitoliamo una sindrome da risposta infiammatoria fetale, neutrofilia placentare e microambiente proinfiammatorio del SNC nel periodo pretermine tramite laparotomia addominale in madri di ratto gravide al giorno 18 (E18)37,38,39,40,41,42,43,44,45. La lesione intrauterina è indotta da un'occlusione bilaterale temporanea dell'arteria uterina che porta a ipossia-ischemia sistemica transitoria (TSHI) seguita da iniezione intraamniotica di lipopolisaccaride (LPS)37,38,39,40,41,42,43,44,45. Successivamente, per perturbare la dinamica del liquido cerebrospinale e catalizzare lo sviluppo dell'idrocefalo nei cuccioli nati vivi, l'IVH viene indotta il giorno postnatale 1. Ciò si ottiene con l'iniezione intracerebroventricolare bilaterale (ICV) di globuli rossi lisati (RBC) nei ventricoli laterali 19,37,44. I cuccioli vengono quindi studiati durante lo sviluppo dell'idrocefalo e per tutta la loro vita.

Protocollo

L'Animal Care and Use Committee (ACUC) della Johns Hopkins University ha approvato tutte le procedure sperimentali qui descritte. Questo protocollo utilizza madri di ratti Sprague-Dawley gravide e cuccioli di entrambi i sessi.

1. Induzione della corioamnionite su E18

NOTA: La parte relativa all'insulto in utero di questo protocollo è stata precedentemente pubblicata in dettaglio, è riassunta sopra ed è oggetto di un protocollo JOVE separato e di un video 19,37,38,39,40,41,42,43,44,46. In breve, le femmine di ratto Sprague-Dawley gravide vengono sottoposte a laparotomia addominale al giorno embrionale 18 (E18) per indurre la corioamnionite, che include la somministrazione di TSHI e LPS intraamniotico.

1. Anestesia
   1. Indurre l'anestesia nella madre di ratto gravida E18 con isoflurano al 2-4%.
   2. Rimuovere la madre gravida dalla camera di induzione e posizionare il ratto in posizione supina su una coperta chirurgica drappeggiata di acqua circolante impostata a 37 °C.
   3. Applicare un unguento oftalmico per prevenire l'essiccazione corneale. Stringere delicatamente una zampa per confermare l'assenza del riflesso di pizzicamento delle dita. Monitorare la profondità dell'anestetico ogni 15-20 minuti e aumentare l'isoflurano in caso di una risposta positiva al pizzicamento delle dita.
   4. Somministrare buprenorfina a rilascio prolungato (0,1 mg/kg SC) sulla nuca.
2. Preparazione chirurgica e scrub
   1. Utilizzando la tecnica sterile standard, radere l'addome.
   2. Strofinare l'addome 3 volte con betadina alternata ed etanolo al 70%.
   3. Avvolgere l'animale con teli chirurgici sterili.
3. Laparotomia addominale
   1. Praticare un'incisione della linea mediana di 3 cm sulla pelle addominale preparata con un bisturi.
   2. Usa pinze e forbici chirurgiche per sostenere lo strato fasciale addominale e praticare un'incisione della linea alba avascolare dello strato muscolare per accedere alla cavità peritoneale.
   3. Esternalizzare l'utero.
   4. Isolare e bloccare le arterie uterine con clip per aneurisma per 60 minuti. Mantenere la temperatura e mantenere il contenuto intraaddominale umido con soluzione fisiologica sterile.
   5. Rimuovere le clip e iniettare 100 μL di LPS (4 μg/sacca di soluzione di LPS) in ciascun sacco amniotico di ciascun feto. Non disturbare il feto o la placenta.
   6. Irrigare le corna uterine e il campo generosamente 3 volte con soluzione fisiologica sterile.
4. Chiusura della laparotomia
   1. Sostituire le corna uterine nella cavità peritoneale.
   2. Riapprossimare i bordi dello strato muscolo-fasciale e chiudere con una sutura 3-0 in esecuzione.
   3. Riapprossimare lo strato cutaneo e chiudere la pelle utilizzando una sutura 3-0 in esecuzione.
   4. Utilizzare un ago da 26 G per iniettare per via sottocutanea lo 0,125% di bupivacaina attorno ai bordi della ferita.
   5. Per i controlli fittizi, eseguire la laparotomia per lo stesso periodo di tempo per controllare la durata dell'anestesia. Non bloccare le arterie e non somministrare iniezioni intraamniotiche. Al termine della procedura, chiudere la laparotomia in due strati (fascia muscolare addominale e cute) utilizzando una sutura 3-0. In tutti i casi, i cuccioli nascono a termine (E21/22) e vengono accuditi dalla madre.

2. Preparazione dei globuli rossi lisati su P1

1. Raccolta del sangue
   1. Prendi un cucciolo di ratto Sprague-Dawley maschio e una femmina al giorno 1 postnatale (P1) da una cucciolata che ha avuto corioamnionite su E18. Decapita rapidamente ogni cucciolo donatore con forbici chirurgiche dedicate.
      NOTA: Utilizziamo 1 cucciolo maschio e 1 femmina per la raccolta del sangue per eliminare un potenziale pregiudizio sessuale rappresentando ciascuno nelle coorti di donatori. Inoltre, utilizziamo una coppia di sesso abbinato per garantire un volume e una resa sufficienti di globuli rossi lisati per iniettare i loro compagni di cucciolata. In genere, ogni cucciolo donatore produce abbastanza globuli rossi lisati per eseguire l'iniezione di ICV su un massimo di 4-5 cucciolate.
   2. Raccogliere immediatamente il sangue in una provetta da microcentrifuga da 2 ml contenente 0,2 ml di soluzione fisiologica sterile, facendo attenzione a raccogliere solo il sangue a flusso libero dopo la decapitazione e a non raschiare o spremere per produrre più sangue poiché ciò porta a un'emolisi prematura. Vortice bene.
      NOTA: La quantità esatta di sangue varia in base al singolo animale donatore e al peso, ma dovrebbe essere massima mantenendo le precauzioni di cui sopra.
   3. Tritare/tritare i coaguli di sangue con piccole forbici chirurgiche.
   4. Centrifugare la sospensione ematica a 500 × g per 10 minuti a 4 ^oC, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 0,2 mL di soluzione fisiologica sterile. Vortice bene.
   5. Tritare/tritare i coaguli di sangue residui post vortice con piccole forbici chirurgiche.
   6. Ripetere i passaggi 2.1.4-2.1.5 altre due volte per un totale di 3x, pulendo le forbici chirurgiche con spray di etanolo al 70% tra un ciclo di lisi e l'altro.
2. Lisi dei globuli rossi
   1. Dopo la centrifugazione finale, aggiungere 0,25 mL di soluzione fisiologica sterile al pellet; vortice bene.
   2. Posizionare la sospensione su ghiaccio secco per 5 minuti.
   3. Togliere la sospensione dal ghiaccio secco, metterla in un'incubatrice a 37,5 ^oC per 5 minuti fino a completo scongelamento e agitare bene.
   4. Ripetere i cicli di congelamento e scongelamento per un totale di 3 volte (tre congelamenti e tre scongelamenti).
   5. Al termine dell'ultimo disgelo, vorticare ed eseguire un giro veloce. I globuli rossi sono ora lisati e pronti per l'uso.
      NOTA: La miscela deve essere di un colore opaco simile al succo di pomodoro ed essere facilmente aspirabile nelle siringhe.

3. Iniezioni intracerebroventricolari di globuli rossi lisati su P1

1. Anestesia mediante ipotermia
   1. Metti una piccola piattaforma sul ghiaccio bagnato per raffreddare.
   2. Metti sopra una salvietta da laboratorio asciutta per proteggere la pelle del cucciolo.
      NOTA: Questa superficie piana e fredda viene utilizzata per l'anestetizzazione e l'iniezione dei cuccioli.
   3. Trasferire sul cucciolo (di età P1) dal cuscinetto riscaldante sulla salvietta da lavoro sopra la piattaforma fredda per indurre l'anestesia per ipotermia.
   4. Confermare la profondità dell'anestesia stringendo una zampa e confermando l'assenza del riflesso di pizzicamento delle dita.
   5. Impostare una lampada chirurgica esterna sulle impostazioni più luminose.
   6. Con un assistente che usa l'indice e il medio per mantenere delicatamente la linea mediana della testa dell'animale, transillumina il cranio per visualizzare i ventricoli laterali attraverso il cranio. Identificare la bregma visualizzando il seno sagittale superiore (linea mediana) attraverso la pelle e la palpazione della sutura coronale con una pinza sottile come punti di riferimento intersecanti.
2. Iniezione ICV
   1. Pulisci la testa del cucciolo anestetizzato con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70%.
   2. Identificare e contrassegnare il sito di iniezione a 1 mm lateralmente dalla sutura sagittale, a metà strada tra lambda e bregma.
   3. Dopo la visualizzazione, utilizzare una siringa da insulina da 0,3 mL, lunga 8 mm, da 31 G con un ago percutaneo ultrasottile per iniettare 20 μL di globuli rossi lisati nel ventricolo laterale destro. Inserire l'ago verso il basso usando la tecnica a mano libera a una profondità di circa la metà della lunghezza dell'ago e iniettare e rimuovere l'ago lentamente (processo di iniezione e rimozione in circa 10-15 s).
   4. Lasciare l'ago in posizione per alcuni secondi dopo l'iniezione per evitare la fuoriuscita dei globuli rossi lisati iniettati.
   5. Ripetere con il ventricolo laterale sinistro e iniettare 20 μL di globuli rossi lisati.
   6. Posiziona il cucciolo su un tappetino riscaldante impostato a 37,5 ^oC per riprendersi dall'anestesia.
   7. Registra il sesso del cucciolo e assegna un identificatore univoco dell'animale.
   8. Riportare il cucciolo nella gabbia di casa solo dopo il completo recupero sul tappetino riscaldante e aver ripreso conoscenza in modo tale che l'animale possa mantenere in sicurezza la decubito sternale.
   9. Monitora quotidianamente tutti i cuccioli di ratto per la salute e il benessere.

4. Conferma del successo dell'emorragia intraventricolare bilaterale su P2

1. Ecografia della testa
   1. Per prepararsi all'ecografia della testa, rimuovi i cuccioli di P2 dalla gabbia di casa.
   2. Posizionare il gel per ultrasuoni sulla sonda per ultrasuoni e posizionare la sonda sopra il cranio.
   3. Con una pressione estremamente leggera, muovere la sonda per visualizzare i ventricoli. Confermare l'iperecogenicità bilaterale nei ventricoli laterali che rappresentano l'IVH.

5. Conferma dell'esito positivo dell'idrocefalo postemorragico

1. Misurazione della distanza intraaurale (IAD), un surrogato della circonferenza cranica, per confermare la macrocefalia
   1. Per prepararsi alla misurazione, procurarsi un piccolo metro a nastro adatto a misurare la circonferenza della testa, idealmente con designazioni millimetriche chiaramente visualizzate.
   2. Chiedi a un osservatore mascherato di rimuovere il cucciolo dalla gabbia di casa.
   3. Tenendo delicatamente il cucciolo, misurare la distanza da un orecchio all'altro (distanza intraaurale, IAD) e registrare il valore in millimetri.
   4. Ripeti IAD ogni giorno da P1 a P15 e rappresenta graficamente i valori. Traccia in serie l'IAD e misura di nuovo a P21 al momento del trasferimento dei cuccioli in nuove gabbie fisicamente separate dalla madre (che è il punto di tempo standard per lo svezzamento dei cuccioli). Ripetere successivamente IAD ogni 5 giorni a partire da P25 fino a P60.
2. Misurazione della pressione di apertura per confermare l'elevata pressione intracranica
   1. Chiedi a un osservatore mascherato di rimuovere il cucciolo dalla sua gabbia domestica.
   2. Anestetizzare con 75-100 mg/kg di ketamina intraperitoneale (IP) e 5-10 mg/kg di xilazina IP in preparazione all'eutanasia.
   3. Controllare la profondità dell'anestesia stringendo una zampa e confermando l'assenza del riflesso del pizzicamento del dito del piede/pedale.
   4. Inserire un piccolo ago (31 G) collegato a un manometro nello spazio della giunzione cervico-midollare nel liquido cerebrospinale.
   5. Registrare la pressione di apertura sul manometro.
   6. Togliete l'ago e decapitate il ratto con delle forbici affilate e procedete con la raccolta dei tessuti.
3. Risonanza magnetica (MRI) ex-vivo per la valutazione della ventricolomegalia
   1. Anestetizzare con 75-100 mg/kg di ketamina intraperitoneale (IP) e 5-10 mg/kg di xilazina IP in preparazione all'eutanasia.
   2. Controllare la profondità dell'anestesia stringendo una zampa e confermando l'assenza del riflesso del pizzicamento del dito del piede/pedale.
   3. Perfondere i ratti con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), seguita da paraformaldeide (PFA) al 4% fino a quando non si è ben fissata.
   4. Rimuovi il cervello e fissa il cervello al 4% di PFA
   5. Incorporare il cervello in agarosio al 2% in una provetta conica da 50 mL. Lasciate riposare a temperatura ambiente.
   6. Trasferire il cervello allo scanner MRI per la risonanza magnetica ex vivo .
   7. Eseguire la risonanza magnetica 11.7T come segue: T2 Turbo RARO; TE/TR = 30,0/3000 ms; media = 2; Spaziatura dell'eco = 10.000 ms; fattore RARE = 8; numero di fette = 30; spessore fetta = 1 mm; dimensione dell'immagine = 128 x 128; Campo visivo = 28 mm x 28 mm; risoluzione fetta = 0,219 x 0,219 mm²; FA = 90,0°.
      NOTA: Sebbene la risonanza magnetica fornisca la prova del successo della modellazione PHHP, non è necessario eseguire la scansione di tutti i cervelli in una determinata coorte per verificare la PHHP. La misurazione IAM e ICP è sufficiente per verificare come descritto sopra. In definitiva, la capacità di un ricercatore di eseguire la risonanza magnetica in vivo o ex vivo dipenderà da una varietà di fattori come l'accesso allo scanner MRI, i fondi e le capacità tecniche. Questo passaggio è particolarmente utile per la convalida quando si incorpora il modello PHHP. È fondamentale notare che in assenza di segni documentati di aumento della pressione intracranica, come un'elevata pressione di apertura, i risultati isolati di ventricolomegalia all'imaging MRI non rappresentano l'idrocefalo.

Risultati

Utilizzando questo modello, l'idrocefalo si sviluppa nei giorni e nelle settimane successive all'iniezione di globuli rossi lisati. Una rappresentazione di un tipico disegno sperimentale e della progressione dell'idrocefalo è fornita nella Figura 1. Sono stati valutati 5-6 animali fittizi e 6-8 animali PHHP per gruppo. Da giovani, i ratti con PHHP mostravano macrocefalia (Figura 2), pressione intracranica elevata (

Discussione

Questo protocollo per l'induzione della PHHP consente misure di esito rigorose, quantificabili e clinicamente traducibili della struttura e della funzione cerebrale in concomitanza con i segni fenotipici dell'idrocefalo, tra cui l'aumento cronico di ICP, ventricolomegalia e macrocefalia, dalla nascita all'età adulta⁴. I saggi biochimici, istologici e funzionali possono essere utilizzati per valutare la salute del plesso coroideo, dell'ependima e del sistema glinf...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% ethanol	Pharmco	111000200	Diluted to 70%
Betadine surgical scrub	Cardinal Health	NDC-67618-151-17
Blunt Forceps	Roboz	RS-8100
Bravmini Plus Cordless Rechargeable Trimmer	Wahl	41590-0438
Carbon Steel Surgical blades	Bard-Parker	371151-11
centrifuge	Eppendorf	5424R
Cotton Gauze Sponge	Fisherbrand	22-362-178	Small, 6 inch sterile
Cotton-tipped Applicators	Fisherbrand	23-400-114	30 G 1
Eye Lubricant	Refresh Lacri Lube	75929
Far infrared warming pad	Kent scientific	RT-0501
Incubator -  Genie Temp-Shaker 100	Scientific Industries	SI-G100
Insulin Syringes	BD	328438	0.3 cc 3 mm 31 G, ultrafine
Isoflurane	Covetrus	11695067772
Ketamine hydrochloride injection	Dechra	17033-101-10
Kimwipes	Kimtech Science	BXTNI141300
LPS 011B4	Sigma	L2630
microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	3453	2.0 mL
Needle	BD	305122	1 mL
Needle	BD	305128	25 G 5/8
Needle Holders	Kent Scientific Corp.	INS14109	12.5 CM STR
OR Towels	Cardinal Health	287000-008
Paper measuring tape	Cardinal Health	SKU
Saline Solution, 0.9%	Sigma	S8776
Scissors	Roboz	RS-6808
SomnoSuite	Kent Scientific	SS6823B
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisherbrand	06-669-62	Sterile
Surgical gloves	Biogel	40870
Surgical Scissors	Roboz	RS-5880
Surgical Scissors	EST	14002-16
Syringe	BD	309628
T/Pump (Heat Therapy Pump)	Stryker Medical	TP700
Vessel Clips	Kent Scientific Corp.	INS14120	30 G Pressure
Xylazine injection	vet one	NDC 13985-704-10