Establecimiento de un modelo de ratón de endometrio delgado

Resumen

Este artículo describe un protocolo detallado para producir un endometrio delgado fiable y reproducible con una tasa de mortalidad muy baja y adherencias intrauterinas mínimas mediante la inyección de etanol al 95% en el útero de ratón en 1-3 minutos.

Resumen

El endometrio delgado (TE) ha sido ampliamente reconocido como una causa crítica de infertilidad. Sin embargo, la patogenia de la TE sigue sin estar clara y se necesitan con urgencia opciones de tratamiento satisfactorias. Se han desarrollado varios modelos animales de TE, pero el modelo de ratón que implica cirugía abdominal e inyección de etanol al 95% presenta un desafío formidable debido a la alta tasa de mortalidad y el riesgo de adherencias intrauterinas si no se realiza correctamente. Aquí, describimos un protocolo detallado que produce TE confiable y reproducible con una tasa de mortalidad muy baja y adherencias intrauterinas mínimas mediante la inyección de etanol al 95% en el útero de ratón con tiempos de infusión variables. Los resultados mostraron que todos los ratones desarrollaron con éxito TE con tiempos de infusión que oscilaron entre 1 y 3 minutos, caracterizados por una reducción típica en el grosor del endometrio y el número de glándulas, así como una fibrosis endometrial excesiva. Estos hallazgos sugieren que este modelo de ratón es adecuado para estudiar el endometrio delgado y puede servir como plataforma para el desarrollo de futuros tratamientos para la TE.

Introducción

El endometrio delgado (TE) es una afección grave en obstetricia y ginecología que a menudo afecta a las mujeres en edad fértil. La TE se diagnostica cuando el grosor del endometrio mide menos de 7 mm en una ecografía, acompañada de una cavidad uterina normal, y está estrechamente asociada al fracaso del embarazo ^1,2. Se estima que aproximadamente entre el 1,5% y el 9,1% de las mujeres que se someten a un tratamiento de fertilización in vitro (FIV) experimentarán TE, lo que lo convierte en un desafío creciente en la medicina reproductiva ^3,4,5. Las causas más comunes de la TE incluyen la reparación inadecuada del endometrio después de la separación quirúrgica de las adherencias intrauterinas (AIU) y el legrado, que a menudo se acompañan de una distribución interrumpida de los vasos sanguíneos y glándulas escasas ^6,7,8. Hasta la fecha, los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la TE siguen sin estar claros. La recuperación del endometrio en las pacientes con TE requiere mucho tiempo, aunque se ha explorado el tratamiento con estrógenos y el tratamiento con aspirina en dosis bajas como posibles intervenciones⁹. Por lo tanto, un estudio en profundidad de la patogenia de la TE es el enfoque más directo para abordar los desafíos de esta afección. Sin embargo, los estudios sobre la patogénesis de la TE se basan en modelos animales, por lo que la selección de un modelo adecuado es crucial.

La mayoría de los estudios histopatológicos del endometrio delgado (TE) han demostrado que la proliferación alterada de células epiteliales y macrófagos, la disminución de la expresión de los receptores de hormonas esteroides ováricas, la deposición excesiva de la matriz extracelular y la senescencia celular son las características patológicas más significativas de la TE ^6,9,10. En la actualidad, se han desarrollado varios modelos de ratas para imitar la TE, incluyendo modelos inducidos por rascado 11,12,13, isquemia ¹⁴, lesión térmica¹⁵ y lesión química 16,17,18,19. Un modelo de rata se induce rascando el endometrio con una aguja o catéter, lo que a menudo resulta en adherencias intrauterinas (AIU) en lugar de TE 11,12,20,21,22. También se ha descrito un modelo de TE inducida por isquemia en ratas, en el que la isquemia endometrial se logra mediante la realización de una ligadura bilateral de la arteria uterina, lo que conduce a una reducción del grosor endometrial. Sin embargo, este método requiere mucho tiempo, ya que requiere tres meses, y no es ampliamente utilizado para la investigación¹⁴. En el modelo de lesión térmica inducida, se utiliza un tubo de inseminación artificial para infundir agua precalentada a 85 °C en un lado del asta uterina a través de la confluencia de los dos lados, lo que lo hace más complejo que otros métodos¹⁵. El modelo inducido por productos químicos consiste en inyectar etanol al 95% en el cuerno uterino expuesto para dañar todo el endometrio. Este modelo ofrece las ventajas de un bajo costo y un corto período experimental para el estudio de los mecanismos patológicos y tratamientos en TE, pero se utiliza principalmente en ratas y no en ratones 16,17,23. Aunque existen varios modelos animales, especialmente modelos de ratas, cada uno tiene sus limitaciones. Solo pueden simular ciertos aspectos de la TE, y pocos modelos de ratón replican de cerca las características de la enfermedad de la ET y, al mismo tiempo, son convenientes y versátiles para la investigación.

En este contexto, desarrollamos un nuevo modelo de ratón de endometrio delgado (TE) mediante la infusión de etanol al 95% en la cavidad uterina utilizando un enfoque de gradiente de tiempo con un método modificado²⁴ (Figura 1). Los resultados mostraron que todos los ratones desarrollaron con éxito TE cuando el tiempo de infusión osciló entre 1 y 3 minutos, mostrando características típicas como reducción del grosor endometrial, reducción de la glándula y aumento de la fibrosis endometrial. Estos hallazgos sugieren que nuestro modelo de ratón es una herramienta adecuada para el estudio de la TE y puede servir como plataforma para el desarrollo de futuros tratamientos para la TE.

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Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de Obstetricia y Ginecología de Shenzhen Zhongshan (anteriormente Hospital de Urología de Shenzhen Zhongshan), donde se llevaron a cabo todos los experimentos con animales. En este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (de 6 a 8 semanas de edad, peso de 18 a 20 g). Todos los animales se alojaron en un ambiente libre de patógenos específicos (SPF) en la misma habitación y se aclimataron durante una semana antes de los experimentos en una habitación sin patógenos específicos a (22 ± 1) °C bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se les proporcionó acceso gratuito a alimentos y agua. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Identificación del celo

NOTA: La fase estral en ratones es comparable a la fase lútea tardía en humanos, con un revestimiento endometrial relativamente grueso en este momento. La selección de ratones en celo para la inducción del modelo garantiza que se encuentren en un estado fisiológico relativamente constante. Además, los resultados del adelgazamiento endometrial son más pronunciados cuando el grosor del endometrio es relativamente grueso. Para más detalles sobre este procedimiento, consultar los informes publicados anteriormente^25,26.

1. Prepare 20 μL de solución salina con una pipeta. Agarrando ambos lados de las orejas del ratón y fijando la cola del ratón, inserte suavemente la punta de la pipeta en el orificio vaginal a una profundidad de aproximadamente 2 mm. Infundir 20 μL de solución salina en la vagina y enjuagar suavemente durante 5 ciclos.
2. Retire la solución salina y transfiérala uniformemente a un portaobjetos limpio. Deje que se evapore y se seque naturalmente a temperatura ambiente.
3. Aplique 30 μL de etanol a cada portaobjetos para fijar las celdas. Deje que el etanol se evapore durante 5 minutos hasta que el portaobjetos esté seco.
4. Aplique 50 μL de solución de tinción violeta cristalina a cada portaobjetos y tiña las células a temperatura ambiente durante 10 min.
5. Enjuague cada portaobjetos con agua desionizada para eliminar el exceso de tinte y reducir las manchas inespecíficas.
6. Observar la morfología celular y determinar la proporción de tipos celulares bajo un microscopio.
7. Observe los ciclos estrales de los ratones dos veces consecutivas para garantizar la estabilidad. Seleccione ratones en el tercer celo para el experimento.
   NOTA: El ciclo estral en ratones suele durar de 4 a 5 días y se divide en cuatro etapas: proestro, estro, metestrus y diestro. El proestro dura aproximadamente 24 h y se caracteriza por células epiteliales nucleadas redondas a ovaladas (Figura 2A). El estro dura entre 12 h y 48 h y se caracteriza por células epiteliales queratinizadas predominantemente anucleadas (Figura 2B). El metestro dura hasta 24 h y se caracteriza por una mezcla de células epiteliales queratinizadas anucleadas y neutrófilos (Figura 3C). El diestro dura entre 48 h y 72 h y se caracteriza por una combinación de neutrófilos, células epiteliales nucleadas y unas pocas células queratinizadas anucleadas (Figura 2D).

2. Diseño grupal

NOTA: Para evaluar el impacto de varias duraciones de infusión de etanol al 95% en la estabilidad del modelo TE, se establecieron seis grupos de tratamiento. Un grupo se sometió a una cirugía simulada sin administración de etanol para que sirviera como control de los efectos del procedimiento. Los ratones con TE inducida por etanol se dividieron aleatoriamente en cinco grupos de tratamiento según el tiempo de infusión (n = 5 por grupo) de la siguiente manera:

1. Grupo de 1 min: Inyecte etanol en la cavidad uterina durante 1 min.
2. Grupo de 2 min: Inyectar etanol en la cavidad uterina durante 2 min.
3. Grupo de 3 min: Inyectar etanol en la cavidad uterina durante 3 min.
4. Grupo de 4 min: Inyectar etanol en la cavidad uterina durante 4 min.
5. Grupo de 5 min: Inyectar etanol en la cavidad uterina durante 5 min.

3. Inducción del modelo de TE en ratones

1. Anestesiar a los ratones con una máquina de anestesia con 5% de isoflurano y 100% de oxígeno durante 3 min (siguiendo un protocolo aprobado institucionalmente). Mantenga la anestesia al 1%-3% de isoflurano utilizando un cono nasal. Aplique ungüento veterinario en los ojos de los ratones para evitar la sequedad durante la anestesia. Controle la frecuencia respiratoria con un pellizco en los dedos del pie durante todo el procedimiento.
2. Use cinta médica para asegurar las extremidades de los ratones y manténgalos en posición supina en la mesa de operaciones precalentada con una manta electrónica. Tire suavemente de la lengua de los ratones ligeramente para evitar la obstrucción de las vías respiratorias.
   NOTA: Mantener a los ratones calientes durante la cirugía ayuda a mantener la función inmunológica y la circulación sanguínea, y previene la coagulación. Además, sacar la lengua de los ratones asegura que las vías respiratorias estén despejadas para evitar la asfixia durante la anestesia.
3. Aplique crema depilatoria de animales en la parte inferior del abdomen de los ratones durante 3 min. Retira el vello con toallitas limpias. Desinfecte el área con etanol y yodóforo al 75%.
4. Hacer una incisión de 1 cm en el abdomen, a 1 cm del orificio uretral. Use tijeras y fórceps estériles para extender la incisión hasta la cavidad peritoneal.
5. Retire suavemente las vísceras con pinzas estériles para localizar el útero y exponer el cuerno uterino derecho. Aplique pinzas hemostáticas en el extremo proximal cerca del cuello uterino y en el extremo distal cerca del ovario.
   NOTA: El pinzamiento de ambos extremos del cuerno uterino garantiza que no haya fugas durante la inyección de etanol, evitando daños en el cuello uterino, la vagina y el ovario.
6. Instilar aproximadamente 50 μL de etanol²⁷ al 95% en la cavidad uterina utilizando una jeringa de 25 G, con la aguja paralela a la dirección del cuerno uterino. Inserte la aguja en la cavidad uterina en un ángulo de 30 grados. Mantenga la jeringa durante 1 min, 2 min, 3 min, 4 min o 5 min, según corresponda. Extraiga el etanol y enjuague la cavidad uterina con solución salina estéril 5 veces para eliminar cualquier resto de etanol. Del mismo modo, instilar un volumen igual de solución salina estéril en el asta uterina izquierda como control, siguiendo los mismos procedimientos.
   NOTA: Asegúrese de que la aguja de la jeringa esté paralela a la dirección del cuerno uterino. Evite insertar la aguja en un ángulo demasiado pronunciado para evitar que atraviese todo el cuerno uterino. Retire el etanol lo más completamente posible para evitar daños persistentes e inestabilidad experimental.
7. Retire las pinzas y devuelva el útero y las vísceras a su posición original.
8. Suturar el peritoneo con suturas quirúrgicas de poliglicólidos absorbibles 5-0, seguido de suturas de la epidermis con suturas quirúrgicas de poliglicólidos no absorbibles 5-0.
9. Desinfecte la incisión con etanol y yodóforo al 75% y luego devuelva a los animales a su jaula. Después de la cirugía, observe de cerca si la frecuencia cardíaca del ratón aumenta de manera gradual y constante hasta que el ratón se recupere por completo y pueda moverse normalmente (figura 3A-H).
   NOTA: El día antes de la cirugía se administró analgésico oral (3,2 mg/ml de acetaminofén en el agua potable) y se continuó durante el resto del estudio.
10. Observe a los ratones a las 9:00 y a las 15:00 todos los días y desinfecte la incisión con yodóforo para asegurarse de que estén en buenas condiciones.

4. Recogida de muestras

1. Eutanasia a los ratones por luxación de la columna cervical mientras estaban bajo anestesia profunda 7 días después del tratamiento con etanol al 95% (siguiendo un protocolo aprobado institucionalmente).
2. Corta las suturas para exponer el útero con unas tijeras quirúrgicas.
3. Extraiga con cuidado y lentamente todo el útero con pinzas quirúrgicas. Separe el útero de las vísceras circundantes.
4. Retire inmediatamente ambos cuernos uterinos y divida cada cuerno en 3-4 segmentos pequeños.
5. Añada 1 mL de paraformaldehído al 4% a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con una pipeta. Conservar el tejido uterino en paraformaldehído al 4% durante 24 h para su fijación.

5. Deshidratación de tejidos

NOTA: La deshidratación de los tejidos se logra utilizando un procesador automático de tejidos (ver Tabla de Materiales).

1. Coloque las muestras fijadas en formol en casetes de tejido.
2. Transfiera los casetes de tejido a través de una serie de concentraciones crecientes de etanol para deshidratar el tejido de la siguiente manera: etanol al 70% durante 1 h, etanol al 85% durante 1 h, etanol al 95% dos veces (1 h cada uno) y etanol al 100% dos veces (1 h cada uno).
3. Reemplace el etanol con xileno 100% (135 min para la primera inmersión, 20 min para cada inmersión posterior dos veces) para asegurar que la parafina penetre en el tejido.
4. Sumerja los casetes de papel en parafina en una incubadora a 60-65 °C (3 veces, 140 min cada uno) y mantenga los casetes calientes hasta su inserción.

6. Inclusión en parafina

NOTA: Realice estos pasos utilizando un centro de inclusión de tejido modular (consulte la Tabla de materiales).

1. Llene un molde de cera con cera de parafina fundida calentada a 55 °C.
2. Utilice pinzas calentadas para transferir rápidamente los segmentos infiltrados del casete de inclusión al molde de cera, asegurándose de que la sección transversal de cada segmento quede paralela a la base del molde.
3. Una vez que los segmentos estén colocados correctamente, coloque la parte inferior del casete de inclusión encima del molde de histología.
4. Coloque el molde directamente sobre una placa de enfriamiento ajustada a 4 °C durante al menos 20 minutos para permitir que la parafina se solidifique.
5. Después de que la cera se haya solidificado, retire la muestra del molde y use un recortador de parafina para recortar el exceso de cera a su alrededor.

7. Seccionamiento de parafina

1. Preparar un baño maría a 42 °C. Coloque los bloques de parafina en una placa fría antes de cortarlos para permitir que se enfríen y sean más fáciles de recortar.
2. Sujete la muestra incrustada en parafina en un micrótomo rotatorio con la superficie del tejido hacia arriba.
3. Sección de 20 μm a la vez para eliminar el exceso de parafina que cubre el tejido hasta alcanzar el plano de tejido deseado.
4. Corta secciones de 4 μm a la vez.
5. Transfiera la cinta seccionada en parafina al baño de agua tibia a 42 °C durante 2 min.
6. Recoja las secciones de la superficie del agua y colóquelas en un portaobjetos de microscopio después de desplegarlas.
7. Seque los portaobjetos en una incubadora a 60 °C durante 30 min.

8. Tinción de hematoxilina y eosina

NOTA: La tinción con hematoxilina y eosina se realiza utilizando una máquina de tinción de portaobjetos automatizada (consulte la tabla de materiales).

1. Prepare todos los reactivos con anticipación antes de comenzar el procedimiento de tinción.
2. Remoje los portaobjetos en xileno al 100% durante 10 minutos, 5 minutos y 3 minutos, respectivamente.
3. Rehidrate los portaobjetos en una serie decreciente de etanol en agua desionizada de la siguiente manera: 100% de etanol, 95% de etanol (dos veces) y 80% de etanol, durante 2 minutos cada uno.
4. Enjuague los portaobjetos con agua desionizada.
5. Teñir los portaobjetos en solución de hematoxilina durante 10 min. Enjuague los portaobjetos con agua desionizada durante 1 minuto o hasta que el agua ya no esté morada.
6. Sumerja los portaobjetos en una solución de diferenciación de etanol ácido al 0,5% dos veces durante 3-5 s cada vez. Enjuague los portaobjetos con agua desionizada durante 1 min.
7. Coloque los portaobjetos en un tampón azulado (solución de amoníaco al 1%) durante 1 min. Enjuague los portaobjetos con agua desionizada durante 1 min.
8. Deshidratar los portaobjetos con etanol al 80% y luego sumergirlos en una solución de trabajo de eosina-Y durante 10 s.
9. Transfiera los portaobjetos a etanol al 95% y enjuague dos veces durante 10 s cada uno. Luego, transfiera los portaobjetos a etanol absoluto y deshidrételos dos veces durante 10 s cada uno.
10. Sumerja los portaobjetos en xileno al 100% para limpiar el tejido dos veces, durante 2 minutos cada una.
11. Coloque un cubreobjetos sobre el pañuelo y séllelo con resina natural.

9. Tinción de Masson

1. Desparafinar el tejido remojando los portaobjetos en xileno al 100% durante 10 min, 5 min y 3 min, respectivamente.
2. Después de la desparafinación, remoje los portaobjetos en una serie de etanol decreciente en agua desionizada: 100% etanol, 95% etanol (dos veces) y 80% etanol, durante 2 minutos cada uno.
3. Enjuague los portaobjetos con agua desionizada.
4. Teñir los portaobjetos con la solución de hematoxilina de hierro de Weigert durante 5 min, luego lavar los portaobjetos con agua desionizada durante 30 s.
5. Diferencie los colores de las estructuras de tejido teñidas incubando los portaobjetos en alcohol de ácido clorhídrico al 1% durante 15 s.
6. Enjuague los portaobjetos con agua desionizada durante 30 s.
7. Incubar el tejido en una solución azulada durante 3-5 min.
8. Enjuague los portaobjetos con agua desionizada durante 30 s.
9. Coloque los portaobjetos en la solución de fucsina Ponceau-Acid durante 5-10 min.
   NOTA: Mezcle agua desionizada y solución de ácido débil en una proporción de 2:1 para preparar la solución de trabajo de ácido débil.
10. Enjuague los portaobjetos con la solución de trabajo de ácido débil durante 30 s.
11. Diferencie el tejido en la solución de ácido fosfomolíbdico durante 1-2 minutos y luego enjuague las secciones con una solución de trabajo de ácido débil durante 30 s.
12. Teñir las secciones de tejido con una solución de azul de anilina durante 1-2 min.
13. Deshidratar rápidamente las secciones de tejido en etanol al 95% durante 2-3 s, seguido de etanol al 100% dos veces durante 5-10 s cada una. Limpie los portaobjetos en xileno dos veces, durante 1-2 minutos cada una.
14. Coloque un cubreobjetos sobre el pañuelo y séllelo con resina natural.
15. Escurre el exceso de resina y deja que los portaobjetos se sequen.

10. Imágenes y análisis

1. Capture imágenes de las secciones utilizando un sistema de escáner de diapositivas.
   NOTA: Utilice un objetivo de 4x o 10x para obtener una visión general de las secciones; Para obtener imágenes más detalladas, utilice objetivos de 20x a 100x.
2. Realice análisis cuantitativos del grosor del endometrial, el número de glándulas y el grado de fibrosis tisular utilizando la plataforma de análisis de imágenes HALO.
   NOTA: El grosor promedio se obtiene midiendo la distancia vertical desde la cavidad uterina hasta el miometrio en 5 campos de visión seleccionados al azar.

11. Análisis estadísticos

1. Realizar análisis estadísticos utilizando el programa SPSS versión 23.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.).
2. Evaluar la significación estadística de las diferencias experimentales entre los grupos de control y modelo realizando primero una prueba de distribución normal.
3. Presentar datos que normalmente se distribuyen como media ± SEM.
4. Analice los datos de diferentes grupos de tratamiento utilizando ANOVA de un factor. Ajuste las comparaciones múltiples del número de alelos probados en cada locus utilizando el método de Bonferroni. Considere un valor P <0,05 como estadísticamente significativo.

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Resultados

Las características clave del endometrio delgado (TE) son la disminución del grosor endometrial y la densidad glandular, junto con el aumento de la fibrosis endometrial. Este método replicó con éxito estas características en los ratones modelo. El análisis de los datos reveló una disminución significativa del grosor endometrial en el grupo de 1 min (222,3 μm ± 13,96 μm vs. 359,2 μm ± 12,41 μm, P < 0,05), el grupo de 2 min (168,7 μm ± 17,57 μm vs

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Discusión

La TE se caracteriza por una proliferación celular insuficiente y células disfuncionales, estrechamente relacionadas con la infertilidad, el aborto espontáneo recurrente y las anomalías placentarias ^2,3. Desafortunadamente, actualmente no existe una terapia efectiva para la TE. Los modelos animales juegan un papel crucial en el estudio de esta condición. Entre 2014 y 2024, se utilizaron ratas como organismos modelo en el 16,...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia Machine	RWD Life Science	R530	Mobile inhalation anesthesia machine for small animals
0.9% saline	Hubei Kelun Pharmaceutical	C230817A2	10 mL, medical injection
75% ethanol	LIRCON	6303060031	500 mL, disinfectant reagent
95% ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory	64-17-5	500 mL, chemical reagent
Absorbable sutures	Jinhuan Medical	CR537	Thickness: 5-0; Length: 90 cm
Aqueous ammonia	MilliporeSigma	1336-21-6	1000 mL, chemical reagent
Automatic Tissue Processor	Leica	TP1020	100 embedding boxes can be processed at one time
C57BL/6 mice	Experimental Animal Center of Southern Medical University
Eosin-Y	BASO	BA4024	1000 mL, used for the staining of paraffin sections, frozen sections, etc
Haematoxylin	BASO	BA4041	1000 mL, used for the staining of paraffin sections, frozen sections, etc
HALO Image Analysis Platform	Indica labs		The instrument features ease-of-use and scalability, powerful analytical capabilities, and the fastest processing speed
Hemostatic clamps	HUAYON	18-5021	1.8 cm in total length with 0.7 cm jaw
Hemostatic forceps	HUAYON	18-5020	10 cm in total length
HistoCore Rotary Microtome	Leica	149BIO000C1	Slice thickness ranges from 1 to 60 μm
Indorphor	ADF	1005	500 mL, disinfectant reagent
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	100 mL, active ingredient 100% isoflurane
Masson's trichrome staining	SOLARBIO	G1340	7 × 100 mL for 100 tests
Microscope slide	Gene Tech	GT100511	Length: 75 cm; Width: 25 cm
Modular Tissue Embedding Center	Leica	EG1150 C	The instrument contains a cold stage and a heated paraffin distribution module, providing flexibility for the embedding work
Natural resin	SAKURA	4770	Resin-coated film, Suitable for histology staining
Olympus SLIDEVIEW VS200	PANOVUE	VS200	The instrument captures high-quality virtual slide images and enables advanced quantitative image analysis
Paraformaldehyde fix solution	Servicebio	G1011	500 mL, universal tissue fixative (neutral)
Surgical forceps	HUAYON	18-1300	2.2 mm straight, 12.5 cm wide
Surgical scissors	HUAYON	18-0110	10 cm, stainless steel surgical scissors
Syringe	Kindly	60017031	1 mL, disposable sterile syringe with needle
Tissue cassettes	CITOTEST	80106-1100-16	White; flow-through slots; 0ne-piece integral lid; labeling areas are located on three sides
Tissue-Tek Prisma Plus	SAKURA	DRS-Prisma-P-JCS	The processing capacity is 60 slides at one time
Xylene	Guangdong Guanghua Sci-Tech	1330-20-7	1000 mL, organic solvent