Etablissement d’un modèle murin d’endomètre mince

Résumé

Cet article décrit un protocole détaillé pour produire un endomètre mince fiable et reproductible avec un taux de mortalité très faible et des adhérences intra-utérines minimales en injectant de l’éthanol à 95 % dans l’utérus de la souris en 1 à 3 minutes.

Résumé

L’endomètre mince (TE) a été largement reconnu comme une cause critique d’infertilité. Cependant, la pathogenèse de l’ET reste incertaine, et des options de traitement satisfaisantes sont encore nécessaires de toute urgence. Plusieurs modèles animaux d’ET ont été développés, mais le modèle murin impliquant une chirurgie abdominale et l’injection d’éthanol à 95 % présente un défi redoutable en raison du taux de mortalité élevé et du risque d’adhérences intra-utérines s’il n’est pas effectué correctement. Ici, nous décrivons un protocole détaillé qui produit une TE fiable et reproductible avec un très faible taux de mortalité et des adhérences intra-utérines minimales en injectant de l’éthanol à 95 % dans l’utérus de la souris avec des temps de perfusion variables. Les résultats ont montré que toutes les souris ont réussi à développer une TE avec des temps de perfusion allant de 1 à 3 minutes, caractérisée par une réduction typique de l’épaisseur de l’endomètre et du nombre de glandes, ainsi qu’une fibrose endométriale excessive. Ces résultats suggèrent que ce modèle murin convient à l’étude de l’endomètre mince et peut servir de plate-forme pour le développement de futurs traitements TE.

Introduction

L’endomètre mince (TE) est une maladie grave en obstétrique et gynécologie qui affecte souvent les femmes en âge de procréer. L’ET est diagnostiquée lorsque l’épaisseur de l’endomètre est inférieure à 7 mm à l’échographie, accompagnée d’une cavité utérine normale, et est étroitement associée à l’échec de la grossesse ^1,2. On estime qu’environ 1,5 % à 9,1 % des femmes subissant un traitement de fécondation in vitro (FIV) souffriront d’ET, ce qui en fait un défi croissant en médecine reproductive ^3,4,5. Les causes les plus courantes de TE comprennent une mauvaise réparation de l’endomètre après la séparation chirurgicale des adhérences intra-utérines (IUA) et le curetage, qui s’accompagnent souvent d’une perturbation de la distribution des vaisseaux sanguins et de glandes clairsemées ^6,7,8. À ce jour, les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’ET restent incertains. La récupération de l’endomètre chez les patientes TE prend du temps, bien que le traitement à l’œstrogène et le traitement à l’aspirine à faible dose aient été explorés comme interventions potentielles⁹. Par conséquent, une étude approfondie de la pathogenèse de l’ET est l’approche la plus directe pour relever les défis de cette maladie. Cependant, les études sur la pathogenèse de l’ET reposent sur des modèles animaux, ce qui rend cruciale la sélection d’un modèle approprié.

La plupart des études histopathologiques de l’endomètre mince (TE) ont montré que l’altération de la prolifération des cellules épithéliales et des macrophages, la diminution de l’expression des récepteurs des hormones stéroïdes ovarienne, le dépôt excessif de la matrice extracellulaire et la sénescence cellulaire sont les caractéristiques pathologiques les plus significatives de TE ^6,9,10. À l’heure actuelle, divers modèles de rats ont été développés pour imiter l’TE, y compris les modèles induits par le grattage 11,12,13, l’ischémie ¹⁴, les lésions thermiques¹⁵ et les lésions chimiques 16,17,18,19. Un modèle de rat est induit en grattant l’endomètre avec une aiguille ou un cathéter, ce qui entraîne souvent des adhérences intra-utérines (IUA) plutôt que TE 11,12,20,21,22. Un modèle TE induit par l’ischémie chez le rat a également été rapporté, où l’ischémie endométriale est obtenue en effectuant une ligature bilatérale de l’artère utérine, entraînant une réduction de l’épaisseur de l’endomètre. Cependant, cette méthode prend du temps, nécessite trois mois, et n’est pas largement utilisée pour la recherche¹⁴. Dans le modèle induit par les lésions thermiques, un tube d’insémination artificielle est utilisé pour infuser de l’eau préchauffée à 85 °C dans un côté de la corne utérine par la confluence des deux côtés, ce qui le rend plus complexe que les autres méthodes¹⁵. Le modèle induit par des produits chimiques consiste à injecter de l’éthanol à 95 % dans la corne utérine exposée pour endommager l’ensemble de l’endomètre. Ce modèle offre les avantages d’un faible coût et d’une courte période d’expérimentation pour l’étude des mécanismes pathologiques et des traitements dans l’ET, mais il est principalement utilisé chez les rats plutôt que chez les souris 16,17,23. Bien qu’il existe différents modèles d’animaux, en particulier des modèles de rats, chacun a ses limites. Ils ne peuvent simuler que certains aspects de l’ET, et peu de modèles de souris reproduisent fidèlement les caractéristiques de la maladie de l’ET tout en étant pratiques et polyvalents pour la recherche.

Dans ce contexte, nous avons développé un nouveau modèle murin d’endomètre mince (TE) en injectant de l’éthanol à 95 % dans la cavité utérine à l’aide d’une approche à gradient temporel avec une méthode modifiée²⁴ (Figure 1). Les résultats ont montré que toutes les souris ont réussi à développer une TE lorsque le temps de perfusion variait de 1 à 3 minutes, affichant des caractéristiques typiques telles que la réduction de l’épaisseur de l’endomètre, la réduction de la glande et l’augmentation de la fibrose de l’endomètre. Ces résultats suggèrent que notre modèle murin est un outil approprié pour étudier l’ET et peut servir de plate-forme pour le développement de futurs traitements à l’ET.

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Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’hôpital d’obstétrique et de gynécologie de Shenzhen Zhongshan (anciennement l’hôpital d’urologie de Shenzhen Zhongshan), où toutes les expériences sur les animaux ont été menées. Des souris femelles C57BL/6 (âgées de 6 à 8 semaines, poids de 18 à 20 g) ont été utilisées dans cette étude. Tous les animaux ont été logés dans un environnement exempt d’agents pathogènes spécifiques (FPS) dans la même pièce et acclimatés pendant une semaine avant les expériences dans une pièce sans agents pathogènes spécifiques à (22 ± 1) °C sous un cycle lumière/obscurité de 12 heures. Ils ont eu accès gratuitement à de la nourriture et à de l’eau. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Identification de l’œstrus

REMARQUE : La phase œstrus chez la souris est comparable à la phase lutéale tardive chez l’homme, avec une muqueuse endométriale relativement épaisse à ce moment-là. La sélection de souris en œstrus pour l’induction du modèle garantit qu’elles sont dans un état physiologique relativement cohérent. De plus, les résultats de l’amincissement de l’endomètre sont plus prononcés lorsque l’épaisseur de l’endomètre est relativement épaisse. Pour plus de détails sur cette procédure, reportez-vous aux rapports^{publiés précédemment 25,26}.

1. Préparez 20 μL de solution saline à l’aide d’une pipette. En saisissant les deux côtés des oreilles de la souris et en fixant la queue de la souris, insérez doucement l’extrémité de la pipette dans l’orifice vaginal à une profondeur d’environ 2 mm. Infusez 20 μL de solution saline dans le vagin et rincez-le doucement pendant 5 cycles.
2. Retirez la solution saline et transférez-la uniformément sur une lame propre. Laissez-le s’évaporer et sécher naturellement à température ambiante.
3. Appliquez 30 μL d’éthanol sur chaque lame pour fixer les cellules. Laissez l’éthanol s’évaporer pendant 5 minutes jusqu’à ce que la lame soit sèche.
4. Appliquez 50 μL de solution de coloration au violet cristallin sur chaque lame et colorez les cellules à température ambiante pendant 10 min.
5. Rincez chaque lame à l’eau déminéralisée pour éliminer l’excès de colorant et réduire les taches non spécifiques.
6. Observez la morphologie cellulaire et déterminez la proportion de types de cellules au microscope.
7. Observez les cycles œstraux des souris deux fois de suite pour assurer la stabilité. Sélectionnez des souris dans le troisième œstrus pour l’expérience.
   REMARQUE : Le cycle œstral chez la souris dure généralement 4 à 5 jours et est divisé en quatre étapes : proestrus, estrus, metestrus et diestrus. Le proestrus dure environ 24 h et se caractérise par des cellules épithéliales nucléées rondes à ovales (figure 2A). L’œstrus dure entre 12 h et 48 h et se caractérise par des cellules épithéliales kératinisées à prédominance anucléée (Figure 2B). Metestrus dure jusqu’à 24 h et est caractérisé par un mélange de cellules épithéliales kératinisées anucléées et de neutrophiles (Figure 3C). Le diestrus dure entre 48 h et 72 h et se caractérise par une combinaison de neutrophiles, de cellules épithéliales nucléées et de quelques cellules kératinisées anucléées (figure 2D).

2. Conception de groupe

REMARQUE : Pour évaluer l’impact de différentes durées de perfusion d’éthanol à 95 % sur la stabilité du modèle TE, six groupes de traitement ont été établis. Un groupe a subi une chirurgie simulée sans administration d’éthanol pour servir de contrôle des effets de la procédure. Les souris avec de l’ET induit par l’éthanol ont été divisées au hasard en cinq groupes de traitement en fonction du temps de perfusion (n = 5 par groupe) comme suit :

1. Groupe de 1 min : Injecter de l’éthanol dans la cavité utérine pendant 1 min.
2. Groupe de 2 minutes : Injecter de l’éthanol dans la cavité utérine pendant 2 min.
3. Groupe de 3 minutes : Injecter de l’éthanol dans la cavité utérine pendant 3 min.
4. Groupe de 4 minutes : Injecter de l’éthanol dans la cavité utérine pendant 4 minutes.
5. Groupe de 5 min : Injecter de l’éthanol dans la cavité utérine pendant 5 min.

3. Induction du modèle TE chez la souris

1. Anesthésie les souris à l’aide d’un appareil d’anesthésie contenant 5 % d’isoflurane et 100 % d’oxygène pendant 3 minutes (en suivant un protocole approuvé par l’établissement). Maintenir l’anesthésie à 1 % à 3 % d’isoflurane à l’aide d’un cône nasal. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux des souris pour prévenir la sécheresse pendant l’anesthésie. Surveillez la fréquence respiratoire avec un pincement des orteils tout au long de la procédure.
2. Utilisez du ruban médical pour sécuriser les membres des souris et maintenez-les en position couchée sur la table d’opération préchauffée avec une couverture électronique. Tirez doucement sur la langue de la souris pour éviter l’obstruction des voies respiratoires.
   REMARQUE : Garder les souris au chaud pendant la chirurgie aide à maintenir la fonction immunitaire et la circulation sanguine, et empêche la coagulation. De plus, l’extraction de la langue des souris garantit que les voies respiratoires sont dégagées pour éviter la suffocation pendant l’anesthésie.
3. Appliquez la crème dépilatoire sur l’abdomen inférieur des souris pendant 3 min. Retirez les cheveux avec des lingettes propres. Désinfectez la zone avec de l’éthanol à 75 % et de l’iodophore.
4. Faites une incision de 1 cm dans l’abdomen, à 1 cm de l’orifice urétral. Utilisez des ciseaux stériles et des pinces pour étendre l’incision jusqu’à la cavité péritonéale.
5. Écartez doucement les entrailles à l’aide d’une pince stérile pour localiser l’utérus et exposer la corne utérine droite. Appliquez des pinces hémostatiques à l’extrémité proximale près du col de l’utérus et à l’extrémité distale près de l’ovaire.
   REMARQUE : Le clampage des deux extrémités de la corne utérine garantit l’absence de fuite lors de l’injection d’éthanol, évitant ainsi d’endommager le col de l’utérus, le vagin et l’ovaire.
6. Instillez environ 50 μL d’éthanol à 95 %²⁷ dans la cavité utérine à l’aide d’une seringue de 25 G, l’aiguille étant parallèle à la direction de la corne utérine. Insérez l’aiguille dans la cavité utérine à un angle de 30 degrés. Maintenez la seringue pendant 1 min, 2 min, 3 min, 4 min ou 5 min, selon le cas. Retirez l’éthanol et rincez la cavité utérine avec une solution saline stérile 5 fois pour éliminer tout éthanol restant. De même, instillez un volume égal de solution saline stérile dans la corne utérine gauche comme contrôle, en suivant les mêmes procédures.
   REMARQUE : Assurez-vous que l’aiguille de la seringue est parallèle à la direction de la corne utérine. Évitez d’insérer l’aiguille à un angle trop prononcé pour éviter qu’elle ne traverse toute la corne utérine. Retirez l’éthanol aussi complètement que possible pour éviter des dommages persistants et une instabilité expérimentale.
7. Retirez les pinces et remettez l’utérus et les entrailles dans leur position d’origine.
8. Suturez le péritoine avec des sutures chirurgicales 5-0 de polyglycolide résorbables, suivies de la suture de l’épiderme avec des sutures chirurgicales de polyglycolide 5-0 non résorbables.
9. Désinfectez l’incision avec de l’éthanol à 75 % et de l’iodophore, puis remettez les animaux dans leur cage. Après la chirurgie, observez attentivement si la fréquence cardiaque de la souris augmente progressivement et régulièrement jusqu’à ce que la souris se rétablisse complètement et puisse se déplacer normalement (Figure 3A-H).
   REMARQUE : Un analgésique oral (3,2 mg/mL d’acétaminophène dans l’eau potable) a été administré la veille de la chirurgie et s’est poursuivi pendant le reste de l’étude.
10. Observez les souris à 9h00 et 15h00 chaque jour et désinfectez l’incision avec de l’iodophor pour vous assurer qu’elles sont en bon état.

4. Prélèvement d’échantillons

1. Euthanasier les souris par luxation de la colonne cervicale sous anesthésie profonde 7 jours après un traitement à l’éthanol à 95 % (selon un protocole approuvé par l’établissement).
2. Coupez les sutures pour exposer l’utérus à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
3. Extrayez soigneusement et lentement l’ensemble de l’utérus à l’aide d’une pince chirurgicale. Détachez l’utérus des entrailles environnantes.
4. Retirez immédiatement les deux cornes utérines et divisez chaque corne en 3-4 petits segments.
5. Ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’une pipette. Conserver le tissu utérin dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h pour la fixation.

5. Déshydratation des tissus

REMARQUE : La déshydratation des tissus est réalisée à l’aide d’un processeur de tissus automatique (voir le tableau des matériaux).

1. Placez les échantillons fixés au formol dans des cassettes de tissus.
2. Transférez les cassettes de tissus à travers une série de concentrations croissantes d’éthanol pour déshydrater les tissus comme suit : 70 % d’éthanol pendant 1 h, 85 % d’éthanol pendant 1 h, 95 % d’éthanol deux fois (1 h chacune) et 100 % d’éthanol deux fois (1 h chacune).
3. Remplacez l’éthanol par du xylène à 100 % (135 min pour la première immersion, 20 min pour chaque immersion subséquente deux fois) pour vous assurer que la paraffine pénètre dans le tissu.
4. Plongez les cassettes de tissus dans de la paraffine dans un incubateur à 60-65 °C (3 fois, 140 min chacune) et maintenez les cassettes au chaud jusqu’à l’encastrement.

6. Intégration de la paraffine

REMARQUE : Effectuez ces étapes à l’aide d’un centre modulaire d’enrobage de tissus (voir Tableau des matériaux).

1. Remplissez un moule à cire avec de la cire de paraffine fondue chauffée à 55 °C.
2. À l’aide d’une pince chauffée, vous pouvez transférer rapidement les segments infiltrés de la cassette d’enrobage dans le moule en cire, en veillant à ce que la section transversale de chaque segment repose parallèlement à la base du moule.
3. Une fois les segments correctement positionnés, placez le bas de la cassette d’enrobage sur le dessus du moule d’histologie.
4. Placez le moule directement sur une plaque de refroidissement réglée à 4 °C pendant au moins 20 min pour permettre à la paraffine de se solidifier.
5. Une fois la cire solidifiée, retirez l’échantillon du moule et utilisez une coupe-paraffine pour couper tout excès de cire autour de celle-ci.

7. Section de la paraffine

1. Préparez un bain-marie à 42 °C. Placez les blocs de paraffine sur une plaque froide avant de les couper pour leur permettre de refroidir et de devenir plus faciles à couper.
2. Fixez l’échantillon enrobé de paraffine sur un microtome rotatif avec la surface du tissu vers le haut.
3. Sectionnez 20 μm à la fois pour éliminer l’excès de paraffine recouvrant le tissu jusqu’à ce que le plan tissulaire souhaité soit atteint.
4. Coupez des sections de 4 μm à la fois.
5. Transférez le ruban sectionné de paraffine dans le bain d’eau chaude à 42 °C pendant 2 min.
6. Ramassez les coupes à la surface de l’eau et placez-les sur une lame de microscope après les avoir dépliées.
7. Faites sécher les lames dans un incubateur à 60 °C pendant 30 min.

8. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine

REMARQUE : La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine est effectuée à l’aide d’une machine à coloration de lames automatisée (voir le tableau des matériaux).

1. Préparez tous les réactifs à l’avance avant de commencer la procédure de coloration.
2. Faites tremper les lames dans du xylène à 100 % pendant 10 min, 5 min et 3 min, respectivement.
3. Réhydratez les lames en une série décroissante d’éthanol dans de l’eau déminéralisée comme suit : 100 % d’éthanol, 95 % d’éthanol (deux fois) et 80 % d’éthanol, pendant 2 min chacune.
4. Rincez les lames à l’eau déminéralisée.
5. Colorer les lames dans une solution d’hématoxyline pendant 10 min. Rincez les lames à l’eau déminéralisée pendant 1 min ou jusqu’à ce que l’eau ne soit plus violette.
6. Trempez les lames dans une solution de différenciation de l’éthanol acide à 0,5 % deux fois pendant 3 à 5 s à chaque fois. Rincez les lames à l’eau déminéralisée pendant 1 min.
7. Placez les lames dans un tampon bleuissant (solution d’ammoniac à 1 %) pendant 1 min. Rincez les lames à l’eau déminéralisée pendant 1 min.
8. Déshydratez les lames avec de l’éthanol à 80 %, puis plongez-les dans une solution de travail à l’éosine-Y pendant 10 s.
9. Transférez les lames à 95 % d’éthanol et rincez deux fois pendant 10 s chacune. Ensuite, transférez les lames dans de l’éthanol absolu et déshydratez-les deux fois pendant 10 s chacune.
10. Trempez les lames dans du xylène à 100 % pour éclaircir le tissu deux fois, pendant 2 minutes chacune.
11. Placez une lamelle sur le tissu et scellez-le avec de la résine naturelle.

9. Coloration Masson

1. Déparaffinisez le tissu en trempant les lames dans du xylène à 100 % pendant 10 min, 5 min et 3 min, respectivement.
2. Après la déparaffinisation, faites tremper les lames dans une série décroissante d’éthanol dans de l’eau déminéralisée : 100 % d’éthanol, 95 % d’éthanol (deux fois) et 80 % d’éthanol, pendant 2 minutes chacune.
3. Rincez les lames à l’eau déminéralisée.
4. Colorez les lames dans la solution d’hématoxyline de fer de Weigert pendant 5 min, puis lavez les lames dans de l’eau désionisée pendant 30 s.
5. Différenciez les couleurs des structures tissulaires colorées en incubant les lames dans de l’alcool d’acide chlorhydrique à 1 % pendant 15 s.
6. Rincez les lames à l’eau déminéralisée pendant 30 s.
7. Incuber le tissu dans une solution de bleuissement pendant 3 à 5 min.
8. Rincez les lames à l’eau déminéralisée pendant 30 s.
9. Placez les lames dans la solution de fuchsine Ponceau-Acid pendant 5 à 10 min.
   REMARQUE : Mélangez de l’eau désionisée et une solution d’acide faible dans un rapport de 2 : 1 pour préparer la solution de travail à l’acide faible.
10. Rincer les lames avec la solution de travail à l’acide faible pendant 30 s.
11. Différencier le tissu dans la solution d’acide phosphomolybdique pendant 1 à 2 min, puis rincer les sections avec une solution de travail à l’acide faible pendant 30 s.
12. Colorer les sections de tissu avec une solution de bleu d’aniline pendant 1 à 2 min.
13. Déshydratez rapidement les sections de tissu dans de l’éthanol à 95 % pendant 2 à 3 s, puis à 100 % d’éthanol deux fois pendant 5 à 10 s chacune. Nettoyer les lames dans du xylène deux fois, pendant 1 à 2 minutes chacune.
14. Placez une lamelle sur le tissu et scellez-le avec de la résine naturelle.
15. Égouttez l’excès de résine et laissez sécher les lames.

10. Imagerie et analyse

1. Capturez des images des sections à l’aide d’un système de balayage de diapositives.
   REMARQUE : Utilisez un objectif 4x ou 10x pour une vue d’ensemble des sections ; Pour des images plus détaillées, utilisez des objectifs 20x à 100x.
2. Effectuez une analyse quantitative de l’épaisseur de l’endomètre, du nombre de glandes et de l’étendue de la fibrose tissulaire à l’aide de la plateforme d’analyse d’images HALO.
   REMARQUE : L’épaisseur moyenne est obtenue en mesurant la distance verticale entre la cavité utérine et le myomètre dans 5 champs de vision choisis au hasard.

11. Analyses statistiques

1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide de SPSS version 23.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, États-Unis).
2. Évaluez la signification statistique des différences expérimentales entre le groupe témoin et le groupe modèle en effectuant d’abord un test de distribution normale.
3. Présentez des données qui sont normalement distribuées sous forme de moyenne ± MEB.
4. Analysez les données de différents groupes de traitement à l’aide de l’ANOVA à un facteur. Ajustez pour des comparaisons multiples du nombre d’allèles testés dans chaque locus à l’aide de la méthode de Bonferroni. Considérez une valeur P <0,05 comme statistiquement significative.

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Résultats

Les principales caractéristiques de l’endomètre mince (TE) sont une diminution de l’épaisseur de l’endomètre et de la densité glandulaire, ainsi qu’une augmentation de la fibrose de l’endomètre. Cette méthode a réussi à reproduire ces caractéristiques chez les souris modèles. L’analyse des données a révélé une diminution significative de l’épaisseur de l’endomètre dans le groupe 1 min (222,3 μm ± 13,96 μm contre 359,2 μm ± 12,41 μm, P <...

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Discussion

L’ET se caractérise par une prolifération cellulaire insuffisante et des cellules dysfonctionnelles, étroitement liées à l’infertilité, aux fausses couches récurrentes et aux anomalies placentaires ^2,3. Malheureusement, il n’existe actuellement aucun traitement efficace pour l’ET. Les modèles animaux jouent un rôle crucial dans l’étude de cette maladie. Entre 2014 et 2024, les rats ont été utilisés comme or...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia Machine	RWD Life Science	R530	Mobile inhalation anesthesia machine for small animals
0.9% saline	Hubei Kelun Pharmaceutical	C230817A2	10 mL, medical injection
75% ethanol	LIRCON	6303060031	500 mL, disinfectant reagent
95% ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory	64-17-5	500 mL, chemical reagent
Absorbable sutures	Jinhuan Medical	CR537	Thickness: 5-0; Length: 90 cm
Aqueous ammonia	MilliporeSigma	1336-21-6	1000 mL, chemical reagent
Automatic Tissue Processor	Leica	TP1020	100 embedding boxes can be processed at one time
C57BL/6 mice	Experimental Animal Center of Southern Medical University
Eosin-Y	BASO	BA4024	1000 mL, used for the staining of paraffin sections, frozen sections, etc
Haematoxylin	BASO	BA4041	1000 mL, used for the staining of paraffin sections, frozen sections, etc
HALO Image Analysis Platform	Indica labs		The instrument features ease-of-use and scalability, powerful analytical capabilities, and the fastest processing speed
Hemostatic clamps	HUAYON	18-5021	1.8 cm in total length with 0.7 cm jaw
Hemostatic forceps	HUAYON	18-5020	10 cm in total length
HistoCore Rotary Microtome	Leica	149BIO000C1	Slice thickness ranges from 1 to 60 μm
Indorphor	ADF	1005	500 mL, disinfectant reagent
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	100 mL, active ingredient 100% isoflurane
Masson's trichrome staining	SOLARBIO	G1340	7 × 100 mL for 100 tests
Microscope slide	Gene Tech	GT100511	Length: 75 cm; Width: 25 cm
Modular Tissue Embedding Center	Leica	EG1150 C	The instrument contains a cold stage and a heated paraffin distribution module, providing flexibility for the embedding work
Natural resin	SAKURA	4770	Resin-coated film, Suitable for histology staining
Olympus SLIDEVIEW VS200	PANOVUE	VS200	The instrument captures high-quality virtual slide images and enables advanced quantitative image analysis
Paraformaldehyde fix solution	Servicebio	G1011	500 mL, universal tissue fixative (neutral)
Surgical forceps	HUAYON	18-1300	2.2 mm straight, 12.5 cm wide
Surgical scissors	HUAYON	18-0110	10 cm, stainless steel surgical scissors
Syringe	Kindly	60017031	1 mL, disposable sterile syringe with needle
Tissue cassettes	CITOTEST	80106-1100-16	White; flow-through slots; 0ne-piece integral lid; labeling areas are located on three sides
Tissue-Tek Prisma Plus	SAKURA	DRS-Prisma-P-JCS	The processing capacity is 60 slides at one time
Xylene	Guangdong Guanghua Sci-Tech	1330-20-7	1000 mL, organic solvent