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Resumo

Este artigo descreve um protocolo detalhado para produzir um endométrio fino confiável e reprodutível com uma taxa de mortalidade muito baixa e aderências intrauterinas mínimas, injetando etanol a 95% no útero de camundongo em 1-3 minutos.

Resumo

O endométrio fino (TE) tem sido amplamente reconhecido como uma causa crítica de infertilidade. No entanto, a patogênese do ET permanece obscura e opções de tratamento satisfatórias ainda são urgentemente necessárias. Vários modelos animais de ET foram desenvolvidos, mas o modelo de camundongo envolvendo cirurgia abdominal e injeção de etanol a 95% apresenta um desafio formidável devido à alta taxa de mortalidade e risco de aderências intrauterinas se não for realizado corretamente. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado que produz TE confiável e reprodutível com uma taxa de mortalidade muito baixa e aderências intrauterinas mínimas, injetando etanol a 95% no útero de camundongos com tempos de infusão variados. Os resultados mostraram que todos os camundongos desenvolveram TE com sucesso com tempos de infusão variando de 1 a 3 minutos, caracterizados por uma redução típica na espessura endometrial e no número de glândulas, bem como fibrose endometrial excessiva. Essas descobertas sugerem que este modelo de camundongo é adequado para estudar endométrio fino e pode servir como uma plataforma para o desenvolvimento de futuros tratamentos com TE.

Introdução

O endométrio fino (TE) é uma condição grave em obstetrícia e ginecologia que frequentemente afeta mulheres em idade fértil. O TE é diagnosticado quando a espessura do endométrio mede menos de 7 mm em uma ultrassonografia, acompanhada por uma cavidade uterina normal, e está intimamente associada ao fracasso da gravidez 1,2. Estima-se que aproximadamente 1,5% a 9,1% das mulheres submetidas ao tratamento de fertilização in vitro (FIV) experimentarão TE, tornando-se um desafio crescente na medicina reprodutiva 3,4,5. As causas mais comuns de ET incluem reparo inadequado do endométrio após separação cirúrgica de aderências intrauterinas (AIU) e curetagem, que muitas vezes são acompanhadas por distribuição de vasos sanguíneos interrompida e glândulas esparsas 6,7,8. Até o momento, os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao TE permanecem obscuros. A recuperação do endométrio em pacientes com TE é demorada, embora o tratamento com estrogênio e a terapia com aspirina em baixas doses tenham sido explorados como intervenções potenciais9. Portanto, um estudo aprofundado da patogênese da ET é a abordagem mais direta para enfrentar os desafios dessa condição. No entanto, os estudos sobre a patogênese da ET dependem de modelos animais, tornando crucial a seleção de um modelo apropriado.

A maioria dos estudos histopatológicos do endométrio fino (TE) mostrou que a proliferação prejudicada de células epiteliais e macrófagos, diminuição da expressão de receptores de hormônios esteróides ovarianos, deposição excessiva de matriz extracelular e senescência celular são as características patológicas mais significativas do TE 6,9,10. Atualmente, vários modelos de ratos foram desenvolvidos para mimetizar TE, incluindo modelos induzidos por arranhões 11,12,13, isquemia 14, lesão térmica15 e lesão química16,17,18,19. Um modelo de rato é induzido por coçar o endométrio com uma agulha ou cateter, o que geralmente resulta em aderências intrauterinas (AIU) em vez de TE 11,12,20,21,22. Um modelo de ET induzido por isquemia em ratos também foi relatado, onde a isquemia endometrial é alcançada pela realização de ligadura bilateral da artéria uterina, levando à redução da espessura endometrial. No entanto, esse método é demorado, requer três meses e não é amplamente utilizado para pesquisa14. No modelo induzido por lesão térmica, um tubo de inseminação artificial é usado para infundir água pré-aquecida a 85 °C em um lado do corno uterino através da confluência dos dois lados, tornando-o mais complexo do que outros métodos15. O modelo induzido por produtos químicos envolve a injeção de etanol a 95% no corno uterino exposto para danificar todo o endométrio. Esse modelo oferece as vantagens de baixo custo e curto período experimental para o estudo dos mecanismos patológicos e tratamentos em ET, mas é usado principalmente em ratos e não em camundongos 16,17,23. Embora existam vários modelos animais, especialmente modelos de ratos, cada um tem suas limitações. Eles só podem simular certos aspectos do TE, e poucos modelos de camundongos replicam de perto as características da doença do TE, ao mesmo tempo em que são convenientes e versáteis para pesquisa.

Nesse contexto, desenvolvemos um novo modelo de camundongo de endométrio fino (TE) infundindo etanol a 95% na cavidade uterina usando uma abordagem de gradiente de tempo com um método modificado24 (Figura 1). Os resultados mostraram que todos os camundongos desenvolveram TE com sucesso quando o tempo de infusão variou de 1 a 3 minutos, exibindo características típicas como redução da espessura endometrial, redução da glândula e aumento da fibrose endometrial. Essas descobertas sugerem que nosso modelo de camundongo é uma ferramenta adequada para estudar TE e pode servir como uma plataforma para o desenvolvimento de futuros tratamentos de TE.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital de Obstetrícia e Ginecologia de Shenzhen Zhongshan (antigo Hospital de Urologia de Shenzhen Zhongshan), onde todos os experimentos com animais foram realizados. Camundongos C57BL/6 fêmeas (idade de 6 a 8 semanas, peso de 18 a 20 g) foram usados neste estudo. Todos os animais foram alojados em um ambiente livre de patógenos específicos (FPS) na mesma sala e aclimatados por uma semana antes dos experimentos em uma sala sem patógenos específicos a (22 ± 1) °C sob um ciclo claro/escuro de 12 horas. Eles tiveram acesso gratuito a comida e água. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Identificação do estro

NOTA: A fase estral em camundongos é comparável à fase lútea tardia em humanos, com um revestimento endometrial relativamente espesso neste momento. A seleção de camundongos em estro para indução do modelo garante que eles estejam em um estado fisiológico relativamente consistente. Além disso, os resultados do afinamento endometrial são mais pronunciados quando a espessura endometrial é relativamente espessa. Para detalhes sobre este procedimento, consulte os relatórios publicados anteriormente 25,26.

  1. Prepare 20 μL de solução salina usando uma pipeta. Segurando ambos os lados das orelhas do rato e fixando a cauda do rato, insira suavemente a ponta da pipeta no orifício vaginal a uma profundidade de aproximadamente 2 mm. Infundir 20 μL de solução salina na vagina e lavá-la suavemente por 5 ciclos.
  2. Retire a solução salina e transfira-a uniformemente para uma lâmina limpa. Deixe evaporar e secar naturalmente à temperatura ambiente.
  3. Aplique 30 μL de etanol em cada lâmina para fixar as células. Deixe o etanol evaporar por 5 min até que a lâmina esteja seca.
  4. Aplique 50 μL de solução de coloração violeta cristalina em cada lâmina e core as células em temperatura ambiente por 10 min.
  5. Enxágue cada lâmina com água deionizada para remover o excesso de corante e reduzir manchas inespecíficas.
  6. Observe a morfologia celular e determine a proporção de tipos de células ao microscópio.
  7. Observe os ciclos estrais de camundongos duas vezes consecutivas para garantir a estabilidade. Selecione camundongos no terceiro estro para o experimento.
    NOTA: O ciclo estral em camundongos geralmente dura de 4 a 5 dias e é dividido em quatro estágios: proestro, estro, metestro e diestro. O proestro dura cerca de 24 h e é caracterizado por células epiteliais nucleadas redondas a ovais (Figura 2A). O estro dura entre 12 h e 48 h e é caracterizado por células epiteliais queratinizadas predominantemente anucleadas (Figura 2B). O metaestro dura até 24 h e é caracterizado por uma mistura de células epiteliais queratinizadas anucleadas e neutrófilos (Figura 3C). O diestro dura entre 48 h e 72 h e é caracterizado por uma combinação de neutrófilos, células epiteliais nucleadas e algumas células queratinizadas anucleadas (Figura 2D).

2. Projeto de grupo

NOTA: Para avaliar o impacto de várias durações de infusão de etanol a 95% na estabilidade do modelo TE, seis grupos de tratamento foram estabelecidos. Um grupo foi submetido a cirurgia simulada sem administração de etanol para servir como controle dos efeitos do procedimento. Os camundongos com TE induzido por etanol foram divididos aleatoriamente em cinco grupos de tratamento com base no tempo de infusão (n = 5 por grupo) da seguinte forma:

  1. Grupo de 1 min: Injete etanol na cavidade uterina por 1 min.
  2. Grupo de 2 minutos: Injetar etanol na cavidade uterina por 2 minutos.
  3. Grupo de 3 minutos: Injetar etanol na cavidade uterina por 3 minutos.
  4. Grupo 4 min: Injetar etanol na cavidade uterina por 4 min.
  5. Grupo 5 min: Injetar etanol na cavidade uterina por 5 min.

3. Indução do modelo TE em camundongos

  1. Anestesiar os camundongos usando uma máquina de anestesia com isoflurano a 5% e oxigênio a 100% por 3 min (seguindo um protocolo aprovado institucionalmente). Mantenha a anestesia com isoflurano a 1% -3% usando um cone nasal. Aplique pomada veterinária nos olhos dos camundongos para evitar o ressecamento durante a anestesia. Monitore a frequência respiratória com um beliscão durante todo o procedimento.
  2. Use fita adesiva para prender os membros dos camundongos e mantenha-os em decúbito dorsal na mesa de operação pré-aquecida com um cobertor eletrônico. Puxe suavemente a língua dos camundongos levemente para evitar a obstrução das vias aéreas.
    NOTA: Manter os camundongos aquecidos durante a cirurgia ajuda a manter a função imunológica e a circulação sanguínea e evita a coagulação. Além disso, puxar a língua dos camundongos garante um trato respiratório limpo para evitar asfixia durante a anestesia.
  3. Aplique o creme depilatório animal no abdômen inferior dos camundongos por 3 min. Remova o cabelo com lenços limpos. Desinfete a área com etanol 75% e iodóforo.
  4. Faça uma incisão de 1 cm no abdômen, a 1 cm do orifício uretral. Use tesouras e pinças estéreis para estender a incisão até a cavidade peritoneal.
  5. Mova suavemente as entranhas para o lado com uma pinça estéril para localizar o útero e expor o corno uterino direito. Aplique pinças hemostáticas na extremidade proximal perto do colo do útero e na extremidade distal perto do ovário.
    NOTA: Clampear ambas as extremidades do corno uterino garante que não haja vazamento durante a injeção de etanol, evitando danos ao colo do útero, vagina e ovário.
  6. Instilar aproximadamente 50 μL de etanol27 % a 95% na cavidade uterina usando uma seringa de 25 G, com a agulha paralela à direção do corno uterino. Insira a agulha na cavidade uterina em um ângulo de 30 graus. Mantenha a seringa por 1 min, 2 min, 3 min, 4 min ou 5 min, conforme apropriado. Retire o etanol e lave a cavidade uterina com solução salina estéril 5 vezes para remover o etanol restante. Da mesma forma, instilar um volume igual de solução salina estéril no corno uterino esquerdo como controle, seguindo os mesmos procedimentos.
    NOTA: Certifique-se de que a agulha da seringa esteja paralela à direção do corno uterino. Evite inserir a agulha em um ângulo muito íngreme para evitar que ela atravesse todo o corno uterino. Retirar o etanol o mais completamente possível para evitar danos persistentes e instabilidade experimental.
  7. Remova os grampos e retorne o útero e as entranhas à sua posição original.
  8. Suturar o peritônio com pontos cirúrgicos de poliglicólido absorvível 5-0, seguido de sutura da epiderme com pontos cirúrgicos de poliglicólido não absorvível 5-0.
  9. Desinfete a incisão com etanol 75% e iodóforo e, em seguida, retorne os animais à gaiola. Após a cirurgia, observe atentamente se a frequência cardíaca do camundongo aumenta gradual e constantemente até que o camundongo se recupere totalmente e possa se mover normalmente (Figura 3A-H).
    NOTA: Analgésico oral (3,2 mg/mL de paracetamol na água de beber) foi fornecido no dia anterior à cirurgia e continuou durante o restante do estudo.
  10. Observe os ratos às 9:00 e 15:00 todos os dias e desinfete a incisão com iodóforo para garantir que estejam em boas condições.

4. Coleta de amostras

  1. Eutanasiar os camundongos por luxação da coluna cervical sob anestesia profunda 7 dias após o tratamento com etanol a 95% (seguindo um protocolo aprovado institucionalmente).
  2. Corte as suturas para expor o útero usando uma tesoura cirúrgica.
  3. Extraia cuidadosa e lentamente todo o útero usando uma pinça cirúrgica. Separe o útero das entranhas circundantes.
  4. Remova imediatamente os dois chifres uterinos e divida cada chifre em 3-4 pequenos segmentos.
  5. Adicione 1 mL de paraformaldeído a 4% a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando uma pipeta. Preservar o tecido uterino em paraformaldeído a 4% por 24 h para fixação.

5. Desidratação tecidual

NOTA: A desidratação do tecido é obtida usando um processador automático de tecidos (consulte a Tabela de Materiais).

  1. Coloque as amostras fixadas em formalina em de tecido.
  2. Transfira os de tecido através de uma série de concentrações crescentes de etanol para desidratar o tecido da seguinte forma: etanol 70% por 1 h, etanol 85% por 1 h, etanol 95% duas vezes (1 h cada) e etanol 100% duas vezes (1 h cada).
  3. Substitua o etanol por xileno 100% (135 min para a primeira imersão, 20 min para cada imersão subsequente duas vezes) para garantir que a parafina penetre no tecido.
  4. Mergulhe os de tecido em parafina em uma incubadora a 60-65 ° C (3 vezes, 140 min cada) e mantenha os aquecidos até a incorporação.

6. Incorporação de parafina

NOTA: Execute estas etapas usando um centro modular de incorporação de tecido (consulte a Tabela de Materiais).

  1. Encha um molde de cera com cera de parafina derretida aquecida a 55 °C.
  2. Use uma pinça aquecida para transferir rapidamente os segmentos infiltrados do de incorporação para o molde de cera, garantindo que a seção transversal de cada segmento fique paralela à base do molde.
  3. Uma vez que os segmentos estejam posicionados corretamente, coloque a parte inferior do de incorporação em cima do molde de histologia.
  4. Coloque o molde diretamente em uma placa de resfriamento ajustada para 4 °C por pelo menos 20 min para permitir que a parafina solidifique.
  5. Depois que a cera solidificar, remova a amostra do molde e use um aparador de parafina para aparar o excesso de cera ao redor.

7. Seccionamento de parafina

  1. Preparar um banho-maria a 42 °C. Coloque os blocos de parafina em uma placa fria antes de cortar para permitir que esfriem e se tornem mais fáceis de aparar.
  2. Prenda a amostra embebida em parafina em um micrótomo rotativo com a superfície do tecido voltada para cima.
  3. Secção 20 μm de cada vez para remover o excesso de parafina que cobre o tecido até atingir o plano tecidual desejado.
  4. Corte seções de 4 μm de cada vez.
  5. Transferir a fita seccionada em parafina para o banho-maria quente a 42 °C durante 2 min.
  6. Pegue as seções da superfície da água e coloque-as em uma lâmina de microscópio após o desdobramento.
  7. Seque as lâminas em uma incubadora a 60 °C por 30 min.

8. Coloração de hematoxilina e eosina

NOTA: A coloração de hematoxilina e eosina é realizada usando uma máquina de coloração de lâmina automatizada (consulte a Tabela de Materiais).

  1. Prepare todos os reagentes com antecedência antes de iniciar o procedimento de coloração.
  2. Mergulhe as lâminas em xileno 100% por 10 min, 5 min e 3 min, respectivamente.
  3. Reidrate as lâminas em uma série decrescente de etanol em água deionizada da seguinte forma: etanol 100%, etanol 95% (duas vezes) e etanol 80%, por 2 min cada.
  4. Enxágue as lâminas em água deionizada.
  5. Manchar as lâminas em solução de hematoxilina por 10 min. Enxágue as lâminas em água deionizada por 1 min ou até que a água não fique mais roxa.
  6. Mergulhe as lâminas em solução de diferenciação de etanol ácido a 0,5% duas vezes por 3-5 s de cada vez. Enxágue as lâminas em água deionizada por 1 min.
  7. Coloque as lâminas em um tampão azulado (solução de amônia a 1%) por 1 min. Enxágue as lâminas em água deionizada por 1 min.
  8. Desidrate as lâminas com etanol a 80% e mergulhe-as em uma solução de trabalho de eosina Y por 10 s.
  9. Transfira as lâminas para etanol a 95% e enxágue duas vezes por 10 s cada. Em seguida, transferir as lâminas para etanol absoluto e desidratá-las duas vezes por 10 s cada.
  10. Mergulhe as lâminas em xileno 100% para limpar o tecido duas vezes, por 2 min cada.
  11. Coloque uma lamínula sobre o tecido e sele-o com resina natural.

9. Coloração de Masson

  1. Desparafinize o tecido embebendo as lâminas em xileno 100% por 10 min, 5 min e 3 min, respectivamente.
  2. Após a desparafinização, embeber as lâminas numa série decrescente de etanol em água desionizada: etanol 100%, etanol 95% (duas vezes) e etanol 80%, durante 2 min cada.
  3. Enxágue as lâminas em água deionizada.
  4. Pinte as lâminas na solução de hematoxilina de ferro de Weigert por 5 min e, em seguida, lave as lâminas em água deionizada por 30 s.
  5. Diferencie as cores das estruturas do tecido corado incubando as lâminas em álcool ácido clorídrico a 1% por 15 s.
  6. Enxágue as lâminas em água deionizada por 30 s.
  7. Incube o tecido em uma solução azulada por 3-5 min.
  8. Enxágue as lâminas em água deionizada por 30 s.
  9. Coloque as lâminas na solução de fucsina ácida de Ponceau por 5-10 min.
    NOTA: Misture água deionizada e solução de ácido fraco na proporção de 2:1 para preparar a solução de trabalho de ácido fraco.
  10. Enxágue as lâminas com a solução de trabalho de ácido fraco por 30 s.
  11. Diferencie o tecido na solução de ácido fosfomolíbdico por 1-2 min e, em seguida, enxágue as seções com uma solução de trabalho de ácido fraco por 30 s.
  12. Pinte as seções de tecido com solução de azul de anilina por 1-2 min.
  13. Desidrate as seções de tecido rapidamente em etanol a 95% por 2-3 s, seguido de etanol a 100% duas vezes por 5-10 s cada. Limpe as lâminas em xileno duas vezes, por 1-2 min cada.
  14. Coloque uma lamínula sobre o tecido e sele-o com resina natural.
  15. Drene o excesso de resina e deixe as lâminas secarem.

10. Imagem e análise

  1. Capture imagens das seções usando um sistema de scanner de slides.
    NOTA: Use uma objetiva de 4x ou 10x para uma visão geral das seções; Para imagens mais detalhadas, use objetivas de 20x a 100x.
  2. Realize análises quantitativas da espessura endometrial, do número de glândulas e da extensão da fibrose tecidual usando a plataforma de análise de imagens HALO.
    NOTA: A espessura média é obtida medindo a distância vertical da cavidade uterina ao miométrio em 5 campos de visão selecionados aleatoriamente.

11. Análises estatísticas

  1. Realizar análises estatísticas usando o SPSS versão 23.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).
  2. Avalie a significância estatística das diferenças experimentais entre os grupos controle e modelo realizando primeiro um teste de distribuição normal.
  3. Apresente dados que normalmente são distribuídos como média ± SEM.
  4. Analise dados de diferentes grupos de tratamento usando ANOVA unidirecional. Ajuste para comparações múltiplas do número de alelos testados em cada locus usando o método de Bonferroni. Considere um valor de P <0,05 como estatisticamente significativo.

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Resultados

As principais características do endométrio fino (TE) são a diminuição da espessura endometrial e da densidade glandular, juntamente com o aumento da fibrose endometrial. Este método replicou com sucesso essas características nos camundongos modelo. A análise dos dados revelou uma diminuição significativa na espessura endometrial no grupo de 1 minuto (222,3 μm ± 13,96 μm vs. 359,2 μm ± 12,41 μm, P < 0,05), no grupo de 2 minutos (168,7 μm ± 17,57 μm

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Discussão

O ET é caracterizado por proliferação celular insuficiente e células disfuncionais, intimamente ligadas à infertilidade, aborto espontâneo recorrente e anormalidades placentárias 2,3. Infelizmente, atualmente não existe terapia eficaz para TE. Os modelos animais desempenham um papel crucial no estudo dessa condição. Entre 2014 e 2024, ratos foram usados como organismos modelo em 16,4% de 208.000 estudos (34.200 estudos)...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos aos revisores anônimos por seus comentários importantes e úteis. Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Ciência e Tecnologia de Shenzhen (No. JCYJ20220818103207016) e a Fundação de Pesquisa Básica e Aplicada de Guangdong (nº 2024A1515010478).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthesia MachineRWD Life ScienceR530Mobile inhalation anesthesia machine for small animals
0.9% salineHubei Kelun Pharmaceutical C230817A210 mL, medical injection
75% ethanolLIRCON6303060031500 mL, disinfectant reagent
95% ethanolGuangzhou Chemical Reagent Factory64-17-5500 mL, chemical reagent
Absorbable suturesJinhuan MedicalCR537Thickness: 5-0; Length: 90 cm
Aqueous ammoniaMilliporeSigma1336-21-61000 mL, chemical reagent
Automatic Tissue ProcessorLeicaTP1020100 embedding boxes can be processed at one time
C57BL/6 mice Experimental Animal Center of Southern Medical University 
Eosin-YBASOBA40241000 mL, used for the staining of paraffin sections, frozen sections, etc
HaematoxylinBASOBA40411000 mL, used for the staining of paraffin sections, frozen sections, etc
HALO Image Analysis PlatformIndica labsThe instrument features ease-of-use and scalability, powerful analytical capabilities, and the fastest processing speed
Hemostatic clampsHUAYON18-50211.8 cm in total length with 0.7 cm jaw
Hemostatic forcepsHUAYON18-502010 cm in total length
HistoCore Rotary MicrotomeLeica149BIO000C1Slice thickness ranges from 1 to 60 μm
IndorphorADF1005500 mL, disinfectant reagent
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22-10100 mL, active ingredient 100% isoflurane
Masson's trichrome stainingSOLARBIOG13407 × 100 mL for 100 tests
Microscope slideGene TechGT100511Length: 75 cm; Width: 25 cm
Modular Tissue Embedding CenterLeicaEG1150 CThe instrument contains a cold stage and a heated paraffin distribution module, providing flexibility for the embedding work
Natural resinSAKURA4770Resin-coated film, Suitable for histology staining
Olympus SLIDEVIEW VS200PANOVUEVS200The instrument captures high-quality virtual slide images and enables advanced quantitative image analysis 
Paraformaldehyde fix solutionServicebioG1011500 mL, universal tissue fixative (neutral)
Surgical forcepsHUAYON18-13002.2 mm straight, 12.5 cm wide
Surgical scissorsHUAYON18-011010 cm, stainless steel surgical scissors
SyringeKindly600170311 mL, disposable sterile syringe with needle
Tissue cassettesCITOTEST80106-1100-16White; flow-through slots; 0ne-piece integral lid; labeling areas are located on three sides
Tissue-Tek Prisma PlusSAKURADRS-Prisma-P-JCSThe processing capacity is 60 slides at one time
XyleneGuangdong Guanghua Sci-Tech1330-20-71000 mL, organic solvent

Referências

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